袁蕊，李欣昱，王瀟，祝艷莎，李青云，樊紅彬

·論著·

鹽酸二甲雙胍對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

袁蕊1，李欣昱2，王瀟1，祝艷莎1，李青云2，樊紅彬2

目的：觀察鹽酸二甲雙胍（Met）對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）增殖的影響。方法：采用體外懸浮培養(yǎng)法獲得海馬NSCs，加入不同濃度Met進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)巢蛋白（Nestin）免疫熒光法鑒定細(xì)胞、觀察細(xì)胞增殖；CCK-8測(cè)定NSCs增殖。結(jié)果：體外培養(yǎng)NSCs高表達(dá)Nestin。Nestin與CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著Met濃度從5 μmol/L增加至10 μmol/L，NSCs數(shù)量逐漸增加。當(dāng)Met濃度為5 μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖數(shù)目最多且細(xì)胞活力最好。隨著Met濃度進(jìn)一步增至20 μmol/L，NSCs增殖能力逐漸下降。結(jié)論：在一定濃度范圍內(nèi)，Met能促進(jìn)海馬NSCs增殖。

鹽酸二甲雙胍；神經(jīng)干細(xì)胞；細(xì)胞增殖；海馬；大鼠

神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）具有自我更新與多向分化潛能的特點(diǎn)，可分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞[1]。海馬的齒狀回顆粒下層（subgranular zone，SGZ）是成體腦內(nèi)少數(shù)具有神經(jīng)生發(fā)活動(dòng)的區(qū)域之一，該區(qū)域的NSCs能分化成顆粒神經(jīng)元，其樹突生長(zhǎng)入齒狀回（dentate gyrus，DG）分子層，而軸突向CA3區(qū)投射并與CA3區(qū)錐體神經(jīng)元的樹突形成突觸，參與空間學(xué)習(xí)記憶與情感相關(guān)行為的調(diào)控[2]。

鹽酸二甲雙胍（Metformin，Met）作為一種常規(guī)的降糖藥物，被用于2型糖尿病的治療，具有良好的降糖效果及安全性。此外，Met還具有多種生物活性和藥用價(jià)值（如抗腫瘤，治療心力衰竭和心肌肥厚等），而且它還可透過(guò)血腦屏障并能被神經(jīng)細(xì)胞吸收[3]。多倫多兒童醫(yī)院的Miller等[4]報(bào)道稱長(zhǎng)期服用Met的成年小鼠海馬區(qū)域的神經(jīng)再生和新記憶的形成速度超越對(duì)照組，并由此推測(cè)Met或與之類似的物質(zhì)，可能會(huì)在一些疾病，如缺血性腦卒中、阿爾茨海默病中作為中樞神經(jīng)治療的候選藥物。另有研究提示缺血前/后連續(xù)3周給予Met均能顯著減小中動(dòng)脈缺血模型所致小鼠腦梗死面積[5]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)海馬NSCs給予Met藥物處理，觀察Met對(duì)海馬NSCs增殖的影響，從而為Met用于NSCs增殖分化及相關(guān)應(yīng)用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康成年大鼠，體質(zhì)量220～250 g，均由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，按雌雄比為3∶1隨機(jī)配對(duì)飼養(yǎng)后，取24～48 h內(nèi)新生大鼠，雌雄不限。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 Met溶解后，用DMEM/F-12（1∶1）培養(yǎng)液稀釋為終濃度為5、10和 20 μmol/L的干細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.1.3 試劑與儀器 試劑DMEM/F-12（1∶1）與B-27添加劑均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司。鼠抗Nestin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。FITC和TRITC標(biāo)記羊抗鼠IgG、山羊封閉血清購(gòu)自北京中杉金橋公司。CCK-8試劑盒、DAPI染色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。多聚賴氨酸溶液購(gòu)自徐州Vicmed公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 NSCs的分離與培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)[6]在無(wú)菌條件下將新生24～48 h的大鼠消毒后，于超凈臺(tái)內(nèi)斷頭取腦，置于含有冰冷PBS液的經(jīng)冰塊預(yù)冷后的培養(yǎng)皿內(nèi)，仔細(xì)去除血管和腦膜，分離出雙側(cè)海馬組織，將其放入4℃預(yù)冷的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并用DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基沖洗。將海馬組織剪碎，約1 mm×1 mm×1 mm，用拋光的改良式巴氏吸管輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，200目濾網(wǎng)過(guò)濾，以1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入37℃復(fù)溫的DMEF/F12完全培養(yǎng)基，即DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入20 μg/L EGF、20 μg/L bFGF、2%B27。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 25 mL的培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度、溫度37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖情況。培養(yǎng)至第3天時(shí)細(xì)胞半量換液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將原代培養(yǎng)干細(xì)胞懸液分別接種至24孔及96孔培養(yǎng)板，每組6個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL培養(yǎng)液，細(xì)胞密度為 5×103個(gè)/ 孔，分為0、5、10、20 μmol/L不同濃度Met處理組進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 NSCs鑒定 將培養(yǎng)3 d后的神經(jīng)干細(xì)胞球，吸去完全培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗3遍，每次5 min。用體積分?jǐn)?shù)為0.04多聚甲醛室溫固定15 min，PBS漂洗3次；體積分?jǐn)?shù)為0.001 Triton X-100室溫下破膜處理30 min后，PBS洗3次，每次5 min；用山羊血清室溫封閉 1 h，吸去血清，不洗；加入一抗（Nestin 1∶100），4℃過(guò)夜；PBS漂洗3次，加入熒光標(biāo)記二抗（抗體工作濃度1∶100），37 ℃避光孵育1 h；PBS漂洗 3 次，DAPI染核3～5 min；再用PBS漂洗3次，激光共聚焦顯微鏡觀察、照相。

1.2.4 CCK-8檢測(cè)不同濃度Met下海馬NSCs增殖 將接種至96孔板的神經(jīng)干細(xì)胞球吸去板內(nèi)培養(yǎng)液，每孔避光加入100 μL含體積分?jǐn)?shù)為0.1 CCK-8溶液的不同濃度Met NSCs完全培養(yǎng)液，37℃孵育4 h后終止培養(yǎng)。使用空白對(duì)照孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處吸光度值，結(jié)果以O(shè)D值表示。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值為結(jié)果。

1.2.5 免疫熒光觀察海馬NSCs增殖 將培養(yǎng)10 d后的細(xì)胞，用PBS緩沖液洗3遍，每次5 min。用體積分?jǐn)?shù)為0.04多聚甲醛室溫固定15 min，PBS漂洗3次；體積分?jǐn)?shù)為0.001 Triton X-100室溫下破膜處理 30 min后，PBS洗3次，每次5 min；用山羊血清室溫封閉1 h，吸去血清，不洗；加入一抗（Nestin 1∶100），4℃過(guò)夜；PBS漂洗3次，加入熒光標(biāo)記二抗（抗體工作濃度1∶100），37 ℃避光孵育1 h；PBS漂洗 3 次，DAPI染核 3～5 min；再用PBS漂洗3次，激光共聚焦顯微鏡觀察、照相。

1.3 圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

隨機(jī)選取不同濃度培養(yǎng)皿中的5個(gè)非重疊視野拍照（同一曝光值），計(jì)算出每個(gè)視野的Nestin陽(yáng)性細(xì)胞球數(shù)。采用SPSS 13.0軟件包處理數(shù)據(jù)，計(jì)量結(jié)果以（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，多組間比較行單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCs鑒定

傳代細(xì)胞克隆球經(jīng)Nestin間接免疫熒光染色，可見(jiàn)NSCs特異性標(biāo)記物Nestin陽(yáng)性，見(jiàn)圖1。

圖1 海馬NSCs的鑒定

2.2 NSCs增殖檢測(cè)

分別加入Met藥物濃度為0、5、10、20 μmol/L的干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，0、5、10、20 μmol/L組的細(xì)胞活力分別為（0.4013±0.0580）、（0.3637±0.9800）、（0.1760±0.0520）、（0.1397±0.0349），5 μmol/L組與 10 μmol/L組的細(xì)胞活力較0 μmol/L組明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中 5 μmol/L組活力最強(qiáng)，10 μmol/L組次之，隨著Met濃度的升高，細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，20 μmol/L組較0 μmol/L組則活力下降，見(jiàn)圖2。

圖2 CCK8檢測(cè)不同濃度Met培養(yǎng)細(xì)胞活性

2.3 免疫熒光觀察NSCs增殖

隨著Met濃度的升高，細(xì)胞的增殖表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)。與0 μmol/L組相比，當(dāng)Met的濃度為5 μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖最多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3、4。這說(shuō)明Met在體外能促進(jìn)海馬干細(xì)胞的增殖，且5 μmol/L藥物濃度較有效。

圖3 Nestin表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞球個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)

圖4 Nestin標(biāo)記不同濃度Met對(duì)培養(yǎng)10 d后的新生大鼠海馬NSCs球增殖影響

3 討論

NSCs存在于胚胎發(fā)育過(guò)程中以及包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物大腦內(nèi)。成人神經(jīng)發(fā)生過(guò)程受各種生理、病理和藥物刺激的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，NSCs參與生理和病理?xiàng)l件下神經(jīng)功能的定向分化。充分了解NSCs的生物學(xué)作用將為發(fā)現(xiàn)腦部疾病病因及主要的治療方法提供重要的見(jiàn)解[7]。近年研究表明，發(fā)育中及成年哺乳動(dòng)物包括室管膜、海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層下區(qū)、嗅球及皮質(zhì)等區(qū)域存在具有自我更新和分化潛能的NSCs，可終身存在神經(jīng)發(fā)生[8]，它們能夠分化成新的神經(jīng)元，從而發(fā)揮功能，通過(guò)外源性或內(nèi)源性的NSCs療法是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者中后期神經(jīng)修復(fù)的重要途徑[9]。研發(fā)理想的神經(jīng)保護(hù)劑減少神經(jīng)元損傷、促進(jìn)新生神經(jīng)元形成，以提高患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要的意義。成熟的神經(jīng)元不具備分裂和自我更新的能力，成年神經(jīng)再生主要是由NSCs分化為神經(jīng)元。就目前來(lái)看，外源性干細(xì)胞移植模式存在存活率低（2%～20%）和分化率低的問(wèn)題，且不能規(guī)避手術(shù)或致畸致瘤的風(fēng)險(xiǎn)，甚至涉及到倫理問(wèn)題[10]，因此近年來(lái)干細(xì)胞治療腦部疾病的研究重點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)至刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性NSCs的增殖和分化方向上來(lái)。

Met作為臨床常用的基礎(chǔ)降糖藥物，分別通過(guò)抑制糖異生、腸壁細(xì)胞攝取葡萄糖和促進(jìn)肌糖原合成三方面作用達(dá)到降糖的目的。除具有降糖作用外，大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)Met具有抗腫瘤、抗炎、促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及神經(jīng)保護(hù)等多種藥理活性[11-13]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同濃度Met培養(yǎng)基進(jìn)行新生大鼠海馬NSCs體外培養(yǎng)，觀察體外Met培養(yǎng)對(duì)海馬NSCs增殖的影響。既往在體及離體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表明，Nestin在NSCs生存和自我更新中具有重要功能，通過(guò)支持合適的NSCs生存，可促進(jìn)細(xì)胞的進(jìn)一步擴(kuò)增[14]。近期研究發(fā)現(xiàn)，Nestin通過(guò)激活MAPK和EGFR通路完成細(xì)胞的自我更新，P38-EGFR信號(hào)通路在Nestin維持的神經(jīng)祖細(xì)胞自我更新和增殖中起關(guān)鍵作用[15]。根據(jù)CCK-8在450 nm處酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度與活細(xì)胞數(shù)量成正比原理，當(dāng)細(xì)胞處于增殖階段時(shí)，可測(cè)定NSCs增殖結(jié)果，既往有實(shí)驗(yàn)證實(shí)通過(guò)CCK-8測(cè)定研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素可促進(jìn)NSCs增殖[16]。近期又有研究人員通過(guò)5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU）染色及CCK-8檢測(cè)方法分別識(shí)別和衡量細(xì)胞的增殖，探討高齡哺乳動(dòng)物對(duì)下一代海馬NSCs增殖能力影響的差異，從而證實(shí)年輕大鼠海馬NSCs增殖的細(xì)胞比例高于老年大鼠海馬NSCs[17]。本研究通過(guò)Nestin熒光標(biāo)記染色及CCK-8方法檢測(cè)不同濃度Met對(duì)海馬NSCs增殖的影響，結(jié)果顯示不同濃度Met處理后細(xì)胞增殖活性呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，具有明顯差異，其中5 μmol/L Met組最明顯，10 μmol/LMet組次之，而 20 μmol/L Met組對(duì)比未加藥組則呈明顯下降趨勢(shì)；通過(guò)對(duì)Nestin標(biāo)記后海馬神經(jīng)干細(xì)胞球計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)， 5 μmol/L Met組干細(xì)胞球數(shù)量最多。本研究結(jié)果表明Met能促進(jìn)NSCs的增殖，當(dāng)濃度為5 μmol/L時(shí)增殖活性最高。

然而，本研究也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Met濃度進(jìn)一步增加時(shí)，海馬NSCs增殖活性對(duì)比未加藥組呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，是否隨著Met濃度增高NSCs增殖出現(xiàn)抑制，該問(wèn)題仍須進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。本研究?jī)H觀察Met對(duì)新生大鼠海馬NSCs增殖的影響，對(duì)海馬NSCs的分化，以及其對(duì)進(jìn)一步的NSCs的定向分化是否有影響仍須繼續(xù)探討。有研究表明BDNF對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)具有重要作用，眾多研究已經(jīng)證實(shí)BDNF可以促進(jìn)NSCs的增殖和向神經(jīng)元定向分化并改善認(rèn)知[18,19]。同時(shí)有研究表明在成骨細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以激活A(yù)MPK調(diào)控Wnt/β-catenin這一經(jīng)典信號(hào)通路[20,21]。該信號(hào)通路不僅在促進(jìn)NSCs對(duì)稱分裂[22]、維持神經(jīng)元存活和死亡的平衡中起重要作用[23]，也可以通過(guò)調(diào)控micro RNAs的表達(dá)影響腦部發(fā)育和神經(jīng)再生[24,25]。二甲雙胍能否通過(guò)Wnt/β-catenin通路，從轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)BDNF表達(dá)，這對(duì)了解二甲雙胍促神經(jīng)發(fā)生作用的機(jī)制有重要意義，這仍需要繼續(xù)探討。

致謝 本實(shí)驗(yàn)于徐州醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心完成，感謝實(shí)驗(yàn)期間老師們?cè)谠囼?yàn)期間給予的支持與幫助。

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Effect of Metformin on Proliferation of Rat Hippocampal Neural Stem Cells

YUAN Rui1,LI Xinyu2,WANG Xiao1,ZHU Yan-sha1,LI Qing-yun2,FAN Hong-bin2.1.Graduate School,Xuzhou Medical University,Jiangsu 221000,China;2.Department of Neurology,Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University,Jiangsu 221000,China

Objective:To investigate the effect of Metformin(Met)on the proliferation of neural stem cells(NSCs)derived from rat hippocampus.Methods:Hippocampal NSCs were culturedin vitrowith different concentrations of Met.The proliferations of NSCs were detected by CCK-8 assay and immunofluorescence against Nestin.Results:Nestin was highly expressed in the NSCs culturedin vitro.Immunofluorescence and CCK-8 assays showed that the number of NSCs increased gradually with the increasing in Met concentration from 5 μmol/L to 10 μmol/L.Cell proliferation as well as cell viability were highest at 5 μmol/L concentration.However,the proliferation of NSCs decreased gradually with the increasing in Met concentration at 20 μmol/L.Conclusion:Metf could promote the proliferation of hippocampal NSCs in a certain concentration range.

metformin;neural stem cells;proliferation;hippocampus;rat

R741；R741.05

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.06.001

1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院江蘇 徐州 221000 2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科江蘇 徐州 221000

江蘇省衛(wèi)生科研項(xiàng)目（No.H201319）

2016-11-18

樊紅彬fandoc@126.com

（本文編輯：王晶）