蔡瑤瑤 徐欣欣 吳雪清

盆腔神經(jīng)損傷與IL-10相互作用在子宮腺肌病中的研究

蔡瑤瑤 徐欣欣 吳雪清

目的 研究子宮腺肌病患者宮骶韌帶及輸卵管峽部神經(jīng)損傷情況及血清IL-10水平，為子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路。方法 選取因子宮腺肌病行腹腔鏡下全子宮+雙側(cè)輸卵管切除術(shù)的33例患者作為實驗組，同期因子宮頸上皮內(nèi)腫瘤III級及子宮肌瘤行相同手術(shù)的32例患者作為對照組，拍攝并記錄兩組患者腹腔鏡下宮骶韌帶形態(tài)學(xué)改變，測定宮骶韌帶及輸卵管峽部蛋白基因產(chǎn)物9.5（PGP 9.5）表達(dá)情況，并采用ELISA法測定兩組患者血清IL-10水平。結(jié)果 實驗組患者宮骶韌帶在腹腔鏡下表現(xiàn)為不同程度的損傷及中斷，輸卵管峽部黏膜層和肌層PGP 9.5表達(dá)的陽性率及神經(jīng)纖維密度較對照組明顯減少（均P＜0.05）。兩組患者輸卵管漿膜層PGP 9.5表達(dá)的陽性率及神經(jīng)纖維密度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。兩組患者宮骶韌帶PGP 9.5表達(dá)的陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），實驗組患者在血管壁周圍可見異常增生的神經(jīng)纖維和血管壁增厚及管腔狹窄。實驗組患者血清IL-10水平較對照組明顯上升（P＜0.05）。結(jié)論 子宮腺肌病患者宮骶韌帶神經(jīng)、輸卵管近端黏膜層及肌層處神經(jīng)即宮骶韌帶上行的神經(jīng)通路出現(xiàn)不同程度的損傷，且血清IL-10水平明顯升高，盆腔神經(jīng)損傷與炎癥相互作用可能與子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

子宮腺肌病 宮骶韌帶 神經(jīng)纖維 神經(jīng)損傷 IL-10

子宮腺肌病是子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)侵入子宮肌層，在激素的影響下發(fā)生出血、肌纖維結(jié)締組織增生，形成彌漫或局限性的病變，是婦科常見病之一，好發(fā)于40～50歲經(jīng)產(chǎn)婦。其主要臨床表現(xiàn)為經(jīng)量增多、經(jīng)期延長和進(jìn)行性痛經(jīng)，還可伴有慢性盆腔痛、性交痛等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。近年來，該病發(fā)病率呈上升趨勢，其病因與發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚[2]。神經(jīng)纖維的異常分布及機(jī)體的免疫反應(yīng)異常成為近年來研究的熱點之一。蛋白基因產(chǎn)物9.5（PGP 9.5）是高度特異性的神經(jīng)標(biāo)志物，可檢測有髓神經(jīng)纖維（包括 Aa、Aβ、Ay、Aδ、B）與無髓神經(jīng)纖維（包括C）[3]。神經(jīng)損傷后會分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)自我修復(fù)，IL-10是主要的抗炎癥因子之一，在很多慢性疾病及惡性腫瘤中充當(dāng)重要角色[4]。本研究旨在通過檢測子宮腺肌病患者宮骶韌帶及輸卵管峽部PGP 9.5表達(dá)情況及血清IL-10的水平，從而探討盆腔神經(jīng)損傷、血清IL-10水平與子宮腺肌病的關(guān)系，為子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2014年10月至2016年5月在本院行腹腔鏡下全子宮+雙側(cè)輸卵管切除術(shù)的子宮腺肌病患者 33 例作為實驗組，年齡 37～57（45.9±4.2）歲，人工流產(chǎn)次數(shù) 0～10（1.5±1.8）次，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診。選擇同期行腹腔鏡下全子宮+雙側(cè)輸卵管切除術(shù)的子宮頸上皮內(nèi)腫瘤Ⅲ級及子宮肌瘤患者32例作為對照組，年齡 32～57（47.5±3.9）歲，人工流產(chǎn)次數(shù) 0～2（0.6±0.7）次，并排除術(shù)后病理診斷為盆腔子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病的患者。兩組患者年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。兩組患者均無吸煙史，無神經(jīng)疾病史，無盆腔手術(shù)史及盆腔炎病史，術(shù)前6個月內(nèi)均未服用性激素類藥物，未放置宮內(nèi)節(jié)育器。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)和患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 腹腔鏡采圖方法 術(shù)中連接腹腔鏡機(jī)組拍攝并記錄宮骶韌帶形態(tài)學(xué)改變及鄰近腹膜表面的血管新生情況。

1.2.2 免疫組織化學(xué)測定 兩組患者均行全子宮+雙側(cè)輸卵管切除術(shù)，術(shù)中避免牽拉和電損傷輸卵管組織，將標(biāo)本固定在甲醛溶液中24h后，選取輸卵管峽部約5mm的組織及宮骶韌帶組織，取材過程中避開術(shù)中電凝組織部分。組織經(jīng)10%甲醛固定、脫水、浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，以4μm厚連續(xù)切片。采用免疫組織化學(xué)En－Vision兩步法，一抗為 PGP 9.5抗體（1∶200稀釋，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），以PBS代替一抗作為陰性對照，4℃冰箱孵育過夜，滴加二抗，37℃孵育10min，用二氨基聯(lián)苯氨（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染。

1.2.3 神經(jīng)纖維密度測定 采用Olympus BX43光學(xué)顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)（北京瑞科中儀科技有限公司）對免疫組織化學(xué)切片進(jìn)行計數(shù)并拍片。神經(jīng)纖維密度的計算方法：先在低倍鏡（×100）下選取PGP 9.5陽性高表達(dá)區(qū)，再轉(zhuǎn)換成高倍鏡下（×400）計數(shù)視野中神經(jīng)纖維的數(shù)目，根據(jù)標(biāo)尺長度計算400倍視野的實際面積為0.237mm2，用所計數(shù)的神經(jīng)纖維數(shù)目除以0.237mm2，計算得到每mm2組織中神經(jīng)纖維的數(shù)量，即神經(jīng)纖維密度。計數(shù)5個高倍視野下PGP 9.5陽性神經(jīng)纖維數(shù)，并計算平均神經(jīng)纖維密度。

1.2.4 血清IL-10水平測定 無菌狀態(tài)下采取實驗組患者21例及對照組患者19例靜脈血5ml（排除兩組患者中有免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病等其他系統(tǒng)慢性疾病史及肝腎功能異常者），以3 000r/min離心10min，取上清液-80℃保存待測。采用ELISA法測定血清中的IL-10水平，試劑盒由上海西唐生物有限公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。兩組輸卵管神經(jīng)纖維密度的檢測結(jié)果以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；兩組患者輸卵管峽部及宮骶韌帶PGP 9.5表達(dá)的陽性率比較采用χ2檢驗；兩組患者血清IL-10水平比較采用Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹腔鏡下兩組患者宮骶韌帶的形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 對照組患者宮骶韌帶形態(tài)正常，表現(xiàn)為光滑的、對稱的、完整的拱形，鄰近的腹膜表面光滑（見圖1a）。實驗組患者的宮骶韌帶表現(xiàn)為不同程度的損傷或中斷，包括一側(cè)或兩側(cè)宮骶韌帶縮短、僵硬、消失等，覆蓋于韌帶表面的腹膜、鄰近宮骶韌帶的腹膜和輸卵管系膜表面出現(xiàn)新生血管（見圖 1b-d）。

2.2 兩組患者輸卵管峽部各層組織PGP 9.5表達(dá)的陽性率及神經(jīng)纖維密度比較 實驗組患者輸卵管黏膜層和肌層PGP 9.5表達(dá)的陽性率及神經(jīng)纖維密度較對照組明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；兩組患者輸卵管漿膜層PGP 9.5表達(dá)的陽性率及神經(jīng)纖維密度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1和圖2。

2.3 兩組患者宮骶韌帶PGP 9.5表達(dá)的陽性率比較 實驗組33例患者中，PGP 9.5陽性表達(dá)7例，PGP 9.5表達(dá)的陽性率為21.2%，在血管壁周圍可見異常增生的神經(jīng)纖維和血管壁增厚及管腔狹窄。對照組32例患者中，PGP 9.5陽性表達(dá)26例，PGP 9.5表達(dá)的陽性率為81.3%，兩組患者宮骶韌帶PGP 9.5表達(dá)的陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3。

2.4 兩組患者血清IL-10水平比較 與對照組比較，實驗組患者血清IL-10水平明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖 4。

圖1 腹腔鏡下兩組患者宮骶韌帶的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（a：對照組，表現(xiàn)為光滑的、對稱的、完整的拱形；b：兩側(cè)宮骶韌帶完全消失，類似瘢痕組織質(zhì)地僵硬，腹膜表面出現(xiàn)新生血管；c：右側(cè)宮骶韌帶起源處中斷，兩側(cè)不對稱，子宮直腸陷凹見淡黃色的腹腔液；d：兩側(cè)宮骶韌帶稍增粗，失去正常拱形，子宮直腸陷凹見淡黃色的腹腔液，鄰近宮骶韌帶的腹膜表面出現(xiàn)新生血管）

表1 兩組患者輸卵管峽部各層組織PGP 9.5表達(dá)的陽性率及神經(jīng)纖維密度比較

圖2 兩組患者輸卵管峽部各層組織PGP 9.5免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)纖維分布情況[a：對照組患者輸卵管峽部全層（×40）；b：對照組患者輸卵管峽部黏膜層及內(nèi)側(cè)肌層（×100）；c：實驗組患者輸卵管峽部全層（×40）；d：實驗組患者輸卵管峽部黏膜層及內(nèi)側(cè)肌層（×100）；箭頭所指為陽性神經(jīng)纖維]

圖3 兩組患者宮骶韌帶PGP 9.5免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)纖維分布情況[a：對照組患者宮骶韌帶(×40），表現(xiàn)為聚集的神經(jīng)纖維束；b：對照組患者宮骶韌帶（×100）；c：實驗組患者宮骶韌帶神經(jīng)纖維消失(×40）；d：實驗組患者在血管壁周圍可見異常增生的神經(jīng)纖維和血管壁增厚及管腔狹窄（×40）；箭頭所指為陽性神經(jīng)纖維]

3 討論

盆腔自主神經(jīng)由下腹腔神經(jīng)、盆腔內(nèi)臟神經(jīng)、盆腔神經(jīng)叢及其分支構(gòu)成。支配盆腔內(nèi)臟的副交感神經(jīng)由椎體S2～S4發(fā)出，和下腹腔神經(jīng)匯合形成盆腔神經(jīng)叢。盆腔神經(jīng)叢走行在輸尿管與子宮動脈交叉處的下方，跨過輸尿管根部后與髂內(nèi)血管伴行[5]，隨后發(fā)出兩個分支，其中一個分支與宮骶韌帶側(cè)面伴行而上，到達(dá)子宮后走行在子宮內(nèi)膜－肌層之間，延伸到宮角處并支配輸卵管近端；另一個分支沿著主韌帶和子宮動脈走行，在子宮內(nèi)分布于子宮漿膜層下[6]。輸卵管的遠(yuǎn)端神經(jīng)由卵巢神經(jīng)跨過輸卵管系膜游離端支配[6]。困難的陰道分娩、長期的便秘、刮宮等會損傷宮骶韌帶及其上行的子宮內(nèi)膜－肌層之間的神經(jīng)，造成支配輸卵管神經(jīng)的損傷[7-8]，與子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

圖4 兩組患者血清IL-10水平比較（水平線代表中位數(shù)。與對照組比較，*P＜0.05）

在一項子宮腺肌病風(fēng)險因素調(diào)查中，研究者發(fā)現(xiàn)刮宮、子宮內(nèi)膜切除、剖宮產(chǎn)、肌瘤剔除等子宮手術(shù)使患腺肌病的風(fēng)險增加（OR=1.37）[9]。子宮腺肌病患者子宮內(nèi)側(cè)肌層肌纖維排列紊亂，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，提示子宮內(nèi)膜-肌層交界帶存在超微結(jié)構(gòu)的損傷[10]。困難的陰道分娩可能引起閉孔內(nèi)側(cè)處肛提肌肌腱和下腹腔神經(jīng)叢分支損傷。神經(jīng)損傷后在血管壁周圍出現(xiàn)異常的神經(jīng)再生，可能與慢性盆腔疼痛、月經(jīng)紊亂、陰道和外陰疼痛以及膀胱刺激癥狀和腸道刺激癥狀密切相關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)慢性便秘模型大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢PGP 9.5表達(dá)陽性與對照組相比明顯下降，提示發(fā)生慢性便秘時PGP 9.5表達(dá)陽性降低，可能與神經(jīng)元數(shù)目減少和（或）變性有關(guān)[12]。人工流產(chǎn)過程中對宮頸過度牽拉，或藥物流產(chǎn)過程中子宮過度收縮，以及長期的便秘等可造成一側(cè)或雙側(cè)宮骶韌帶及其包含的神經(jīng)出現(xiàn)損傷[7]。另外人工流產(chǎn)術(shù)中過度搔刮宮腔、吸宮時間過長、吸宮負(fù)壓過高，可造成子宮內(nèi)膜基底部的損傷與子宮內(nèi)膜的炎癥感染，可能會損傷子宮內(nèi)膜－肌層之間的神經(jīng)，導(dǎo)致輸卵管近端肌層處神經(jīng)減少或缺失。Barcena等[13]發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病患者中子宮肌層交感神經(jīng)纖維密度較非腺肌病患者相比有所減少。輸卵管峽部起著“閥門”的作用，通過交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)控制輸卵管峽部-壺腹部連接處，從而來調(diào)節(jié)精卵的運輸過程[14]。內(nèi)異癥患者輸卵管峽部異常的神經(jīng)分布，通過干擾神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，影響輸卵管的蠕動功能及纖毛的擺動，可能是內(nèi)異癥患者不孕的發(fā)病機(jī)制之一[15]。

有研究發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病患者子宮峽子宮內(nèi)膜-肌層交界處無神經(jīng)分布[7]。本研究采用PGP 9.5免疫組織化學(xué)染色法對兩組患者宮骶韌帶及輸卵管峽部神經(jīng)纖維做特異性染色，研究發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病患者宮骶韌帶神經(jīng)纖維較對照組減少，且輸卵管峽部黏膜層及肌層PGP 9.5表達(dá)明顯減少，而輸卵管漿膜層的神經(jīng)分布無明顯差別。在神經(jīng)嚴(yán)重?fù)p傷后，機(jī)體有修復(fù)的過程，但神經(jīng)的再生往往難以調(diào)控，容易過度增生。血管受神經(jīng)支配，所以在該研究中發(fā)現(xiàn)在血管壁周圍可見異常增生的神經(jīng)纖維和血管壁增厚及管腔狹窄。與本次研究相符，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分子宮腺肌病患者病灶邊緣可以觀察到小直徑神經(jīng)纖維局部增殖，提示該病灶處的神經(jīng)纖維在損傷后有再生的可能[7]，這也可能是引起慢性盆腔疼痛、痛經(jīng)、性交痛及不孕等臨床癥狀的原因[16]。

神經(jīng)損傷后會分泌多種細(xì)胞因子如IL-10、IL-6、激肽蛋白B、神經(jīng)生長因子等促進(jìn)自我修復(fù)[17]。IL-10是主要的抗炎細(xì)胞因子之一，屬于細(xì)胞因子中的干擾素家族，抑制中性粒細(xì)胞中炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。它是由活化的巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞等分泌的一種具有多種生物活性的Th2型細(xì)胞因子，可拮抗Th1型細(xì)胞應(yīng)答及其細(xì)胞因子的產(chǎn)生，是一種公認(rèn)的介導(dǎo)免疫抑制的細(xì)胞因子[4，18]，研究發(fā)現(xiàn)腺肌病患者在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜上皮細(xì)胞中，IL-10的表達(dá)顯著升高，認(rèn)為IL-10通過免疫抑制機(jī)制使異位病灶在腹腔或子宮肌層中逃避機(jī)體免疫攻擊，使得異位病灶不能及時被清除，從而持續(xù)生長，形成了子宮內(nèi)膜異位癥[4，18]。Weiss等[19]研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，內(nèi)異癥患者腹腔液中IL-10的表達(dá)明顯增高并且參與了免疫調(diào)節(jié)。Suen等[20]研究發(fā)現(xiàn)IL-10水平在內(nèi)異癥患者血清中明顯升高，子宮內(nèi)局部IL-10高表達(dá)促進(jìn)內(nèi)異癥小鼠模型中異位病灶生長。與該研究相符，本研究發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病患者血清IL-10較非腺肌病患者顯著增加。Carrarelli等[21]研究發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病病灶中炎癥因子IL-1β、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、尿促皮素mRNA表達(dá)增加，神經(jīng)因子異常表達(dá)與炎癥相互作用可能是子宮腺肌病發(fā)病機(jī)制之一。另Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)炎癥、神經(jīng)生長因子、血管的生成可能與腺肌病小鼠模型中子宮內(nèi)異常的神經(jīng)分布相關(guān)。內(nèi)異病灶和神經(jīng)之間的相互作用可能是通過炎癥介導(dǎo)，一系列炎癥反應(yīng)與感覺神經(jīng)相互作用，可能會增加外周神經(jīng)的敏感性，并在內(nèi)異癥相關(guān)疼痛中起到重要作用[23]。神經(jīng)損傷與炎癥相互作用，促進(jìn)子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，人工流產(chǎn)、刮宮、困難的陰道分娩、長期的便秘等會損傷宮骶韌帶及其上行的子宮內(nèi)膜－肌層之間的神經(jīng)，造成支配輸卵管神經(jīng)的損傷。子宮腺肌病患者血清IL-10顯著升高，盆腔神經(jīng)損傷與血清IL-10相互作用可能與子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

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Injury of pelvic nerves and serum level of IL-10 in patients with adenomyosis

CAI Yaoyao, XU Xinxin, WU Xueqing.
Departments of Gynecology and Obstetrics,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325015,China

Objective To investigate the damage of pelvic nerves and the serum levels of IL-10 in patients with adenomyosis. Methods Histological sections of the uterosacral ligaments and the isthmus of fallopian tubes were obtained from women undergoing hysterectomy for adenomyosis(adenomyosis group,n=33)and leiomyoma or cervical intraepithelial neoplasia III(CIN III)(non-adenomyosis group,n=32).The expression ofprotein gene product 9.5(PGP 9.5)in uterosacral ligaments and the isthmus offallopian tube was immunohistochemically analyzed.The distribution ofnerve fibers in the uterosacral ligaments and the isthmus of fallopian tube was examined microscopically.Serum IL-10 levels were determined by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)in two groups. Results Varying degrees of injuries and interruptions of the uterosacral ligaments were noted in the adenomyosis patients and there was strong evidence of neovascularization of the peritoneal surfaces over the ligament,adjacent peritoneum and mesosalpinx.The expression of PGP 9.5 and the density of nerve fibers in the mucosal and muscular layers of fallopian tubes were significantly decreased in adenomyosis(all P＜0.05).The nerve fibers stained with PGP 9.5 in the serous layer ofthe fallopian tube among the two groups showed no significant difference(both P＞0.05).The nerve fibers were decreased in the uterosacral ligaments of adenomyosis group compared with non-adenomyosis group(P＜0.05).The abnormal hyperplasia of the nerves was observed and the surrounded injured arterioles had thickened vessel walls and narrowed vascular cavity in adenomyosis group.The level of serum IL-10 in patients with adenomyosis was significantly higher than that in non-adenomyosis patients(P＜0.05). Conclusion Varying degrees of injuries to the nerves in the uterosacral ligaments and in the mucosal and muscular layers of fallopian tubes are noted in the adenomyosis patients.There is significantly abnormal serum IL-10 in patients with adenomyosis,which indicates that the interaction between pelvic nerve injury and inflammation may be responsible for the disease development.The results may provide a novelinsight into the pathogenesis ofadenomyosis.

Adenomyosis UterosacralligamentNerve fibers Injured nerve IL-10

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.21.2017-548

溫州市公益性科技計劃項目（Y20140743）

325015 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科

吳雪清，E-mail：wuxueqing.37@hotmail.com

2017-03-14）

陳麗）