朱盛安，李 璐，孔祥云，段廣新，田景翠，史淑新，齊冰玉

（新鄉(xiāng)市種子管理站，河南 新鄉(xiāng) 453000）

SSR標(biāo)記檢驗(yàn)玉米雜交種子純度核心引物的構(gòu)建

朱盛安，李 璐，孔祥云，段廣新，田景翠，史淑新，齊冰玉

（新鄉(xiāng)市種子管理站，河南 新鄉(xiāng) 453000）

利用50對(duì)SSR引物對(duì)收集到的18個(gè)玉米雜交種及其親本進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，以期篩選一套適于玉米雜交種純度鑒定的核心SSR引物。試驗(yàn)結(jié)果表明，50對(duì)SSR引物在18個(gè)雜交種及其親本中，有20對(duì)引物擴(kuò)增出多態(tài)性特異條帶，進(jìn)一步對(duì)20對(duì)引物進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)和PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，篩選出了8對(duì)SSR標(biāo)記引物，分別在18個(gè)玉米雜交種及其親本中擴(kuò)增到了條帶清晰、多態(tài)性好的條帶，可用于其玉米雜交種子純度鑒定和檢驗(yàn)。這為玉米雜交種種子真實(shí)性和純度檢驗(yàn)、解決玉米種子質(zhì)量糾紛提供了更為準(zhǔn)確可靠的參考依據(jù)。

玉米；雜交種；SSR；純度鑒定；核心引物

玉米品種純度鑒定對(duì)玉米種子質(zhì)量管理具有重要意義。隨著玉米品種鑒定技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)開始在玉米品種純度鑒定中得到應(yīng)用，其中SSR標(biāo)記因其重復(fù)性好、多態(tài)性好、共顯性、數(shù)據(jù)資源豐富等優(yōu)點(diǎn)，成為目前在種子純度檢驗(yàn)當(dāng)中應(yīng)用較多的標(biāo)記技術(shù)。然而，在以往的研究中，為解決少數(shù)雜交種的純度鑒定，往往需要進(jìn)行大量的引物篩選工作，才能找到適合的鑒定引物。李曉輝等（2003）從220對(duì)SSR引物中篩選出58對(duì)引物進(jìn)行13個(gè)玉米雜交種的純度鑒定；高文偉等（2004）利用50對(duì)引物篩選兩個(gè)玉米雜交種農(nóng)大108和豫玉27的純度鑒定引物；吳永升等（2006）利用10個(gè)SSR引物篩選一個(gè)玉米雜交種桂單22號(hào)的純度鑒定引物。這些研究在利用分子標(biāo)記進(jìn)行玉米雜交種純度鑒定方面進(jìn)行了一些有益的探索，然而，前期篩選工作量大，且僅限于少數(shù)雜交種的純度鑒定。能否確定一套適于純度鑒定的SSR核心引物，對(duì)已知品種的純度鑒定，就不再需要進(jìn)行煩瑣的引物篩選，即使對(duì)未知品種，也只需進(jìn)行少量的篩選，就能迅速找到合適的鑒定引物，從而為解決玉米品種純度鑒定搭建技術(shù)平臺(tái)，加快SSR技術(shù)在玉米純度鑒定上的推廣應(yīng)用。

本研究旨在通過(guò)利用50對(duì)SSR引物，對(duì)18個(gè)新鄉(xiāng)地區(qū)主要推廣的玉米雜交種進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，確定一套適合于這些玉米雜交種純度鑒定的核心引物以及確定特定品種的純度鑒定的特異引物，進(jìn)而為SSR標(biāo)記在玉米雜交種子純度檢驗(yàn)鑒定中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為新鄉(xiāng)市種子管理站收集到的，包括向各育種單位直接征集的18個(gè)玉米雜交種及其親本，如表1所示。這些品種基本上能夠代表目前新鄉(xiāng)市玉米新品種的情況。

表1 18個(gè)玉米雜交種及其親本

1.2 SSR引物

查閱相關(guān)文獻(xiàn)和MaizeGDB等數(shù)據(jù)庫(kù)，挑選在自交系中擴(kuò)增出1條譜帶、自交系間多態(tài)性好（2條譜帶以上）、譜帶清晰的50對(duì)SSR標(biāo)記的引物，將引物名稱和序列發(fā)給鄭州市久是生物技術(shù)公司進(jìn)行合成。

1.3 DNA提取

用收集到的種子為試驗(yàn)材料，采用CTAB法試劑盒進(jìn)行DNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。

1.4 SSR擴(kuò)增

應(yīng)體體系：10μL反應(yīng)液中包括：10mmol/L Tris-HCI，50mmol/L KCl，0.001 %Gelatin，2.5mmol/L MgCl2，0.16 mmol/L dNTP，0.25μmol/L SSR 引物，1U Taq DNA聚合酶，2μLDNA模板。這些試劑由鄭州市久是生物技術(shù)公司提供。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性40 S，60℃退火35 S，72℃延伸45 S，共35個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò) 增 在 PTC-100 PCR儀 (MJ Research，Watertown，MA)上進(jìn)行。

1.5 電泳檢測(cè)

PCR反應(yīng)產(chǎn)物變性后在6%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離。預(yù)電泳85w，20min；電泳80w，40 min。銀染：10%冰醋酸固定3min；雙蒸水快速漂洗1次，不超過(guò)10S；0.2%AgN03溶液染色5 min；顯影液3%NaOH+0.5%甲醛顯影；10%冰醋酸定影。電泳結(jié)果放在背光燈下進(jìn)行譜代分析。

2 結(jié)果分析

2.1 提取的樣品DNA檢測(cè)

以收集到的種子為試驗(yàn)材料，采用CTAB法試劑盒進(jìn)行DNA提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知DNA條帶清晰，較為集中，拖尾不明顯，沒有降解。

圖1 提取的部分DNA瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 適于純度鑒定用引物的選擇

利用在文獻(xiàn)中篩選的50對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)18個(gè)玉米雜交種及其親本自交系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分離，進(jìn)行SSR引物的篩選。共篩選到20對(duì)SSR引物在所有試驗(yàn)材料中有多態(tài)性的譜帶，并且條帶較為清晰。

引物umc1176在試驗(yàn)材料（含雜交種）中電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2 引物umc1176在試驗(yàn)材料（含雜交種）中的電泳結(jié)果

2.3 純度鑒定特異引物的確定

遵循條帶清晰、非特異擴(kuò)增條帶少或沒有，在自交系親本中有差異，相應(yīng)的玉米雜交種中有互補(bǔ)型條帶等原則，從篩選到的20對(duì)SSR引物中，利用雜交種和親本進(jìn)行重復(fù)擴(kuò)增檢測(cè)。引物phi072k4在浚單26及其親本材料中的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

圖3 phi072k4在浚單26及其親本材料中的檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)多次重復(fù)的試驗(yàn)結(jié)果，最終決選出重復(fù)性好的8對(duì)SSR引物，構(gòu)建成SSR標(biāo)記檢測(cè)玉米雜交種種子純度的特異引物，引物名稱、適宜檢測(cè)品種、引物序列如表3所示。

表3 檢測(cè)玉米品種純度的特異引物

3 結(jié)論

玉米雜交種純度鑒定有兩個(gè)目的：一是驗(yàn)自交苗，也是最主要的目的，僅需要1對(duì)雙親互補(bǔ)型引物就可以；二是驗(yàn)異型株，需要用特異引物或引物組合，使得出現(xiàn)相同帶型品種的概率足夠低，從而能有效地區(qū)分出異型株。

基于這兩點(diǎn)，適于純度鑒定的核心引物必須具備以下兩個(gè)特征：一是雜合率高，從而具有較強(qiáng)的區(qū)分自交苗的能力，能夠比較容易篩選到雙親互補(bǔ)型的引物；二是多態(tài)性高，從而具有較高的區(qū)分異型株的能力。只有這樣，才能保證預(yù)篩時(shí)僅采用少數(shù)引物就可以比較容易找到符合要求的引物。本試驗(yàn)在篩選SSR引物時(shí)，參照以上兩點(diǎn)，參考了相關(guān)文獻(xiàn)的做法。

由于玉米品種數(shù)量很大，要找到所有品種的特異引物是不可能的。確定純度鑒定的特異引物，其意義在于，對(duì)于特定品種，不需要多個(gè)引物的組合，而僅需一個(gè)引物就可以同時(shí)檢驗(yàn)自交株和異型株，從而大大減少純度鑒定的成本（王文潔，2011；孟慶長(zhǎng)，2009）。核心引物是用于篩選品種純度鑒定用特異引物的首選引物，但對(duì)每個(gè)特定品種的純度鑒定，根據(jù)檢測(cè)實(shí)踐進(jìn)行多次重復(fù)篩選。并且要滿足：一是具有雙親互補(bǔ)帶型；二是基因型頻率足夠低，在特定品種范圍內(nèi)，該基因型具有相對(duì)唯一性。本試驗(yàn)中針對(duì)新鄉(xiāng)目前推廣的18個(gè)主要玉米雜交種篩選到了8對(duì)具有特異性的SSR引物，可用于這些的雜交種的真實(shí)性和純度鑒定，這為新鄉(xiāng)市種子管理站玉米雜交種種子真實(shí)性和純度檢驗(yàn)、解決玉米種子質(zhì)量糾紛提供了更為準(zhǔn)確可靠的參考依據(jù)。

[1] 李曉輝，李新海，李文華，等. SSR標(biāo)記技術(shù)在玉米雜交種種子純度測(cè)定中的應(yīng)用[J]. 作物學(xué)報(bào)，2003（29）：63-68.

[2] 高文偉，李曉輝，李新海. 玉米單粒和單葉片DNA快速提取及SSR標(biāo)記分析[J]. 玉米科學(xué)，2004（12）：111-113.

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2017河南省秋季種子信息交流暨產(chǎn)品展覽會(huì)在鄭州召開

本刊訊：2017年10月27日，由河南省種子協(xié)會(huì)主辦的“2017河南省秋季種子信息交流暨產(chǎn)品展覽會(huì)”在鄭州國(guó)際會(huì)展中心成功舉辦。

被譽(yù)為“全國(guó)種業(yè)發(fā)展的風(fēng)向標(biāo)”的河南種子會(huì)，歷經(jīng)20多屆的積淀，已經(jīng)成為種子行業(yè)全國(guó)最大的盛會(huì)。展會(huì)以“規(guī)模大、品種全、效果好、人氣旺”而飲譽(yù)種業(yè)界，影響力覆蓋全國(guó)，成為國(guó)內(nèi)種業(yè)企業(yè)、農(nóng)資經(jīng)銷商、種植大戶、政府主管機(jī)構(gòu)、專家學(xué)者、行業(yè)協(xié)會(huì)等相關(guān)人士齊聚的盛會(huì)。本屆展會(huì)采取河南省秋季種子信息交流暨產(chǎn)品展覽會(huì)和河南省農(nóng)藥信息交流暨農(nóng)藥（械）交易會(huì)聯(lián)合辦展，河南種業(yè)、河南植保成果集中展示，參展企業(yè)數(shù)量、展示品種、專業(yè)觀眾再創(chuàng)新高，規(guī)模達(dá)到了歷屆展會(huì)之最。

《種業(yè)導(dǎo)刊》編輯部作為特邀代表全程參加了種子信息交流暨產(chǎn)品展覽、種業(yè)高峰論壇等活動(dòng)的宣傳與報(bào)道，并在展會(huì)上進(jìn)行《種業(yè)導(dǎo)刊》的宣傳與展示，受到與會(huì)代表的歡迎。圖為2017河南省秋季種子信息交流暨產(chǎn)品展覽會(huì)開幕式。

Construction of Core Primers for Testing Purity of Hybrid Maize Seeds by SSR Marker

ZHU Shengan, LI Lu, KONG Xiangyun, DUAN Guangxin, TIAN Jingcui, SHI Shuxin, Qi Bingyu
(Seed Management Station of Xin xiang City, Xinxiang 453003, China)

18 maize hybrids and their parents were analyzed by 50 pairs of SSR marker primers in order to screen a set of core SSR primers suitable for purity identif i cation of maize hybrids. The experimental results suggest that there are 20 pairs of primers amplif i ed polymorphic specif i c bands in 18 hybrids among 50 pairs of SSR primers. Further optimization experiments were repeated and PCR reaction conditions by 20 pairs of primers. There are 8 pairs of SSR primers respectively in 18 maize hybrids and amplified the clear and polymorphic bands. They can be used for the hybrid maize seed purity identif i cation and inspection. This will be a more accurate and reliable reference for the authenticity and purity test of Corn Single Cross seeds and the resolution of corn seed quality disputes.

maize; hybrid; SSR; testing purity; core primers

S339.3

A

1003-4749（2017）11-0020-05

2017-10-18

河南省新鄉(xiāng)市科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目（CP1501）

朱盛安(1978-)，男，河南新鄉(xiāng)人，農(nóng)藝師，主要從事種子質(zhì)量檢驗(yàn)工作。