韓 雪,張睦清,常 冰,王 茜,郝 蕾,劉 宇,石 鋮,郭秋紅,張一昕
(1. 河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院臨床中藥學(xué)教研室,河北 石家莊 050200;2. 河北省中醫(yī)院心血管內(nèi)科,河北 石家莊 050017;3.石家莊市中醫(yī)院心血管內(nèi)科,河北 石家莊 050017)
高脂血癥(hyperlipidemia,HLP)主要是指血漿中膽固醇(total cholesterol,TC)和(或)甘油三酯(triglyceride,TG)水平升高,其本質(zhì)是人體內(nèi)脂質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)的紊亂,屬于代謝性疾病,是導(dǎo)致脂肪肝、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心腦血管疾病的重要因素之一[1-2]。近年來(lái),人們攝入脂肪增多,但體力運(yùn)動(dòng)減少,使高脂血癥的發(fā)病率日益攀高。中醫(yī)藥在防治高脂血癥方面較西藥有明顯優(yōu)勢(shì),研究發(fā)現(xiàn)[3],澤瀉、白術(shù)作為藥對(duì)單獨(dú)使用或與他藥配伍使用治療高脂血癥的情況尤其多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)主要從肝臟過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor-α,PPARα)途徑入手,觀察澤瀉湯(Rhizoma Alismatis decoction,RAD)對(duì)肝臟PPARα和其下游基因乙酰輔酶A氧化酶(acyl CoA oxidase,ACO)基因和蛋白表達(dá)的影響,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
1.1動(dòng)物健康♂ SD大鼠50只,體質(zhì)量160~180 g,購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為1209029。
1.2藥物澤瀉、白術(shù)兩味中藥,購(gòu)于石家莊市樂(lè)仁堂藥店,水煎濃縮至所需濃度。血脂康膠囊(批號(hào):20120701),以蒸餾水配制所需濃度。
1.3試劑TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol ,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司);TRIzol(Invitrogen公司);DEPC(Sigma公司);RT Reagents、PCR Reagents、DNA Marker(TaKaRa公司);兔抗PPARα抗體(美國(guó)Bioworld公司)、兔抗ACO抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。
1.4儀器VANOX AHB-LB型顯微鏡(日本OLYMPUS公司);RM2345石蠟切片機(jī)(LEICA公司);PE9600型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司);凝膠圖像分析系統(tǒng)(法國(guó)VL公司BIO-PROFIF)等。
2.1動(dòng)物分組及造模將50只大鼠隨機(jī)分為5組,即:空白對(duì)照組(Control)、模型對(duì)照組(Model)、澤瀉湯高劑量組(H-RAD)、澤瀉湯低劑量組(L-RAD)、血脂康對(duì)照組(XZK),每組10只。空白組喂飼普通飼料,其余以高脂飼料(參照文獻(xiàn)[4]1.5%膽固醇、0.5%豬膽酸鈉、88%普通飼料、10%豬油)喂飼造模,共4周。
2.2給藥方法及標(biāo)本采集自造模d 1開(kāi)始,澤瀉湯各劑量組和血脂康組分別給予相應(yīng)藥物灌胃,用藥劑量為21.0、10.5、0.2 g·kg-1,空白組和模型組灌服等量蒸餾水,每日1次,用藥體積為10 mL·kg-1。4周末,10%水合氯醛麻醉,股動(dòng)脈取血,分離血清。同時(shí)迅速剖取肝臟,取部分肝組織,液氮凍存,另取大小適宜的肝組織固定于4%多聚甲醛液中。
2.3檢測(cè)指標(biāo)及方法
2.3.1血清脂質(zhì)含量的檢測(cè) 酶法測(cè)定血清TC、TG、HDL、LDL的含量。
2.3.2肝組織形態(tài)學(xué)的觀察 取在4%多聚甲醛中固定的肝組織,HE染色,光鏡下觀察肝組織形態(tài)的改變。
2.3.3肝組織PPARα mRNA、ACO mRNA表達(dá)的檢測(cè) 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法測(cè)定肝臟PPARα mRNA和ACO mRNA的表達(dá)。細(xì)胞總RNA提取采用TRIzol一步法。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,以β-actin作為內(nèi)對(duì)照,計(jì)算相對(duì)含量。
2.3.4肝組織PPARα、ACO蛋白表達(dá)的檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū),提取肝組織細(xì)胞核蛋白,常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳,采用半干轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)至PVDF膜,小心取出轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中,室溫、搖床上緩慢搖動(dòng)狀態(tài)下封閉2 h。加入一抗孵育過(guò)夜,PBST洗滌3次,每次10 min,加入二抗孵育90 min,PBST洗滌3次,每次10 min,應(yīng)用ECL 發(fā)光試劑盒反應(yīng),經(jīng)X線片曝光,顯影液、定影液顯色后,根據(jù)條帶的亮度以及背景情況可以再次選擇曝光時(shí)間進(jìn)行二次曝光。用Tanon Gis軟件分析X線片上的條帶灰度值。
3.1各組大鼠血清脂質(zhì)水平模型組大鼠血清TC、TG和LDL的含量均高于空白組(P<0.01),HDL含量低于空白組(P<0.01);用藥后,澤瀉湯各劑量組及血脂康組大鼠血清TC、TG、LDL含量均明顯降低(P<0.01),HDL含量均明顯升高(P<0.01)。其中,低劑量組TC和TG含量均高于血脂康組和高劑量組(P<0.01);低劑量組的LDL含量高于血脂康組和高劑量組(P<0.01)。見(jiàn)Tab 1。
3.2各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化如Fig 1所示,空白組大鼠肝小葉清晰可見(jiàn),肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,排列成肝索。模型組大鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)彌漫性脂肪變性,可見(jiàn)大泡型脂肪滴,細(xì)胞核偏離中心。澤瀉湯各劑量組與血脂康組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度均有所減輕。
Tab 1 Content of TC, TG, HDL and LDL in serum of HLP rats(±s,n=10)
##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsmodel;△△P<0.01vsXZK
3.3各組大鼠肝組織PPARα和ACOmRNA的表達(dá)如Fig 2所示,模型組大鼠PPARα和ACO mRNA的表達(dá)均弱于空白組(P<0.01)。用藥后,澤瀉湯各劑量組和血脂康組PPARα和ACO mRNA的表達(dá)均強(qiáng)于模型組(P<0.01)。
3.4各組大鼠肝組織PPARα和ACO蛋白的表達(dá)如Fig 3所示,模型組大鼠PPARα和ACO的蛋白表達(dá)均弱于空白組(P<0.01)。用藥后,澤瀉湯各劑量組和血脂康組PPARα和ACO的蛋白表達(dá)均強(qiáng)于模型組(P<0.01)。
Fig 1 Effects of RAD on histopathological changes of rat heart stained with HE
A: Control group; B Model group; C: H-RAD 21.0 g·kg-1group; D: L-RAD 10.5 g·kg-1group; E: XZK 0.2 g·kg-1group
Fig 2 Expression of PPARα mRNA and ACO mRNA in hepatic tissues of HLP rats(±s,n=10)
1: Control group; 2: Model group; 3: H-RAD 21.0 g·kg-1group; 4: L-RAD 10.5 g·kg-1group; 5: XZK 0.2 g·kg-1group.##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsmodel
Fig 3 The protein expression of PPARα and ACO in hepatic tissues of HLP rats(±s, n=10)
1: Control group; 2: Model group; 3: H-RAD 21.0 g·kg-1group; 4: L-RAD 10.5 g·kg-1group; 5: XZK 0.2 g·kg-1group.##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsmodel
高脂血癥為西醫(yī)病名,從中醫(yī)學(xué)的理論進(jìn)行分析,高脂血癥可歸屬“痰濁”、“血瘀”等范疇,尤其是與內(nèi)生痰濁關(guān)系密切。筆者認(rèn)為,高脂血癥的發(fā)病之所以呈逐年上升趨勢(shì),其原因在于生活水平的提高,人們攝入過(guò)多的高脂高熱量食物;久坐(臥)少動(dòng),身體缺乏鍛煉;工作壓力的增大和欲望的日益增多,情緒失衡,致使肝氣失于條暢等,漸至戧伐正氣,脾失健運(yùn),肝失疏泄,氣血津液運(yùn)行失常,體內(nèi)津液的輸布或代謝出現(xiàn)障礙,則濕聚為飲生痰,痰濕脂濁稽留于里,注入血液,遂致血脂不斷升高。因此,脾虛痰濕內(nèi)盛為本病的主要病理基礎(chǔ),健脾祛濕消痰為本病標(biāo)本兼治的有效方法。臨床資料表明[3],澤瀉與白術(shù)作為高頻藥對(duì)應(yīng)用于臨床治療高脂血癥,取得了較好的治療效果。經(jīng)方澤瀉湯原主治“心下有支飲,其人苦冒?!钡牟“Y,從其組成分析,澤瀉功能利水滲濕消痰,白術(shù)有健脾燥濕利水之效,兩藥合用健脾、祛濕、化痰,與高脂血癥的發(fā)病機(jī)制頗為吻合,故選用其作為治療高脂血癥的基本方劑開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究。
由于進(jìn)食過(guò)多的熱量,促進(jìn)TG的合成導(dǎo)致肥胖,而肥胖者體內(nèi)的脂肪堆積使脂肪分解更加活躍,釋放更多的游離脂肪酸(free fatty acids,F(xiàn)FA),血中FFA 增加引發(fā)血脂紊亂[5]。PPARs作為核受體超家族的一員,是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子,有3種亞型,包括PPAR-α、PPAR-β/δ及PPAR-γ[6-7]。其中,PPARα在肝細(xì)胞中高水平表達(dá),可參與眾多生化反應(yīng)及生物調(diào)節(jié)過(guò)程,調(diào)節(jié)脂類的攝取、氧化和脂肪的生成[8-9],還可通過(guò)調(diào)控基因編碼線粒體脂肪酸β-氧化途徑保護(hù)心肌[10]。當(dāng)PPARα被活化后與配體形成異二聚體[11],可調(diào)控參與脂代謝的多種基因編碼的蛋白質(zhì),如脂肪酸轉(zhuǎn)位酶、乙酰輔酶A氧化酶等[12],從而介導(dǎo)TG和脂肪酸的分解代謝[13]。乙酰輔酶A氧化酶就是其中一個(gè)受PPARα調(diào)控的酶,也是β-氧化的關(guān)鍵酶,能增強(qiáng)β氧化,減少TG合成所需的乙酰輔酶A酯,進(jìn)而影響TG的合成。PPARα被激活后,可直接增加脂肪酸的氧化,減少脂肪的積聚,維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[14],同時(shí)激活其下游基因ACO的表達(dá),進(jìn)而減少TG的合成。
本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠血清TC、TG、LDL含量均明顯升高,HDL含量及肝組織PPARα、ACO的基因和蛋白表達(dá)明顯降低;治療后,澤瀉湯各劑量組大鼠血清TC、TG、LDL含量明顯降低,而HDL含量及肝細(xì)胞PPARα和ACO的表達(dá)明顯升高,提示該方具有調(diào)節(jié)血脂作用,其作用機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)PPARα的表達(dá),激活其下游基因ACO的表達(dá),促進(jìn)脂肪氧化分解,減少脂質(zhì)合成,以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)血脂的目的,但其深入的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。
(致謝:本實(shí)驗(yàn)在河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心開(kāi)展,感謝各位老師和同學(xué)的幫助與支持。)
[1] Jain K S, Kathiravan M K, Somani R S, et al. The biology and chemistry of hyperlipidemia[J].BioorgMedChem, 2007,15(14):4674-99.
[2] 卓俊城,曾曉會(huì),曾巧煌,等. Trition WR-1399通過(guò)影響VLDL-C代謝通路和RCT誘導(dǎo)急性 HLP小鼠模型的研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2017,33(3):433-9.
[2] Zhuo J C,Zeng X H,Zeng Q H, et al. Study on hyperlipidemia mice models induced by Trition WR-1399 via VLDL-C metabolic pathway and reverse cholesterol transport[J].ChinPharmacolBull,2017,33(3):433-9.
[3] 侯明奇, 崔 亮, 薛 潔. 近10年高脂血癥中醫(yī)證治用藥規(guī)律的文獻(xiàn)研究[J].新疆中藥,2011,29(2):83-5.
[3] Hou M Q,Cui L,Xue J. Literature-based research on medication law of hyperlipemia in recent 10 years[J].XinjiangTraditChinMed, 2011,29(2):83-5.
[4] 張 東,武海軍,陳士萍,等.大鼠實(shí)驗(yàn)性高脂血癥5種造模方法的比較[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2007,23(9):1254-6.
[4] Zhang D,Wu H J,Chen S P, et al.Comparison of the five models on experimental hyperlipidemia rats[J].ChinPharmacolBull, 2007,23(9):1254-6.
[5] 秦 佑, 楊瑞儀, 陳梅果,等. 樹(shù)豆酮酸A抑制 3T3-L1細(xì)胞脂肪合成與分解的作用研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2016,32(2):189-93.
[5] Qin Y,Yang R Y, Chen M G, et al.Inhibitory effect of cajanonic acid A on lipogenesis and lipolysis in 3T3-L1 adipocytes[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(2):189-93.
[6] 馬晶晶, 章 濤. PPAR-γ功能與疾病關(guān)系研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2012,28(5):601-4.
[6] Ma J J,Zhang T. Function of PPARγ and its relationship with diseases: a present review[J].ChinPharmacolBull, 2012,28(5) : 601-4.
[7] Qi C, Zhu Y, Reddy J K, et al. Peroxisome proliferator-activated receptors, coactivators, and downstream targets[J].CellBiochemBiophys, 2000,32:187-204.
[8] 邢立國(guó),吳英良.過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體激動(dòng)劑類藥物的致癌性和致癌機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2014,28(3): 455-61.
[8] Xing L G, Wu Y L. Progress of carcinogenesis and possible mechanisms of peroxisome proliferator-activated receptor agonists[J].ChinJPharmacolToxicol,2014,28(3): 455-61.
[9] Leone T C,Weinheimer C J,Kelly D P. A criticall role for the peroxisome proliferator-activated receptor alpha(PPARalpha) in the cellular fasting response: the PPARaIpha-null mouse as a model of fatty acid oxidation disorders[J].ProcNatlAcadSciUSA,1999,96(13):7473-8.
[10] 李葉麗,王穎婉,李意奇,等. 蛇床子素可能通過(guò)上調(diào)PPARα和PPAR-γ的表達(dá)減輕野百合堿所致大鼠右心室重構(gòu)[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2015,31(9) : 1270-2.
[10] Li Y L, Wang Y W, Li Y Q, et al. Osthole could attenuate right ventricle remodeling in monocrotaline-treated rats by up-regulating PPARα and PPAR-γ[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(9):1270-2.
[11] Lee C K, Klopp R G, Weindruch R, et al. Gene expression profile of aging and its retardation by caloric restriction[J].Science, 1999,285(5432): 1390-3.
[12] 師凌云,田 蜜,常 偉,等. 小檗堿對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因PPARα和CPTIA表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2008,24(11):1461-4.
[12] Shi L Y, Tian M, Chang W, et al. Effect of berberine on the expression of lipid metabolism-associated gene PPARα and CPTIA[J].ChinPharmacolBull, 2008,24(11):1461-4.
[13] Rubins H B, Robins J, Collins D, et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol[J].NEnglJMed, 1999,341(6): 410-8.
[14] Zardi E M, Navarini L, Sambataro G, et al. Hepatic PPARs: their role in liver physiology, fibrosis and treatment[J].CurrMedChem, 2013,20(27):3370-96.