袁紅剛

（漢川市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 漢川 431600）

青蒿素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡相關(guān)因子及炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響

袁紅剛

（漢川市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 漢川 431600）

目的 探討青蒿素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡因子及炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響。方法 采用線栓法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型，健康SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、青蒿素預(yù)處理組。缺血2 h，再灌注24 h后，處死大鼠，腦組織取材。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Fas、FasL、Bcl-2、Bax mRNA水平。采用ELISA法檢測(cè)TNF-α和IL-1β蛋白水平。結(jié)果 與假手術(shù)比較，模型組Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05)，Bcl-2/Bax比值下調(diào)(P＜0.05)，TNF-α和IL-1β蛋白水平升高(P＜0.05)，青蒿素預(yù)處理可明顯下調(diào)Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA水平及TNF-α和IL-1β蛋白水平(P＜0.05)，上調(diào)Bcl-2/Bax比值(P＜0.05)。結(jié)論 青蒿素對(duì)腦缺血再灌注損傷后的腦組織具有保護(hù)作用。

青蒿素；Bcl-2；Bax；腫瘤壞死因子α；腦缺血再灌注損傷

缺血性腦血管病嚴(yán)重危害人類健康。近年來，腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡一直是研究的熱點(diǎn)，然而其發(fā)生機(jī)制目前尚不明確。目前已經(jīng)確認(rèn)的是，細(xì)胞凋亡不僅受凋亡相關(guān)因子的調(diào)控，還被許多內(nèi)外因素所調(diào)節(jié)，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等。因此有效地減少腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡[1-3]，可以減輕缺血再灌注對(duì)腦組織的損傷，有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。青蒿素是一種菊科植物黃花蒿中提取物，是世界衛(wèi)生組織公認(rèn)的抗瘧疾藥物。大量的研究證實(shí)，青蒿素還具有多重生物學(xué)效應(yīng)，如免疫調(diào)節(jié)、抗炎癥、抗凋亡及抗纖維化等。本研究通過線栓法制備大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察青蒿素預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷后Fas、FasL、Bcl-2、Bax RNA水平及TNF-α和IL-1β蛋白水平的影響，探討青蒿素腦保護(hù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)健康Sprague-Dawley雄大鼠80只，8周齡，體質(zhì)量250～300 g。由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成3組，即假手術(shù)組（n=20）、模型對(duì)照組（n=30）、青蒿素組（n=30）。

1.2 模型制作 參照Zea線栓法（Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats），3%戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉大鼠，麻醉劑量為40～50 mg/kg。將大鼠固定于鼠板上，頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，順著右側(cè)頸總動(dòng)脈經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈插入制備好的線栓，直到遇到阻力為止，阻斷大腦中動(dòng)脈血流2 h,拔出線栓，形成再灌注。假手術(shù)除了不插入線栓，其他步驟與另外兩組一致。再灌注24 h處死大鼠，腦組織取材。

1.3 給藥途徑 青蒿素組在造模1周前給予青蒿素灌胃，劑量為5 mg/（kg·d）。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠腦組織Fas、FasL、Bcl-2、Bax RNA表達(dá) 取大鼠腦組織 Trizol法，嚴(yán)格按照說明書提取總mRNA。Fas：上游引物5′-GTG ATG AAG GGC ATG GTT TAG-3′，下游引物5-′GCA TTT GGT GTT GCT GGT T-3′；FasL：上游引物5′-ACC ACC TCC ATC ACC ACT ACC-3′，下游引物5′-CAT TCC AAC CAG AGC CAC C-3′；Bcl-2：上游引物5′-TTT GAT TTC TCC TGG CTG TCT-3′′，下游引物5′-CTG ATT TGA CCA TTT GCC TG-3′；Bax：上游引物5′-TGA ACT GGA CAA CAA CAT GGA G-3′，下游引物 5′-AGC AAA GTA GAA AAG GGC AAC C-3′；β-actin：上游引物5′-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CCT C-3′，下游引物5′-TAG GAG CCA GGG CAG TAA TCT-3′。

1.5 腦組織TNF-α和IL-1β水平檢測(cè) 腦損傷后24 h小時(shí)分別斷頭處死6只，在冰上分離右頂傷灶附近腦組織，置于冷生理鹽水中漂洗稱重，然后研磨勻漿，以3 500 r/min、-4℃離心10 min,提取上清液后按照ELISA試劑盒進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用“x±s”表示，各組樣本均數(shù)采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Fas和FasL mRNA表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組Fas和FasL mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，青蒿素組Fas和FasL mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 Fas和FasL mRNA水平Figure1 Fas and FasL mRNAlevels

2.2 Bcl-2和Bax mRNA表達(dá) 與假手術(shù)比較，模型組Bcl-2和Bax mRNA水平顯著上調(diào)，Bcl-2/Bax比值顯著下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，青蒿素組Bcl-2 mRNA水平和Bcl-2/Bax比值顯著上調(diào)，Bax mRNA水平顯著下調(diào)，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 A.Bd-2和Bax mRHA水平；B.Bcl-2/Bax比值Figure 2 A.bd-2 and Bax mRHAlevel;B.Bcl-2/Bax ratio

2.3 TNF-α和IL-1β水平與假手術(shù)比 模型組TNF-α和IL-1β水平均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，青蒿素組TNF-α和IL-1β水平均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 3組TNF-α和IL-1β水平比較（x±s）Table 1 Comparison of TNF-alpha and il-1 beta levels in 3 groups(x±s)

3 討論

本研究在大鼠腦缺血再灌注損傷模型的基礎(chǔ)上，給予青蒿素對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，與假手術(shù)比較，模型組Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2/Bax比值下調(diào)，TNF-α和IL-1β蛋白水平升高，青蒿素干預(yù)可明顯下調(diào)Fas、FasL、Bcl-2和Bax mRNA水平及TNF-α和IL-1β蛋白水平，上調(diào)Bcl-2/Bax比值，提示青蒿素可通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4-6]。

細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的主動(dòng)性死亡。大量的研究表明，細(xì)胞凋亡參與缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡。腦組織缺血時(shí)，缺血中心細(xì)胞快速的發(fā)生壞死，半影區(qū)則主要以凋亡的機(jī)制發(fā)生遲緩性細(xì)胞死亡[7-10]。Fas屬于腫瘤壞死因子的受體家族成員，是一種具有重要功能的細(xì)胞表面受體，其與FasL相互作用可介導(dǎo)缺氧所致的細(xì)胞凋亡。Fas是參與腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要因素之一，另外，F(xiàn)as/FasL通路的激活還介導(dǎo)Caspase-3的激活。本研究結(jié)果顯示，青蒿素預(yù)處理可以降低腦缺血再灌注損傷后的Fas和FasL mRNA表達(dá)水平。Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因，其還可以調(diào)節(jié)Ca2+流入細(xì)胞，抑制氧自由基的產(chǎn)生。Bax是細(xì)胞凋亡的促進(jìn)基因[11-12]，并對(duì)抗Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用。Bcl-2與Bax表達(dá)的比值決定著細(xì)胞在受到凋亡刺激信號(hào)后的存亡。在腦缺血再灌注后，Bcl-2/Bax比值降低時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，比值升高時(shí)促進(jìn)細(xì)胞存活。本研究中，青蒿素干預(yù)腦缺血再灌注損傷可上調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax比值，同時(shí)下調(diào)Bax mRNA表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)了腦組織。

本研究還發(fā)現(xiàn)給予青蒿素預(yù)處理可減少腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織中TNF-α和IL-1β蛋白水平。腦缺血激發(fā)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)在缺血再灌注損傷中發(fā)揮著中要用。目前已經(jīng)證實(shí)，短暫性腦缺血就會(huì)誘導(dǎo)TNF-α和IL-1β等促炎癥因子的表達(dá)。TNF-α是體內(nèi)最主要的炎癥因子，TNF-α過度表達(dá)可直接作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞，改變其通透性，還刺激內(nèi)皮細(xì)胞合成并釋放IL-1β。TNF-α過度表達(dá)還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TNF-α引發(fā)一系列炎癥介質(zhì)的始發(fā)因素，對(duì)腦缺血后腦組織具有損害作用。IL-1β是一種多功能的細(xì)胞因子，在正常腦組織中只有少量表達(dá)，其在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和腦對(duì)各種損傷的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。IL-1β不僅可以促進(jìn)T、B細(xì)胞活化，還可以誘導(dǎo)TNF-α、IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生。IL-1β參與腦水中形成及神經(jīng)元壞死。我們有理由相信本研究結(jié)果表明的青蒿素預(yù)處理能降低腦缺血再灌注損傷后炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6的表達(dá)，能減少其過度釋放導(dǎo)致的腦細(xì)胞繼發(fā)性損傷，有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。

綜上所述，本研究觀察青蒿素能降低腦缺血再灌注損傷后凋亡因子及炎癥介質(zhì)的表達(dá)，證明青蒿素具有腦細(xì)胞保護(hù)作用，從分子水平對(duì)其作用機(jī)制研究的一種擴(kuò)充，但具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究，為臨床開展腦保護(hù)治療提供新思路。

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Effects of artemisinin on expression of apoptosis-related factors and inflammatory mediators

Yuan Hong-gang
(Neurosurgery of hanchuan people's hospital,Hanchuan,Hubei,431600,China)

Objective To observe of artemisinin on expression of apoptosis-related factors and inflammatory mediators.Methods 80 male adult Sprague-Dawley rats were randomly assigned into 3 groups：sham group,model group and artemisinin group.The middle cerebral artery occlusion reperfusion model was made by the suture method(ischemia for 2 hour and reperfusion for 24 h).After that were sacrificed by decapitation,the mRNA level of Fas,FasL,Bcl-2,Bax were measured by real time RT-PCR,the level of TNF-α and IL-1β were measured by ELISA.Results The level of Fas,FasL,Bcl-2,Bax,TNF-α and IL-1β were increased significantly in rats with focal cerebral ischmeia-reperfusion(P＜0.05).Compared with the model group,The level of Fas,FasL,Bax,TNF-α and IL-1β were decreased significantly in rats of artemisinin group(P＜0.05),the Bcl-2 was up regulated(P＜0.05).Conclusion Artemisinin exert a protective effect against focal cerebral ischmeia-reperfusion via reducing apoptosis and inflammation.

Artemisinin;Bcl-2;Bax;TNF-α;Cerebral ischmeia-reperfusion

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.33.010