文湖南師大附中梅溪湖中學(xué) 李潤(rùn)龍中南大學(xué)第一附屬中學(xué) 王子璇 何凱科

以自然之力恢復(fù)自然
——湘潭縣鳳形山有益微生物篩選鑒定研究

文湖南師大附中梅溪湖中學(xué) 李潤(rùn)龍中南大學(xué)第一附屬中學(xué) 王子璇 何凱科

2016年暑假，我們?nèi)ハ嫣犊h鳳形山學(xué)習(xí)考察時(shí)得知，長(zhǎng)沙某大酒店高管左叔叔一直想憑借自己的努力，在鳳形山建設(shè)有機(jī)農(nóng)場(chǎng)，帶動(dòng)鄉(xiāng)親們致富。他決心告別目前“大農(nóng)藥、大化肥”等技術(shù)為主的化學(xué)農(nóng)業(yè)模式，轉(zhuǎn)向“動(dòng)物、植物與微生物完美配合、自動(dòng)循環(huán)”的有機(jī)生態(tài)農(nóng)業(yè)模式，以保證農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、保護(hù)消費(fèi)者健康，達(dá)到“以自然之力恢復(fù)自然”“天人合一”的理想境界。

鳳形山區(qū)域零星分布著一些長(zhǎng)勢(shì)良好的一季稻，主要供村民自己食用，幾乎沒(méi)有施用農(nóng)藥、化肥及除草劑等。

村里長(zhǎng)壽老人多，夏天蚊蟲少，水稻生長(zhǎng)茂盛，很少發(fā)生病蟲害。而周邊幾個(gè)村子的水稻或多或少都發(fā)生過(guò)紋枯病之類的病害，造成嚴(yán)重的減產(chǎn)甚至絕收。

我們猜想，鳳形山可能具有獨(dú)特的微生態(tài)環(huán)境，其中某些有益微生物抑制了水稻病害的發(fā)生。因此，有必要篩選經(jīng)濟(jì)高效、無(wú)副作用的有益微生物，將其應(yīng)用于有機(jī)水稻等農(nóng)產(chǎn)品病害防治的研究，并探索有益微生物協(xié)同防治水稻紋枯病的新途徑。

一、擬建生態(tài)農(nóng)場(chǎng)區(qū)域環(huán)境檢測(cè)

參考關(guān)于有機(jī)農(nóng)場(chǎng)開(kāi)發(fā)與環(huán)境相適應(yīng)的評(píng)價(jià)方法的相關(guān)文獻(xiàn)，鳳形山區(qū)域環(huán)境中大氣污染物、土壤和水源的重金屬及農(nóng)殘等技術(shù)指標(biāo)均達(dá)到有機(jī)農(nóng)場(chǎng)的建設(shè)要求。

在無(wú)人工干預(yù)之下，該區(qū)域良好的自然環(huán)境及微生態(tài)系統(tǒng)經(jīng)過(guò)三十多年的自由生長(zhǎng)，很可能孕育了一系列有益微生物種群，通過(guò)篩選、分離和鑒定，為有機(jī)水稻等農(nóng)產(chǎn)品病害防治和有機(jī)農(nóng)場(chǎng)的建設(shè)創(chuàng)造條件。

二、土壤微生物取樣及培養(yǎng)

1.土壤微生物取樣

采樣地點(diǎn)為湘潭縣中路鋪鎮(zhèn)鳳形山。通過(guò)手機(jī)定位在擬建有機(jī)農(nóng)場(chǎng)定位三地塊15個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)分四層取樣，培養(yǎng)和篩選優(yōu)勢(shì)菌株。

2.樣品分類

樣品分為四類：表層土壤；1cm~10cm土層土壤；10cm~20cm土層土壤；20cm~30cm土層土壤。

表層土壤

1cm~10cm

10cm~20cm

20cm~30cm

3.土壤微生物培養(yǎng)

a.取一定量陰干的土壤，置于滅菌后的研缽內(nèi)研磨，使土壤顆粒均勻、細(xì)膩。稱取1g研磨好的土樣，加入9mL無(wú)菌水用力振蕩15min，使土樣分布均勻，成為土壤懸液。

b.取1mL土壤懸液滴入滅菌試管中，用無(wú)菌水依次稀釋成3個(gè)濃度梯度，分別為 10、100、1 000。分別取土壤稀釋液1 000倍液100uL，用滅菌的L型玻璃棒均勻地涂于LB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)48h。

c.挑選各個(gè)菌落分離培養(yǎng)。挑取真菌菌落置于PDA平板培養(yǎng)，挑取細(xì)菌菌落在LB平板進(jìn)行劃線培養(yǎng)。

結(jié)果表明，鳳形山荒廢多年的平緩坡地土壤中的微生物種類豐富，且菌落種數(shù)表層土壤＞1cm~10cm土層＞10cm~20cm土層＞20cm~30cm土層，底層微生物以厭氧真菌為主，好氧細(xì)菌很少。

三、微生物菌落分離

通過(guò)觀察在LB平板和PDA平板上生長(zhǎng)的菌落的形態(tài)、顏色、生長(zhǎng)狀況等，共挑選出6種細(xì)菌和2種真菌。

其中細(xì)菌分別標(biāo)號(hào)為ZN-1、ZN-2、ZN-3、ZN-4、ZN-5、ZN-6，真 菌標(biāo)號(hào) 為ZN-A、ZN-B。

隨后挑選了5株細(xì)菌（ZN-1、ZN-2、ZN-3、ZN-4、ZN-6）和 2 株真菌進(jìn)行菌種鑒定。

四、微生物菌種鑒定

樣品采用 Bacterial DNA Kit（Omega）試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取，再經(jīng)過(guò)Sanger測(cè)序、建庫(kù)上機(jī)測(cè)序，得到的原始序列在Galaxy平臺(tái)進(jìn)行質(zhì)控后獲得初處理序列。將獲得的初處理序列中含有重疊部分的序列進(jìn)行拼接，然后將重復(fù)序列去除。

將拼接后的序列在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行核苷酸 blast比對(duì)，比對(duì)結(jié)果利用RDP獲取物種分類信息。

五、微生物基因序列及分析鑒定

NCBI的比對(duì)結(jié)果顯示，ZN-2基因序列有946個(gè)堿基，與芽孢桿菌屬的多個(gè)種的細(xì)菌完全匹配，E-value為0，且覆蓋率高達(dá)99%，可以確定ZN-2屬于芽孢桿菌屬。

選擇其中相似性較高的分布在芽孢桿菌屬的15種細(xì)菌，下載它們的基因序列，使用軟件MEGA 5.0繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹顯示ZN-2與Bacillus pumilus strain NJ-M2的親緣關(guān)系最接近，所以推猜測(cè)ZN-2屬于短小芽孢桿菌Bacillus pumilus。

ZN-2短小芽孢桿菌

5株微生物中ZN-1為假單胞菌屬，ZN-2、ZN-3、ZN-4、ZN-6 分別為短小芽孢桿菌、海洋芽孢桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿；ZN-A、ZN-B及ZN-5有待進(jìn)一步鑒定。

由此可以初步斷定，鳳形山獨(dú)特的有益微生物極有可能是芽孢桿菌菌落。芽孢桿菌屬的絕大多數(shù)菌種都有很好的安全性，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成再次污染。這些有益芽孢桿菌的發(fā)現(xiàn)為有機(jī)農(nóng)場(chǎng)的建設(shè)及有機(jī)水稻的生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。（指導(dǎo)老師：段家鐵 蔣銀生）