王 堅(jiān)，袁紅伶

(1.云南省第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，昆明 650032;2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呈貢分院腎內(nèi)科，昆明 650500)

論著·基礎(chǔ)研究

傣藥雅盼對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響*

王 堅(jiān)1，袁紅伶2△

(1.云南省第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，昆明 650032;2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呈貢分院腎內(nèi)科，昆明 650500)

傣藥雅盼；腎間質(zhì)纖維化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；單側(cè)輸尿管梗阻；大鼠

腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟病進(jìn)展的重要病理基礎(chǔ)，比腎小球硬化更能反映腎臟受損傷的程度[1]。如何抑制腎間質(zhì)纖維化一直是一個(gè)值得探討的話(huà)題。傣藥雅盼在民間長(zhǎng)期運(yùn)用于腎炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的治療。本研究將從分子生物學(xué)角度來(lái)證實(shí)傣藥雅盼在治療腎衰竭方面的作用，為民族醫(yī)藥的臨床應(yīng)用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑盒 雅盼由云南省中藥研究所提供；鹽酸苯那普利(洛丁新)購(gòu)自北京諾華制藥有限公司；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；鼠抗β-actin單克隆抗體購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Smad2、Smad7多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Protech公司；MCP-1購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性大鼠120只(6周齡，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物科)，體質(zhì)量(200±25)g，飼養(yǎng)條件：室溫18～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由攝入標(biāo)準(zhǔn)飼料，飲用煮沸后冷卻的自來(lái)水，換墊料1次/天，光照，12 h光照/黑暗，照明時(shí)間8：00-20：00。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物造模與分組 120只大鼠分為假手術(shù)組(20只)及模型組。模型組又分為5組：生理鹽水對(duì)照組(對(duì)照組)，雅盼低劑量藥物組(低劑量組)，雅盼中等劑量藥物組(中劑量組)，雅盼高劑量藥物組(高劑量組)，苯那普利組，每組各20只。

單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型制作：大鼠右側(cè)臥位，備皮后常規(guī)消毒，3%戊巴比妥鈉局部麻醉，取左側(cè)背部肋下5 mm作切口，開(kāi)腹，游離左腎及輸尿管，取中上段結(jié)扎，之后逐層縫合。假手術(shù)組開(kāi)腹后游離輸尿管后即關(guān)腹。

1.2.2給藥方法 造模次日開(kāi)始灌胃給藥。假手術(shù)組與對(duì)照組予生理鹽水5 mL灌胃；雅盼提液低、中、高劑量組分別為4.0、8.0、12.0 g/(kg·d)；苯那普利組予苯那普利混懸液5 mL/d灌胃，其有效劑量為0.467 mg/(kg·d)，共28 d。

1.2.3標(biāo)本采集與處理 各組大鼠治療28 d后頸動(dòng)脈取血，分離血清后送檢；脫頸處死大鼠，取左腎組織，10%甲醛固定，磷酸鹽緩沖液沖洗，二甲苯乙醇液脫水，石蠟包埋切片。

1.2.4檢測(cè)內(nèi)容及方法

1.2.4.1血清檢測(cè) 尿酶法檢測(cè)尿素氮(BUN)、苦味酸法檢測(cè)肌酐(Scr)。

1.2.4.2組織檢測(cè) 腎組織石蠟切片后進(jìn)行HE染色及Masson染色。HE染色行常規(guī)顯微鏡檢查，同時(shí)計(jì)算腎小管損傷指數(shù)(TII)。Masson染色在400倍鏡下，觀(guān)察小管間質(zhì)病變。TII：即半定量分析腎小管間質(zhì)病變[2]。每張切片隨機(jī)選10個(gè)不含腎小球的視野，400倍光鏡下觀(guān)察，由3個(gè)參數(shù)進(jìn)行判斷：蛋白管型和腎小管擴(kuò)張、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)纖維化程度。每個(gè)參數(shù)按0～3分評(píng)價(jià)：0分為正常；1分為輕度，視野內(nèi)損傷小于25%；2分為中度，視野內(nèi)損傷25%～50%；3分為重度，視野內(nèi)損傷大于50%。TII評(píng)分由腎臟所有視野的損傷等級(jí)評(píng)分加權(quán)平均計(jì)算而得。每個(gè)樣本腎小管間質(zhì)的評(píng)分為0～9分。

1.2.4.3免疫組織化學(xué)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法,磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照染色,檢測(cè) TGF-β1、Smad2、Smad7的表達(dá)。每個(gè)觀(guān)察指標(biāo)在同一標(biāo)本中制作切片2張,采用不加一抗的方法作陰性對(duì)照,同樣也在每一組中作2張對(duì)照。出現(xiàn)黃褐色反應(yīng)為陽(yáng)性,相同部位不出現(xiàn)黃色反應(yīng)為陰性。 陽(yáng)性等級(jí)判斷指標(biāo)：顯色強(qiáng)度、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。顯色強(qiáng)度有以下幾種表達(dá):無(wú)色、黃色、淺黃色、黃褐色。免疫組織化學(xué)結(jié)果以Qwin550CW型圖像信號(hào)采集及分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度值測(cè)量?；叶戎翟礁弑砻飨鄳?yīng)蛋白表達(dá)越低,反之則表明相應(yīng)蛋白表達(dá)越高。

1.2.4.4反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)mRNA的表達(dá) TGF-β1、Smad2、Smad7 mRNA水平檢測(cè)參照ABI試劑(SYBR Select Master Mix)RT-PCR操作說(shuō)明進(jìn)行，ABI7500熒光定量PCR儀器中進(jìn)行，以β-actin為內(nèi)參，運(yùn)用2-△△t法進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，△△CT=(CT目的基因-CT管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(CT目的基因-CT管家基因)。

1.2.4.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) Western blot檢測(cè)Smad2和Smad7蛋白。取100 g腎組織勻漿，取上清液，以BCA蛋白試劑盒檢測(cè)勻漿液中蛋白濃度，將蛋白標(biāo)本經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，TBST室溫封閉后與特異性的Smad2(1∶500)抗體和Smad7(1∶500)抗體共孵育，之后與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體作用、洗滌，最后X線(xiàn)片記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算機(jī)成像分析儀，測(cè)定X線(xiàn)片上雜交條帶的吸光度值，代替蛋白表達(dá)量。全部試驗(yàn)均用β-actin作內(nèi)參，以上每組操作重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 各組大鼠傷口愈合良好，無(wú)感染。模型組進(jìn)食量明顯少于假手術(shù)組，且鼠毛無(wú)光澤，同時(shí)聳毛、弓背、活動(dòng)減少。雅盼各組及苯那普利組治療后，進(jìn)食有所恢復(fù)，但仍不及假手術(shù)組，活動(dòng)較前增加；但鼠毛無(wú)明顯變化。

實(shí)驗(yàn)期間，假手術(shù)組及高劑量組無(wú)死亡，生理鹽水對(duì)照組死亡2只，中劑量組死亡2只，低劑量組及苯那普利組死亡1只。各組動(dòng)物死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2腎功能檢測(cè) 造模后28 d模型組BUN、Scr與假手術(shù)組比較，明顯增高(P<0.05)；但經(jīng)苯那普利及雅盼高、中、低劑量灌胃后BUN、Scr水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；其中苯那普利組與高劑量組BUN、Scr低于中、低劑量組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 治療后各組大鼠Scr、BUN水平

*:P<0.05,與假手術(shù)組比較；△:P<0.05,與對(duì)照組比較

2.3腎組織病理改變 光鏡下HE和Masson染色顯示，假手術(shù)組大鼠腎小球正常，腎小管-間質(zhì)輕微纖維化(面積小于5%)，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。UUO各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞空泡化，腎小管擴(kuò)張明顯，部分腎小管萎縮，排列紊亂，腎間質(zhì)彌漫炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，Masson染色可見(jiàn)腎間質(zhì)局灶性纖維化。雅盼各治療組及苯那普利組，腎小管-間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及腎間質(zhì)纖維化程度較對(duì)照組有所減輕，尤以高劑量組及苯那普利組減輕明顯(圖1～6)。TII評(píng)分顯示，UUO大鼠TII評(píng)分顯著高于假手術(shù)組(P<0．05)，但與對(duì)照組相比高、中劑量組及苯那普利組TII評(píng)分明顯改善(P>0．05)，低劑量組與對(duì)照組相比TII評(píng)分有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠TII評(píng)分、TGF-β1、Smad2、Smad7表達(dá)的比較

*:P<0.05，與假手術(shù)組比較；△：P<0.05，與對(duì)照組比較;○:單位為灰度值

圖1 各組HE染色情況

圖2 各組Masson染色情況

2.4各組大鼠腎臟組織的免疫組織化學(xué)結(jié)果

2.4.1TGF-β1及Smad2 mRNA表達(dá) 假手術(shù)組腎組織腎小球和腎小管上皮細(xì)胞中無(wú)或弱陽(yáng)性表達(dá)。模型組表現(xiàn)為褐色顆粒狀沉積，著色較深，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，主要集中在腎小管上皮細(xì)胞，腎小球也可見(jiàn)少量表達(dá)，假手術(shù)組與各模型組間的灰度值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低劑量組、中劑量組、高劑量組及苯那普利組之間有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)，但均低于對(duì)照組。見(jiàn)圖3、4。

圖3 TGF-β1在各組中的表達(dá)情況

2.4.2Smad7 mRNA的表達(dá) 假手術(shù)組Smad7 mRNA在腎小球著色部位廣泛，呈棕黃色顆粒或塊狀，為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在腎小球的分布多于腎間質(zhì)，主要見(jiàn)于毛細(xì)血管壁、腎小球系膜細(xì)胞和腎小球囊上皮細(xì)胞。各模型組Smad7 mRNA的表達(dá)有不同程度抑制，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量組、中劑量組與苯那普利組表達(dá)抑制情況有所改善，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低劑量組較對(duì)照組相比表達(dá)有所增強(qiáng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 Smad7在各組中的表達(dá)情況

2.4.3Smad2和Smad7 Western blot蛋白表達(dá) 見(jiàn)圖6。

M：Marker，D2000；1：假手術(shù)組；2：對(duì)照組；3：低濃度組；4：中濃度組；5：高濃度組；6：苯那普利組

圖6 Smad2、Smad7與β-actin電泳圖

3 討 論

腎間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的必經(jīng)通路。大量研究證明，TGF-β1是加速腎纖維化的最關(guān)鍵因素[3]。TGF-β1能加劇細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生，對(duì)ECM基因表達(dá)、基質(zhì)降解、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡及免疫功能都具有一定影響[4]，是導(dǎo)致腎小球硬化，腎小管-間質(zhì)纖維化的重要因素[5]。Smads蛋白是TGF-β家族信號(hào)從受體到核的細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)分子，調(diào)控細(xì)胞膜信號(hào)傳導(dǎo)，在慢性腎纖維化中，起重要作用[6-8]。Smad2與Smad3 同屬受體激活型Smad蛋白(R-Smad)，二者具有92%的同源性[9]。但有學(xué)者研究，大鼠敲除Smad3基因后，在TGF-β1刺激下，成纖維細(xì)胞依舊可以生成基質(zhì),顯示 Smad2 是許多基質(zhì)反應(yīng)中的特異性調(diào)節(jié)因子[10-11]。Smad7屬于細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型受體絲氨酸/蘇氨酸激酶的拮抗蛋白，它具有阻止R-Smads磷酸化及反饋調(diào)節(jié)TGF-β對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄的作用，是阻斷腎組織TGF-β1效應(yīng)的關(guān)鍵[12-14]。已有不同學(xué)者對(duì)苯那普利延緩慢性腎衰竭病程進(jìn)展方面的作用進(jìn)行研究，結(jié)果均表明，該藥確實(shí)能調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制腎間質(zhì)纖維化[15-16]，故本研究中以此藥作為西藥對(duì)照。

UUO是研究腎小管間質(zhì)纖維化成熟的動(dòng)物模型。本研究顯示，UUO大鼠腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管擴(kuò)張，壞死,空泡化，間質(zhì)纖維化，符合慢性腎小管間質(zhì)纖維化的特點(diǎn)。

傣藥雅盼系蕨類(lèi)卷柏科卷柏屬植物。該藥已有長(zhǎng)期且較為廣泛的運(yùn)用，具有清熱利濕，止咳止血，抗炎作用[17]。而近年的研究提示該類(lèi)藥含有大量雙黃酮類(lèi)及阿魏酸棕櫚酸-16-醇酯等成分，具有抗病毒 、抗炎、 抗氧化、抗血栓及擴(kuò)張血管作用[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)UUO模型組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)上調(diào)，而Smad7蛋白表達(dá)下調(diào)，TII評(píng)分明顯升高，腎功能明顯下降，而經(jīng)28 d干預(yù)后，雅盼低、中、高劑量組TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)較對(duì)照組均有不同程度的下調(diào)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中、高劑量組Smad7蛋白表達(dá)有不同程度上調(diào)(P<0.05)，而腎臟病理?yè)p傷程度較對(duì)照組有不同程度減輕：腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管擴(kuò)張，壞死及間質(zhì)纖維化程度也有不同程度減輕，腎功能有所恢復(fù)，TII評(píng)分明顯減低，其中、高劑量組及苯那普利組TII評(píng)分減低程度優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。

綜上所述，傣藥雅盼中、高劑量治療可以下調(diào)TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)，上調(diào) Smad7蛋白表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減輕UUO大鼠術(shù)后腎臟病變，延緩腎小管損傷及腎纖維化進(jìn)展。

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EffectofDaimedicineYapanonTGF-β1/Smadssignalingtransductionpathwayinunilateralureteralobstructionrats*

WangJian1,YuanHongling2△

(1.DepartmentofNephrology,YunnanProvincialFirstPeopleHospital,Kunming,Yunnan,650032,China； 2.TheFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversityChenggongSorting,Kunming,Yunnan650500,China)

Dai medician Yapan;renal interstitial fibrosis;transforming growth factor-β1;unilateral ureteral obstruction;rats

目的觀(guān)察傣藥雅盼對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，從而探討該藥對(duì)腎間質(zhì)纖維化抑制作用的可能機(jī)制。方法120只雄性大鼠行單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立UUO大鼠模型，生理鹽水灌胃或給藥28 d后收集血清檢測(cè)尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)，處死大鼠，取其腎組織行HE染色和Masson染色，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TGF-β1、Smad2、Smad7在腎組織的表達(dá)；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)mRNA的表達(dá)；Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)。結(jié)果傣藥雅盼各劑量組能降低大鼠BUN、Scr水平，并減輕腎小管-間質(zhì)炎性細(xì)胞及腎間質(zhì)纖維化程度，同時(shí)使TGF-β1、Smad2 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，而Smad7 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論傣藥雅盼各濃度組均可以在一定程度抑制Smad2 mRNA的表達(dá)，上調(diào)Smad7 mRNA的表達(dá)，通過(guò)干預(yù)TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制了TGF-β1在腎組織的表達(dá)從而對(duì)UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化。

R453.9

A

1671-8348(2017)31-4325-04

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.31.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460649)。

王堅(jiān)(1968-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事慢性腎衰竭及血液凈化研究?！?/p>

，E-mail：kmyuanhl@yeah.net。

ObjectiveTo observe the effect of Dai medicine Yapan on TGF-β1/Smads signaling transduction pathway in unilateral ureteral obstruction (UUO) rats,and to explore its possible mechanism in rat renal interstitial fibrosis inhibitory effect.MethodsThe UUO rat model was established by conducting the unilateral ureteral obstruction(UUO) in 120 male rats.Normal saline gavage or medication were performed for 28 d and serum was collected for detecting BUN and Scr.Then the rats were killed for taking the renal tissue and conducting HE and Masson staining.The expression of TGF-β1,Smad2 and Smad7 in kidney tissues were detected by using the immunohistochemical method.The mRNA expression was detected by RT-PCR;the protein expression was detected by Western blot.ResultsVarious Yapan doses groups could reduce the level of serum BUN and Scr in experimental rats,alleviated renal tubular interstitial inflammatory cells and renal interstitial fibrosis degree,meanwhile up-regulated the expression of TGF-β1,Smad2 mRNA and protein (P<0.05),while down-regulated the expression of Smad7 mRNA and protein (P<0.05).ConclusionDifferent concentrations groups of Dai medician Yapan may inhibit Smad2 mRNA expression in some extent,up-regulates Smad7 mRNA expression,inhibits the expression of TGF-β1 in kidney tissues through interfering TGF-β1/Smads signaling transduction pathway,thus obtains a therapeutic effect for inhibiting kidney interstitial fibrosis in UUO rat.

2017-03-24

2017-06-12)