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        秀麗隱桿線蟲(chóng)-泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型用于外排泵抑制劑逆轉(zhuǎn)環(huán)丙沙星耐藥的研究

        2017-12-06 22:51:40段欣冉姜志輝楊相海
        中國(guó)感染控制雜志 2017年12期
        關(guān)鍵詞:隱桿環(huán)丙沙星維拉

        段欣冉,姜志輝,楊相海,李 健

        (1 廣東藥科大學(xué),廣東 廣州 510000; 2 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院,廣東 廣州 510000; 3 長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410000)

        ·論著·

        秀麗隱桿線蟲(chóng)-泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型用于外排泵抑制劑逆轉(zhuǎn)環(huán)丙沙星耐藥的研究

        段欣冉1,2,姜志輝2,楊相海3,李 健1,2

        (1 廣東藥科大學(xué),廣東 廣州 510000; 2 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院,廣東 廣州 510000; 3 長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410000)

        目的建立秀麗隱桿線蟲(chóng)-泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型,用于外排泵抑制劑(EPIs)逆轉(zhuǎn)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(XDR-AB)對(duì)于環(huán)丙沙星耐藥的研究。方法建立秀麗隱桿線蟲(chóng)-泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型,選用6種EPIs(CCCP、PAβN、NMP、奧美拉唑、利血平和維拉帕米)與氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星聯(lián)合使用,記錄秀麗隱桿線蟲(chóng)生存率以評(píng)價(jià)體內(nèi)藥效,同時(shí)進(jìn)行毒性試驗(yàn)及體外藥敏試驗(yàn)。結(jié)果不同濃度XDR-AB對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的致死情況不同,選擇5×106CFU/mL作為XDR-AB感染秀麗隱桿線蟲(chóng)濃度。秀麗隱桿線蟲(chóng)生存實(shí)驗(yàn)顯示,XDR-AB感染線蟲(chóng)3 h后線蟲(chóng)組與加入多粘菌素B的對(duì)照組生存曲線比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.154,P>0.05),感染線蟲(chóng)6、9 h,與對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001),但感染6 h與9 h組的生存曲線比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.669,P>0.05),最終選擇6 h作為感染時(shí)長(zhǎng),36 h為合適的抗菌藥物治療時(shí)長(zhǎng)。環(huán)丙沙星聯(lián)合EPIs應(yīng)用于感染模型實(shí)驗(yàn)中,低濃度的PAβN、NMP、奧美拉唑、利血平可將線蟲(chóng)存活率分別提高30%~40%、15%~20%、20%~30%、20%,高濃度的維拉帕米可將感染線蟲(chóng)的存活率提高30%左右。體外藥敏試驗(yàn)和毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示,環(huán)丙沙星分別與CCCP、奧美拉唑和維拉帕米聯(lián)合可降低MIC至原來(lái)的1/4,分別聯(lián)合PAβN,NMP和利血平可降低MIC至原來(lái)的1/2,其中CCCP體外聯(lián)合抑菌效果最佳,但毒性較大不適于體內(nèi)藥效研究。結(jié)論首次成功構(gòu)建了秀麗隱桿線蟲(chóng)-泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型,得到6種EPIs逆轉(zhuǎn)環(huán)丙沙星耐藥性的初步研究。

        鮑曼不動(dòng)桿菌;秀麗隱桿線蟲(chóng);外排泵抑制劑;環(huán)丙沙星

        鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)是一類非發(fā)酵型革蘭陰性桿菌,廣泛存在于自然界和醫(yī)院環(huán)境中,是引起醫(yī)院感染最常見(jiàn)的條件致病菌之一[1]。 鮑曼不動(dòng)桿菌可引起包括呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染、菌血癥、傷口感染、腦膜炎和呼吸機(jī)相關(guān)肺炎等多種感染性疾病。隨著抗菌藥物在臨床中的廣泛使用,該菌對(duì)常用抗菌藥物產(chǎn)生了極大的耐藥性,甚至出現(xiàn)了多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(MDR-AB)和廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(extensively drug-resistantAcinetobacterbaumannii,XDR-AB),給臨床治療帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)[2]。

        鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性是通過(guò)多種耐藥機(jī)制介導(dǎo)的,其中細(xì)菌主動(dòng)外排泵的過(guò)度表達(dá)可使抗菌藥物不能在細(xì)胞內(nèi)蓄積達(dá)到作用濃度,是產(chǎn)生耐藥的一個(gè)重要原因。在不動(dòng)桿菌屬中,耐藥-結(jié)節(jié)-分化(resistance-nodulation-division,RND)家族對(duì)細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生有重要作用,其中AdeABC、AdeIJK、AdeFGH外排系統(tǒng)主要存在于鮑曼不動(dòng)桿菌,可外排多種抗菌藥物,如喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素、紅霉素等引起耐藥[3-4]。喹諾酮類藥物如環(huán)丙沙星,曾作為治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的一線藥物,但由于鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)其產(chǎn)生了廣泛的耐藥,導(dǎo)致臨床已基本摒棄用環(huán)丙沙星治療耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染。鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥機(jī)制主要是外排泵的過(guò)度表達(dá),環(huán)丙沙星合用外排泵抑制劑(efflux pump inhibitors,EPIs)使其重新對(duì)耐藥菌株發(fā)揮作用,已成為治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的潛在有效途徑[5-6]。目前,關(guān)于EPIs的研究多局限于體外實(shí)驗(yàn)。不同的EPIs在體內(nèi)是否能逆轉(zhuǎn)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性達(dá)到較好的抑菌效果,是否會(huì)產(chǎn)生較大的毒性影響其使用,是目前EPIs應(yīng)用的主要問(wèn)題。秀麗隱桿線蟲(chóng)全身透明易于觀察,培養(yǎng)成本低,可操控性強(qiáng),具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遺傳背景清晰、生命周期短等特點(diǎn)。研究[7-8]發(fā)現(xiàn),線蟲(chóng)有約40%的基因與人類疾病具有明確的同源基因,已成為現(xiàn)代發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、基因組學(xué)研究的重要模式生物,在病原菌中的研究也越來(lái)越廣泛。通過(guò)建立秀麗隱桿線蟲(chóng)-泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型,將環(huán)丙沙星聯(lián)合多種EPIs應(yīng)用于模型中,篩選對(duì)XDR-AB有效的組合藥物,為XDR-AB的治療提供新方法和思路。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 線蟲(chóng)和菌種 秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegansglp-4;sek-1)、大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)OP50由中山大學(xué)藥學(xué)院陳纘光教授惠贈(zèng),質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922,臨床分離的XDR-AB由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院檢驗(yàn)科提供,采用法國(guó)生物梅里埃公司VITEK 2微生物全自動(dòng)鑒定藥敏儀鑒定。

        1.1.2 藥物 CCCP(carbonyl cyanide 3-chlorophenyl hydrazone)、PAβN(phenyl-arginine-β-naphthylamide)、多粘菌素B(polymyxin B)、萘啶酸(nalidixic acid)、維拉帕米(verapamil)、利血平(reserpine)、奧美拉唑(omeprazole)均購(gòu)自美國(guó)Sigma化學(xué)試劑公司。NMP[1-(1-naphthylmethyl)-piperazine]、環(huán)丙沙星鹽酸鹽(ciprofloxacin hydrochloride monohydrate)購(gòu)自阿拉丁試劑公司。熒光探針Dil(1,1-雙十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚二碳菁)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

        1.1.3 培養(yǎng)基 LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基:LB粉4.2 g,瓊脂粉3 g,加蒸餾水200 mL,121℃高壓蒸汽滅菌15 min后4 ℃保存?zhèn)溆?。E.coli OP50:將E.coli OP50接種至LB固體培養(yǎng)基上,于37 ℃二氧化碳溫箱中孵育24 h。NGM(nematode growth medium)培養(yǎng)基:胰蛋白胨1.5 g,瓊脂粉10.8 g,NaCl 1.80 g,加蒸餾水585 mL后121℃高壓蒸汽滅菌15 min,待溫度降低至60℃以下時(shí),加入濾過(guò)除菌5 mg/mL的膽固醇660 μL,1 mol/L的CaCl2660 μL,1 mol/L的MgSO4660 μL,并加入磷酸緩沖液(K2HPO4和KH2PO4) 13 mL,分裝至直徑9 cm的培養(yǎng)皿中,待平板冷卻凝固后,取E.coli OP50單個(gè)菌落涂布于培養(yǎng)基上,37℃孵育24 h后,4℃保存?zhèn)溆谩?0%BHI液體培養(yǎng)基(brain-heart infusion medium):4.83 g Na2HPO4·12H2O,0.96 g KH2PO4,1.60 g NaCl,0.04 g MgSO4,2.96 g BHI,10 μmol/L FeCl3,加蒸餾水至400 mL,121℃高壓蒸汽滅菌15 min,待溫度降低至60℃以下時(shí),加入萘啶酸使其終濃度為5 μg/mL,于4℃保存?zhèn)溆谩AMHB培養(yǎng)基:6.6 g CAMHB,加入300 mL蒸餾水121℃高壓蒸汽滅菌15 min,于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.1.4 緩沖液及試劑 M9緩沖液:3.02 g Na2HPO4·12H2O,0.6 g KH2PO4,1 g NaCl,0.024 g MgSO4,加入蒸餾水200 mL,121℃高壓蒸汽滅菌15 min 后備用;線蟲(chóng)裂解液:0.4 g NaOH,2 mL HClO溶液,4 mL 蒸餾水,現(xiàn)用現(xiàn)配。

        1.1.5 設(shè)備 Leica DMI 4000型熒光顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)上海貿(mào)易有限公司),WSI-3000倒置生物顯微鏡(廣州微域光學(xué)儀器有限公司),SW-CJ-1F型凈化工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司),DHP-9012型恒溫培養(yǎng)箱、LRH-70生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 線蟲(chóng)的培養(yǎng)和同期化處理 選用glp-4、sek-1基因缺陷型線蟲(chóng),相較N2野生型線蟲(chóng),其在25℃下不能產(chǎn)卵,且具有免疫缺陷性[9]。線蟲(chóng)按照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行培養(yǎng)[7]。線蟲(chóng)感染實(shí)驗(yàn)前4 d準(zhǔn)備同步化的線蟲(chóng):將線蟲(chóng)用M9緩沖液從NGM板上洗下收集至15 mL離心管,500 r/min離心1 min,取上清液至剩余3.5 mL的線蟲(chóng)液,加2.5 mL的裂解液充分振搖3 min,加M9緩沖液至15 mL,1 500 r/min離心1 min,洗滌5次,分離得到蟲(chóng)卵,15℃振蕩16 h蟲(chóng)卵孵化至L1期的線蟲(chóng),將其置于NGM平板的E.coli OP50菌苔上,25℃培養(yǎng)48 h,得到同步化的L4期線蟲(chóng)[8]。

        1.2.2 菌懸液的制備 將凍存在-80℃的XDR-AB菌株復(fù)蘇,劃線培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h 備用。

        1.2.3 線蟲(chóng)-泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型的建立 從細(xì)菌平板上取XDR-AB單個(gè)菌落,于20%BHI中使用光度比濁儀調(diào)整菌濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?約為1.5×108CFU/mL),將同步化后培養(yǎng)至L4期的線蟲(chóng)從平板上洗下,離心(500 r/min,1 min),重復(fù)2~3次,將線蟲(chóng)懸浮于終濃度為5×106CFU/mL的XDR-AB中感染6 h后,用BHI液體培養(yǎng)基清洗至少3次,將線蟲(chóng)分配置96孔板中,15~20條/孔加至180 μL,治療組加20 μL的待測(cè)藥物(溶于1%DMSO),陽(yáng)性對(duì)照組加入2 μg/mL的多粘菌素B(PB) 20 μL(溶于1%DMSO),陰性對(duì)照組加入1%DMSO 20 μL,于25℃、濕度為85%的條件下培養(yǎng)30 h,在顯微鏡下觀察線蟲(chóng)存活率。

        1.2.4 EPIs的毒性試驗(yàn) 用20%BHI液體培養(yǎng)基將同步化培養(yǎng)至L4期的線蟲(chóng)洗至15 mL離心管中,500 r/min,1 min清洗3次,15~20條/孔分裝至96孔板中至180 μL,分別加系列濃度的EPIs:CCCP、PAβN(分別為5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL),NMP、奧美拉唑、維拉帕米、利血平(分別為10、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL)20 μL,于25℃濕度為85%的條件下非共培養(yǎng)30 h,在顯微鏡下觀察線蟲(chóng)存活率,判斷各EPIs對(duì)正常線蟲(chóng)的毒性作用。

        1.2.5 抗菌藥物環(huán)丙沙星及各EPIs的體外藥敏試驗(yàn) 微量肉湯稀釋法測(cè)定鹽酸環(huán)丙沙星最小抑菌濃度(MIC)。以大腸埃希菌ATCC 25922,鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606作為質(zhì)控菌株同批進(jìn)行測(cè)試。配制5 120 μg/mL的鹽酸環(huán)丙沙星儲(chǔ)備液,取13支無(wú)菌試管,用CAMHB培養(yǎng)基配制系列濃度的鹽酸環(huán)丙沙星512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL,各取100 μL于96孔板中;使用光度比濁儀,取新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌菌落,調(diào)整菌懸液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?00 μL加入各孔使菌終濃度為5×106CFU/mL,各孔抗菌藥物濃度為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/mL,置于35℃孵箱中孵育16~20 h,結(jié)果評(píng)定依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)標(biāo)準(zhǔn),單位為μg/mL。測(cè)定各EPIs的MIC值以及鹽酸環(huán)丙沙星加入EPIs后的MIC值,依據(jù)毒性試驗(yàn)結(jié)果分別加入各EPIs,并比較加入EPIs前后菌株對(duì)抗菌藥物MIC值的變化。

        1.2.6 抗菌藥物鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合不同的EPIs對(duì)感染線蟲(chóng)的藥效 將同步化的線蟲(chóng)按照所建立感染模型通過(guò)非共培養(yǎng)得到感染線蟲(chóng),聯(lián)合用藥治療感染線蟲(chóng),藥物濃度確定在安全范圍內(nèi),設(shè)置高中低3組藥物濃度,30 h后觀察線蟲(chóng)的存活率,判斷不同EPIs在不同藥物濃度下聯(lián)合鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)感染線蟲(chóng)的體內(nèi)治療作用。感染實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3次,同時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)和陰性對(duì)照試驗(yàn)。

        1.2.7 細(xì)菌感染路徑示蹤 為追蹤鮑曼不動(dòng)桿菌的感染路徑,本試驗(yàn)將細(xì)菌標(biāo)記上一種細(xì)胞膜紅色熒光探針Dil。將細(xì)菌懸浮在2 mL的M9溶液中,添加1 μL Dil儲(chǔ)備液,用錫紙避光,在25℃孵育3 h,清洗細(xì)菌至少3次后調(diào)整細(xì)菌濃度為5×106CFU/mL的懸浮液去感染線蟲(chóng)6 h。最終感染后的線蟲(chóng)用M9溶液清洗直至上清液完全無(wú)色為止,用熒光顯微鏡觀察細(xì)菌的熒光強(qiáng)度。

        1.3 統(tǒng)計(jì)分析 使用GraphPad Prism 5軟件對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析,Log-rank (Mantel-Cox) Test方法對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,組間兩因素方差分析用Two-way ANOVA檢驗(yàn)分析,P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 線蟲(chóng)-泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型成功建立

        2.1.1 不同的液體培養(yǎng)基中不同XDR-AB濃度對(duì)線蟲(chóng)感染模型的影響 采用不同濃度的XDR-AB(5×108、5×107、5×106、5×105CFU/mL,E.coli OP50對(duì)照組)在不同的液體培養(yǎng)基(10%BHI、20%BHI)中感染秀麗隱桿線蟲(chóng),記錄線蟲(chóng)的生存狀態(tài),確定合適的感染條件。在液體培養(yǎng)基中,存活線蟲(chóng)呈現(xiàn)正弦狀態(tài),或咽部肌肉不停泵動(dòng),在光線和機(jī)械刺激時(shí)可以自由活動(dòng),而XDR-AB感染死亡的線蟲(chóng)呈直線型僵直狀態(tài),有些身體過(guò)于腫脹而使得陰戶突出,有些已被細(xì)菌侵蝕嚴(yán)重的線蟲(chóng)明顯喪失身體結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1),死線蟲(chóng)和活線蟲(chóng)具有明顯的外觀差異,方便實(shí)驗(yàn)定量計(jì)算。

        A:正常存活狀態(tài)秀麗隱桿線蟲(chóng);B:秀麗隱桿線蟲(chóng)與鮑曼不動(dòng)桿菌共孵育30 h后感染致死的秀麗隱桿線蟲(chóng)

        圖1熒光顯微鏡下觀察存活狀態(tài)和死亡狀態(tài)的秀麗隱桿線蟲(chóng)

        Figure1Fluorescence microscopic observation of survival and death status ofC.elegans

        為確定在液體培養(yǎng)基中秀麗隱桿線蟲(chóng)的致死是由于鮑曼不動(dòng)桿菌在線蟲(chóng)體內(nèi)的積聚,將線蟲(chóng)在含鮑曼不動(dòng)桿菌的20%BHI-M9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h,顯微鏡下觀察,線蟲(chóng)的整個(gè)腸道明顯膨脹。為進(jìn)一步證實(shí)線蟲(chóng)腸道的膨脹是由于鮑曼不動(dòng)桿菌的定植,本實(shí)驗(yàn)用Dil細(xì)胞膜紅色熒光探針標(biāo)記鮑曼不動(dòng)桿菌,追蹤鮑曼不動(dòng)桿菌可能的感染路徑。將線蟲(chóng)置于含熒光標(biāo)記細(xì)菌的20%BHI-M9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h,在熒光顯微鏡下觀察,可觀察到喂食了鮑曼不動(dòng)桿菌的線蟲(chóng)整個(gè)腸道明顯膨大,并充滿了強(qiáng)烈的熒光細(xì)菌。見(jiàn)圖2。

        注:XDR-AB與Dil細(xì)胞膜紅色熒光探針共培養(yǎng)3 h后感染秀麗隱桿線蟲(chóng)6 h,40倍熒光顯微鏡下觀察秀麗隱桿線蟲(chóng)腸道充滿強(qiáng)烈熒光細(xì)菌

        圖2熒光顯微鏡下觀察Dil細(xì)胞膜紅色熒光探針標(biāo)記XDR-AB感染秀麗隱桿線蟲(chóng)

        Figure2Fluorescence microscopic observation of XDR-AB-infectedC.eleganslabeled by Dil red fluorescent probe

        選擇10%BHI的液體培養(yǎng)基時(shí),即使最高濃度的XDR-AB也無(wú)法成功感染線蟲(chóng),線蟲(chóng)僵直一段時(shí)間后可重新蠕動(dòng);選擇20%BHI液體培養(yǎng)基時(shí),可觀察到隨著細(xì)菌濃度的降低,線蟲(chóng)存活時(shí)間有所延長(zhǎng)(見(jiàn)圖3)。線蟲(chóng)在不同濃度XDR-AB感染下的半數(shù)致死時(shí)長(zhǎng)(time for half to die,LT50)明顯不同,5×108CFU/mL XDR-AB感染時(shí)LT50為12 h,5×107CFU/mL XDR-AB感染時(shí)LT50為18 h,5×106CFU/mL XDR-AB感染時(shí)LT50為30 h,在5×105CFU/mL XDR-AB感染時(shí)LT50為42 h。根據(jù)不同濃度XDR-AB的致病力以及不同濃度XDR-AB對(duì)試驗(yàn)進(jìn)度的影響,最終選取5×106CFU/mL XDR-AB作為感染濃度。

        圖3 不同濃度XDR-AB對(duì)感染秀麗隱桿線蟲(chóng)生存曲線

        Figure3Survival curves ofC.elegansinfected with different concentrations of XDR-AB

        2.1.2 不同感染時(shí)長(zhǎng)及藥物干預(yù)時(shí)長(zhǎng)對(duì)線蟲(chóng)感染模型的影響 感染時(shí)長(zhǎng)和加入抗菌藥物的治療時(shí)長(zhǎng)是影響線蟲(chóng)生存率的關(guān)鍵因素,為確定最佳感染時(shí)長(zhǎng)和治療時(shí)長(zhǎng),設(shè)計(jì)線蟲(chóng)的感染時(shí)長(zhǎng)分別為3、6和9 h,清洗后在陽(yáng)性對(duì)照孔加入PB,觀察最佳的治療時(shí)長(zhǎng)(見(jiàn)圖4)。Log-rank Test顯示,當(dāng)感染3 h時(shí),秀麗隱桿線蟲(chóng)幾乎可以正常生存,沒(méi)有達(dá)到較好的感染效果(χ2=3.154,P>0.05);當(dāng)秀麗隱桿線蟲(chóng)分別被感染6、9 h時(shí),對(duì)線蟲(chóng)生存率的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.669,P>0.05),結(jié)合XDR-AB不同感染時(shí)長(zhǎng)對(duì)線蟲(chóng)的致死能力和對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)度的影響,最終選擇6 h作為感染時(shí)長(zhǎng),同時(shí)選擇36 h作為抗菌藥物的藥物干預(yù)時(shí)長(zhǎng),此時(shí)加入PB的陽(yáng)性孔秀麗隱桿線蟲(chóng)生存良好,而陰性孔秀麗隱桿線蟲(chóng)基本已全部感染致死。

        2.2 6種EPIs對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的毒性作用 CCCP、NMP、PAβN、奧美拉唑,維拉帕米,利血平6種EPIs對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的毒性作用不同,其中當(dāng)CCCP的濃度>5 μg/mL、PAβN的濃度>25 μg/mL和利血平的濃度>30 μg/mL時(shí),對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)開(kāi)始出現(xiàn)明顯的毒性作用,秀麗隱桿線蟲(chóng)生存率開(kāi)始下降。見(jiàn)圖5。奧美拉唑、維拉帕米和NMP對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)幾乎都沒(méi)有毒性作用,當(dāng)濃度>60 μg/mL時(shí)秀麗隱桿線蟲(chóng)生存活躍狀態(tài)下降,濃度達(dá)80 μg/mL對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)生存率也沒(méi)有影響。

        圖4 XDR-AB不同感染時(shí)長(zhǎng)與治療時(shí)長(zhǎng)生存曲線

        Figure4Survival curves ofC.eleganswith different duration of XDR-AB infection and duration of treatment

        A :CCCP、PAβN對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的毒性試驗(yàn);B: NMP、利血平、奧美拉唑和維拉帕米對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的毒性試驗(yàn)

        圖5不同EPIs對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的毒性試驗(yàn)

        Figure5Toxicity test of different EPIs onC.elegans

        2.3 聯(lián)合EPI前后抗菌藥物鹽酸環(huán)丙沙星的MIC值變化 單獨(dú)使用鹽酸環(huán)丙沙星時(shí),MIC值達(dá)256 μg/mL;單獨(dú)使用CCCP、PAβN時(shí),MIC值為15、30 μg/mL,單獨(dú)使用NMP、奧美拉唑、維拉帕米和利血平時(shí)對(duì)XDR-AB沒(méi)有明顯的抑菌作用。加入CCCP、奧美拉唑、維拉帕米后,鹽酸環(huán)丙沙星的MIC值均下降至原來(lái)的1/4(64 μg/mL);加入PAβN,NMP、利血平后,鹽酸環(huán)丙沙星的MIC值均下降至原來(lái)的1/2(128 μg/mL)。

        2.4 鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合EPIs前后感染線蟲(chóng)的體內(nèi)藥效評(píng)價(jià) 加入治療藥物30 h后,不同濃度EPIs聯(lián)合相應(yīng)濃度的鹽酸環(huán)丙沙星:除CCCP外,聯(lián)合治療效果均好于環(huán)丙沙星單用的效果。見(jiàn)圖6。其中5、2.5、1 μg/mL的CCCP聯(lián)合鹽酸環(huán)丙沙星,效果均不理想,秀麗隱桿線蟲(chóng)存活率幾乎為零。PAβN與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合后能提高鹽酸環(huán)丙沙星在感染秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)的治療作用,其中不同濃度的PAβN對(duì)聯(lián)合效果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),PAβN較低濃度時(shí)與鹽酸環(huán)丙沙星有較好的聯(lián)合作用(P<0.001),比單獨(dú)使用鹽酸環(huán)丙沙星時(shí)感染秀麗隱桿線蟲(chóng)的存活率可提高30%~40%。不同濃度間的奧美拉唑聯(lián)合鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)感染秀麗隱桿線蟲(chóng)的治療效果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001),其中低濃度的奧美拉唑聯(lián)合治療效果更好(P<0.001),比單獨(dú)使用鹽酸環(huán)丙沙星時(shí)感染秀麗隱桿線蟲(chóng)的存活率可提高20%~30%。不同濃度的NMP、利血平與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合治療感染秀麗隱桿線蟲(chóng)時(shí),聯(lián)合效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),為減少藥物濃度與EPIs聯(lián)合使用帶來(lái)潛在的毒性,選擇低濃度NMP(20 μg/mL)與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合使用,感染秀麗隱桿線蟲(chóng)經(jīng)治療后存活率比單一用藥提高15%~20%(P<0.001);低濃度的利血平(10 μg/mL)與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合使用后,感染秀麗隱桿線蟲(chóng)經(jīng)治療后存活率比單一用藥提高20%(P<0.001)。不同濃度的維拉帕米與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合使用時(shí),高濃度維拉帕米的治療作用較好(P<0.001),高濃度的維拉帕米(60 μg/mL)與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合使用后,感染秀麗隱桿線蟲(chóng)的生存率能提高30%左右。

        注:A—F分別為CCCP、PAβN、奧美拉唑、NMP、利血平和維拉帕米;CIP:鹽酸環(huán)丙沙星; ***: 各EPI與對(duì)照組比較,P<0.001

        Figure6Pharmacodynamic effect of combination of 6 different concentrations of EPIs and ciprofloxacin hydrochloride on treatment of XDR-AB infection inC.elegans

        3 討論

        本研究成功建立了低成本、高效率的秀麗隱桿線蟲(chóng)-泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型,用于評(píng)價(jià)抗菌藥物藥效的可靠性和穩(wěn)定性。相比傳統(tǒng)固體瓊脂平板上的試驗(yàn),極大簡(jiǎn)化了線蟲(chóng)在不同培養(yǎng)板上反復(fù)接種、清洗和轉(zhuǎn)移等試驗(yàn)程序,探究鹽酸環(huán)丙沙星與EPIs合用時(shí)在線蟲(chóng)模型上的治療窗,為研究時(shí)選取安全有效的藥物及藥物濃度提供依據(jù),也為之后篩選與研究其他抗菌藥物提供依據(jù)。

        線蟲(chóng)感染程度是模型成功建立的重要條件之一,本試驗(yàn)根據(jù)不同濃度下XDR-AB對(duì)線蟲(chóng)的感染致死時(shí)間及效果,最終確定5×106CFU/mL作為感染濃度, 結(jié)合鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)線蟲(chóng)的致死能力和試驗(yàn)進(jìn)度的影響,最終選擇6 h作為感染時(shí)長(zhǎng),選擇36 h作為抗菌藥物的藥物干預(yù)時(shí)長(zhǎng),初步建立XDR-AB感染秀麗隱桿線蟲(chóng)的感染模型。在鮑曼不動(dòng)桿菌感染路徑的追蹤實(shí)驗(yàn)中,可觀察到XDR-AB在腸道積聚定植,并可在腸道內(nèi)擴(kuò)散,使線蟲(chóng)整個(gè)生命過(guò)程持續(xù)感染,造成線蟲(chóng)感染致死。

        對(duì)6種EPI進(jìn)行毒性試驗(yàn),體外藥物敏感性試驗(yàn)測(cè)得所有藥物的MIC值,得到環(huán)丙沙星及各EPIs對(duì)XDR-AB單獨(dú)使用和聯(lián)合使用時(shí)的體外抑菌效果,與體內(nèi)抗菌效果形成對(duì)比,進(jìn)一步研究治療效果。CCCP是一種抑制細(xì)菌細(xì)胞膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的強(qiáng)解偶聯(lián)劑[6, 10],CCCP在體外的抑菌效果最佳,但進(jìn)行體內(nèi)秀麗隱桿線蟲(chóng)感染試驗(yàn)后,CCCP與鹽酸環(huán)丙沙星聯(lián)合使用時(shí)秀麗隱桿線蟲(chóng)幾乎無(wú)存活,考慮可能是因?yàn)槁?lián)合使用加重了CCCP的藥物毒性,加速秀麗隱桿線蟲(chóng)死亡。PAβN 通過(guò)結(jié)合外排泵相應(yīng)位點(diǎn),阻止其他底物與該位點(diǎn)的結(jié)合,減少藥物的外排[11-12]。35 μg/mL的PAβN可將鹽酸環(huán)丙沙星的MIC值降低至0.5 μg/mL,安全范圍內(nèi)可將鹽酸環(huán)丙沙星的MIC值降低至原來(lái)的1/2,秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)模型篩選后,得到較低濃度PAβN(5 μg/mL)聯(lián)合鹽酸環(huán)丙沙星治療后可將秀麗隱桿線蟲(chóng)存活率提高30%~40%,對(duì)鹽酸環(huán)丙沙星的耐藥性有較好的翻轉(zhuǎn)效果。奧美拉唑是質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors,PPIs)的一種,臨床上用于消化性潰瘍的治療,安全范圍內(nèi)可將鹽酸環(huán)丙沙星的MIC值降低至原值的1/4,但體內(nèi)治療在低濃度(20 μg/mL)時(shí)效果更好,可將秀麗隱桿線蟲(chóng)生存率提高20%~30%[13-14]。NMP體內(nèi)感染秀麗隱桿線蟲(chóng)的藥效試驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度的NMP治療效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,低濃度的NMP(20 μg/mL)可將線蟲(chóng)的存活率提高15%~20%[15]。利血平和維拉帕米是ATP水解驅(qū)動(dòng)型EPI,在臨床上有各自的適應(yīng)證,利血平是一種吲哚型生物堿,臨床上用于高血壓的治療,作為泵抑制劑,其本身也是某些外排泵的底物,可與抗菌藥物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)菌外排泵蛋白[16]。利血平在安全范圍內(nèi)的體外抑菌試驗(yàn)中,可將鹽酸環(huán)丙沙星的MIC降低至原來(lái)的1/2,用于體內(nèi)感染秀麗隱桿線蟲(chóng)的治療時(shí),低濃度(10 μg/mL)時(shí)可將秀麗隱桿線蟲(chóng)的存活率提高20%,低濃度的EPIs發(fā)揮更好的翻轉(zhuǎn)鹽酸環(huán)丙沙星耐藥性作用。維拉帕米屬Ⅳ類抗心律失常藥,安全范圍內(nèi)的維拉帕米可將鹽酸環(huán)丙沙星的MIC降低至原來(lái)的1/4,與其他EPIs不同的是,不同濃度的維拉帕米用于體內(nèi)藥效試驗(yàn)結(jié)果,高濃度的維拉帕米(60 μg/mL)可將秀麗隱桿線蟲(chóng)存活率提高30%左右,高濃度的維拉帕米與鹽酸環(huán)丙沙星有更好的聯(lián)合治療作用,但用于人體,仍需考慮尤其是對(duì)心臟、肝腎的毒性作用[10]。體外藥敏試驗(yàn)較好的藥物在體內(nèi)或許因?yàn)檩^大的毒性作用而不能用于臨床,且EPIs在聯(lián)合用藥時(shí)發(fā)揮最好療效翻轉(zhuǎn)鹽酸環(huán)丙沙星耐藥性的濃度也有所不同,因此,不同的EPIs體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果存在差異。

        綜上所述,利用臨床分離的XDR-AB,成功建立秀麗隱桿線蟲(chóng)-鮑曼不動(dòng)桿菌感染模型,用于體內(nèi)治療藥物的活性篩選,可呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系,同時(shí)結(jié)合藥物的毒性作用并與體外實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析,探索發(fā)現(xiàn)新的、有效的抗菌藥物,或通過(guò)翻轉(zhuǎn)已有抗菌藥物的耐藥性,為解決細(xì)菌日益嚴(yán)重的耐藥問(wèn)題提供一個(gè)良好的思路和途徑。

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        ReversalofciprofloxacinresistancebyeffluxpumpinhibitorsusingCaenorhabditiselegans-extensivelydrug-resistantAcinetobacterbaumanniiinfectionmodel

        DUANXin-ran1,2,JIANGZhi-hui2,YANGXiang-hai3,LIJian1,2

        (1GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510000,China; 2GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommandofPLA,Guangzhou510000,China; 3ChangshaMedicalUniversity,Changsha410000,China)

        ObjectiveTo establish an extensively drug-resistantAcinetobacterbaumannii(XDR-AB) infection model usingCaenorhabditiselegans(C.elegans), and evaluate the effect of efflux pump inhibitors(EPIs) on reversal of ciprofloxacin resistance in XDR-AB.MethodsXDR-AB infection model ofC.eleganswas established, six EPIs(CCCP, PAβN, NMP, omeprazole, reserpine, and verapamil)combined with ciprofloxacin were used to treat the infected model, the survival rate ofC.eleganswas recorded to evaluate the in vivo activities of drugs, toxicity test and in vitro drug susceptibility test were also performed.ResultsLethal effect of different concentrations of XDR-AB onC.eleganswas varied, 5×106CFU/mL of XDR-AB was selected to infectC.elegans.C.eleganssurvival test showed that survival curves ofC.elegansinfected with XDR-AB for 3 hours and curves of control group (polymixin B was added) were not significantly different (χ2=3.154,P>0.05); compared with control group, survival curves ofC.elegansinfected with XDR-AB for 6 hours or 9 hours were significantly different (bothP<0.001), but 6 hours and 9 hours were not significantly different(χ2=0.669,P>0.05),6 hours was chosen as the duration of infection, 36 hours was appropriate for the duration of antimicrobial therapy. Ciprofloxacin with EPIs for infection model revealed that low concentration of PAβN, NMP, omeprazole, and reserpine could improve the survival rate ofC.elegansby 30%-40%, 15%-20%, 20%-30%, and 20% respectively, high concentration of verapamil could improve the survival rate of infectedC.elegansby about 30%. In vitro susceptibility test and toxicity test results showed that ciprofloxacin combined respectively with CCCP, omeprazole, and verapamil could reduce minimum inhibitory concentration(MIC) to the original 1/4, combined respectively with PAβN,NMP, and reserpine could reduce MIC to the original 1/2, CCCP had the best bacterial inhibitory effect in vitro, but the toxicity was large, and was not suitable for the study of pharmacodynamics in vivo.ConclusionThe infection model ofC.elegans-XDR-AB is initially and successfully established, which is used to evaluate the efficiency of six EPIs for reversing ciprofloxacin resistance.

        Acinetobacterbaumannii;Caenorhabditiselegans; efflux pump inhibitor; ciprofloxacin

        [Chin J Infect Control,2017,16(12):1101-1108]

        2017-08-06

        國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81403084);廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.201509010012)

        段欣冉(1993-),女(漢族),河南省鄭州市人,碩士研究生,主要從事抗感染藥物的高通量篩選研究。

        李健 E-mail:2292851480@qq.com

        10.3969/j.issn.1671-9638.2017.12.001

        R378

        A

        1671-9638(2017)12-1101-08

        左雙燕)

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