舒敏，劉煜敏，張洪，鄧敏，張仁偉

脂聯(lián)素干預(yù)改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的作用研究

舒敏，劉煜敏，張洪，鄧敏，張仁偉

目的：探討血管性癡呆（VD）大鼠腦組織脂聯(lián)素（APN）水平變化及其與腦微血管新生和認(rèn)知功能的關(guān)系。方法：45只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和APN組，各15只。模型組采用手術(shù)永久結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈的方法制備VD模型，APN組在造模后將攜帶APN基因的慢病毒載體注入大鼠尾靜脈。干預(yù)后8周，采用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的認(rèn)知功能，免疫組織化學(xué)法測(cè)定腦組織APN、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）和CD31的表達(dá)水平。結(jié)果與假手術(shù)組相比，模型組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，目標(biāo)象限停留的時(shí)間百分比縮短，腦組織APN表達(dá)水平下降，VEGF及CD31表達(dá)水平增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，APN組大鼠逃避潛伏期降低，目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比增加，大鼠腦組織APN、VEGF及CD31表達(dá)水平增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：APN干預(yù)有利于改善VD大鼠的認(rèn)知功能，可能與增加腦白質(zhì)血管形成有關(guān)。

脂聯(lián)素；血管性癡呆；認(rèn)知障礙；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類；大鼠

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由各種血管危險(xiǎn)因素包括年齡增加、糖尿病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和中風(fēng)等導(dǎo)致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙，脂聯(lián)素（adiponectin，APN）與以上危險(xiǎn)因素密切相關(guān)。APN是由脂肪細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，其血漿水平隨著年齡增加而下降，低APN水平增加中風(fēng)、高血壓、糖尿病等的風(fēng)險(xiǎn)。APN可延緩高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病的進(jìn)展[1]，降低VD的風(fēng)險(xiǎn)、改善認(rèn)知功能及VD相關(guān)的病理如腦血管功能障礙、受損的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及神經(jīng)炎癥。本研究主要通過(guò)觀察APN、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及CD31在大鼠腦內(nèi)的表達(dá)及APN對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響，探討APN在VD中的作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

攜帶APN基因的慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建；VEGF、CD31兔抗鼠抗體購(gòu)于abcam公司；二氨基聯(lián)苯胺顯色盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制作及分組 SPF級(jí)成年雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量200～250 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，正常環(huán)境飼養(yǎng)。大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組，模型組及APN組，各15只。采用手術(shù)永久結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈法制備VD模型，以10%水合氯醛常規(guī)麻醉動(dòng)物，手術(shù)鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，0號(hào)線結(jié)扎遠(yuǎn)、近心端，并從中間剪斷，縫合切口，放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組不結(jié)扎、不剪斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈，其他處理同模型組。APN組于造模后1周將攜帶APN基因的慢病毒載體（1.0×107Ifu）注入大鼠尾靜脈。

1.2.2 行為學(xué)檢測(cè) 干預(yù)后8周通過(guò)Morris水迷宮觀察大鼠行為學(xué)改變。定位航行試驗(yàn)：記錄大鼠找到水下隱藏平臺(tái)所需時(shí)間，即逃避潛伏期。如果大鼠在 60 s內(nèi)未到達(dá)平臺(tái)，記錄逃避潛伏期為60 s。取4次訓(xùn)練的平均值?？臻g探索試驗(yàn)：在第6天進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，記錄大鼠在60 s內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡、在原平臺(tái)象限游泳時(shí)間、進(jìn)入該象限的次數(shù)及所有象限總時(shí)間，算出目標(biāo)象限時(shí)間百分比。

1.2.3 組織取材 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后次日行常規(guī)多聚甲醛灌注取腦，全腦浸入4%多聚甲醛液中固定24 h后，石蠟包埋，冠狀切片，片厚4.5 μm，行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 使用免疫組化方法檢測(cè)樣本中APN、CD31、VEGF在腦白質(zhì)中的表達(dá)，表現(xiàn)為棕色顆粒沉淀。切片常規(guī)脫蠟，EDTA修復(fù)，BSA封閉，分別滴加一抗 APN（1:100）、VEGF（1:200）、CD31（1:100），4℃過(guò)夜，滴加相應(yīng)種屬的二抗，37℃溫箱孵育50 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封固。APN的表達(dá)通過(guò)測(cè)取每個(gè)視野的積分光密度（integrated option density，IOD），取5個(gè)視野的平均值；CD31和VEGF的表達(dá)通過(guò)測(cè)每個(gè)視野里的血管個(gè)數(shù)，取5個(gè)視野的平均值。使用軟件Image-Pro Plus檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

本研究模型大鼠存活24只，死亡6只，死亡率25%。與假手術(shù)組比較，模型組和APN組大鼠第4天起逃避潛伏期明顯較長(zhǎng)（P＜0.05），目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比低（P＜0.05）。與模型組比較，VPN組大鼠第5天逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05），目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比增加（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 大鼠水迷宮測(cè)試結(jié)果比較（±s）

表1 大鼠水迷宮測(cè)試結(jié)果比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別 只數(shù) 逃避潛伏期/s 平臺(tái)象限游泳時(shí)間百分比/%假手術(shù)組模型組APN組15 11 13第1天46.29±6.52 51.28±10.01 44.14±8.17第2天28.43±6.85 34.14±8.40 30.14±10.07第3天22.71±5.71 31.29±10.01 21.43±10.21第4天16.71±6.32 32.29±10.73①22.14±12.08①第5天13.86±6.44 31.57±8.98①18.71±7.95①②34.14±8.40 21.42±8.18①32.86±10.57①②

圖1 各組腦深部白質(zhì)及胼胝體APN免疫組化染色圖片（×200）

2.2 腦組織免疫組化染色結(jié)果

模型組大鼠腦深部白質(zhì)及胼胝體APN表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.05），APN組腦深部白質(zhì)及胼胝體APN表達(dá)水平高于對(duì)照組和模型組（均P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 CD31、VEGF免疫組化結(jié)果

模型組和APN組大鼠腦深部白質(zhì)及胼胝體VEGF、CD31表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05），APN組腦深部白質(zhì)及胼胝體VEGF、CD31表達(dá)水平高于模型組（均P＜0.05），見(jiàn)圖3、4。

3 討論

手術(shù)永久結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈法是常用的VD研究模型，術(shù)后大鼠形成慢性全腦低灌注狀態(tài)，主要的組織病理學(xué)改變是腦小血管病變和腦白質(zhì)病變，表現(xiàn)為明顯的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。腦小血管功能障礙及其引起的血腦屏障破壞會(huì)損害大腦的微環(huán)境，導(dǎo)致對(duì)缺血敏感的認(rèn)知關(guān)鍵區(qū)域腦組織（如皮質(zhì)下白質(zhì)、新皮質(zhì)、海馬）的損傷，出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損和認(rèn)知障礙[2,3]。額葉和基底核是腦小血管病的好發(fā)部位，認(rèn)知損害突出的特征是執(zhí)行功能障礙和精神運(yùn)動(dòng)遲緩，其與前額葉和基底核的聯(lián)系中斷有關(guān)。本研究顯示模型組大鼠逃避潛伏期長(zhǎng)，目標(biāo)象限游泳時(shí)間百分比顯著低，學(xué)習(xí)記憶障礙明顯。而給予APN干預(yù)后大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的損害有明顯的改善。

圖2 各組腦深部白質(zhì)及胼胝體APN蛋白表達(dá)水平比較

圖3 各組腦深部白質(zhì)及胼胝體VEGF免疫組化染色（×200）

圖4 各組腦深部白質(zhì)及胼胝體CD31免疫組化染色（×200）

表2 大鼠腦深部白質(zhì)和胼胝體CD31和VEGF蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 大鼠腦深部白質(zhì)和胼胝體CD31和VEGF蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組別 只數(shù)CD31VEGF假手術(shù)組模型組APN組15 11 13深部白質(zhì)5.75±0.25 11.18±1.24①17.00±2.50①②胼胝體5.25±1.25 11.00±1.50①16.83±1.61①②深部白質(zhì)6.44±0.10 8.75±1.75①14.25±1.75①②胼胝體1.75±0.75 4.33±0.79①8.50±1.50①②

本研究顯示模型組大鼠腦組織VEGF及CD31表達(dá)水平增加，說(shuō)明慢性腦低灌注狀態(tài)下VEGF表達(dá)上調(diào)，微血管代償性增生。VEGF作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)新生血管形成，增加腦灌注，減少神經(jīng)元凋亡或壞死，VEGF對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞還有直接營(yíng)養(yǎng)作用，促進(jìn)神經(jīng)組織再生[4]。給予外源性APN后,大鼠腦組織VEGF及CD31表達(dá)水平明顯增加，說(shuō)明APN促進(jìn)腦微血管形成，增加腦灌注，從而改善認(rèn)知功能。APN可以通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)、血管平滑肌細(xì)胞增殖及改善糖脂代謝等多重機(jī)制保護(hù)血管組織，參與血管損傷的修復(fù)，干預(yù)內(nèi)膜的增生和血管狹窄的進(jìn)展[5]。急性局灶性腦缺血的研究亦發(fā)現(xiàn)APN通過(guò)促進(jìn)血管形成[6,7]和抑制白質(zhì)炎性反應(yīng)[8]等機(jī)制修復(fù)缺血腦損傷，改善神經(jīng)功能缺損。有研究亦發(fā)現(xiàn)下丘腦乙酰膽堿水平與血清脂聯(lián)素水平直接相關(guān)[9]。Zhang等[10]報(bào)道，脂聯(lián)素激活脂聯(lián)素受體-1后通過(guò)p38MAPK和GSK-3β/β-catenin信號(hào)級(jí)聯(lián)刺激成年大鼠海馬神經(jīng)元的增殖。

總之，本研究結(jié)果提示，APN增加VEGF蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腦血管新生，從而改善VD大鼠認(rèn)知功能障礙。鑒于APN與血管性癡呆的危險(xiǎn)因素（包括衰老、糖尿病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和卒中等）之間的關(guān)系，尚需要進(jìn)一步研究APN在血管性癡呆中的作用。

[1] Song J,Lee WT,Park KA,et al.Association between Risk Factors for Vascular Dementia and Adiponectin[J].Biomed Res Int,2014,2014:261672.

[2] Gorelick PB,Scuteri A,Black SE,et al.Contributions to Cognitive Impairment and Dementia:A Statement for Healthcare Professionals From the American Heart Association/American Stroke Association[J].Stroke,2011,42:2672-2713.

[3]林瑯,黎紅華,武強(qiáng),等.慢性低灌注對(duì)大鼠腦白質(zhì)血管生成與血腦屏障的影響[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2016,11:9-11.

[4]沈雪玄,麓慧,秦榮印,等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)腦缺血的保護(hù)作用[J].國(guó)際腦血管病雜志,2014,22:704-708.

[5]Li FY,Cheng KK,Lam KS,et al.Cross-talk between adipose tissue and vasculature:role of adiponectin[J].Acta Physiol(Oxf),2011,203:167-180.

[6]Miao J,Shen LH,Tang YH,et al.Overexpression of adiponectin improves neurobehavioral outcomes after focal cerebral ischemia in aged mice[J].CNS Neurosci Ther,2013,19:969-977.

[7]Shen L,Miao J,Yuan F,et al.Overexpression of adiponectin promotes focal angiogenesis in the mouse brain following middle cerebral artery occlusion[J].Gene Ther,2013,20:93-101.

[8]Chen B,Liao WQ,Xu NA,et al.Adiponectin protects against cerebral ischemia-reperfusion injury through anti-inflammatory action[J].Brain Res,2009,1273:129-137.

[9]Sakr HF.Effect of sitagliptin on the working memory and reference memory in type 2 diabetic Sprague-Dawley rats:possible role of adiponectin receptors 1[J].J Physiol Pharmacol,2013,64:613-623.

[10]Zhang D,Guo M,Zhang W,et al.Adiponectin stimulates proliferation of adult hippocampal neural stem/progenitor cells through activation of the p38MAPK/GSK-3b/b-catenin signaling cascade[J].J Biol Chem,2011,286:44913-44920.

Effect of Adiponectin Intervention on Cognitive Function in Rats with Vascular Dementia

SHU Min,LIU Yu-min,ZHANG Hong,DENG Min,ZHANG Ren-wei.Department of Neurology,Zhongnan Hospital,Wuhan University,Wuhan 430071,China

Objective:To investigate the changes of adiponectin(APN)levels in brain tissue of rats with vascular dementia(VD),and its role with brain angiogenesis and cognitive function.Methods:VD model was prepared by permanent bilateral carotid artery ligation(2VO).The lentiviral vectors encoding APN gene was injected into rat's tail vein for APN intervention.Forty-five SD rats were randomly divided into sham group(sham-operated,n=15),VD group(2VO,n=15)and APN group(2VO+APN,n=15).The cognitive function of rats was recorded by Morris water maze.The expressions of APN,VEGF and CD31 protein were determined by immunohistochemistry.Results:Compared with those in sham group,the escape latency was prolonged and the percentage of time spending in the goal quadrant was shortened in VD group;the expression of APN protein in brain tissue decreased but the expressions of VEGF and CD31 protein in brain tissue increased(P＜0.05).Compared with those in VD group,APN intervention significantly reduced the escape latency and prolonged the percentage of time spending in the goal quadrant in APN group,and the expressions of APN,VEGF and CD31 proteins in brain tissue increased(P＜0.05).Conclu?sion:APN intervention can improve the cognitive function of rats with VD,which may be related to the increase of angiogenesis in white matter.

adiponectin;vascular dementia;cognitive impairment;vascular endothelial growth factors;rats

R741；R741.05；R743

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.06.003

武漢大學(xué)中南醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢430070

湖北省衛(wèi)計(jì)委項(xiàng)目（No.WJ2015MB10 1）

2017-06-12

舒敏shumin917@hot -mail.com

（本文編輯：唐穎馨）