張水滔，李娜，徐娟，雷然，李云仙，劉祥義

（西南林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南昆明650224）

響應(yīng)面優(yōu)化鐵皮石斛須根多糖提取工藝研究

張水滔，李娜，徐娟，雷然，李云仙，劉祥義*

（西南林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南昆明650224）

以鐵皮石斛須根為原料，采用超聲輔助技術(shù)提取多糖。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，利用響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理對料液比、提取時(shí)間、提取溫度等工藝條件進(jìn)行分析優(yōu)化。結(jié)果表明：3個因素的影響大小為提取溫度>料液比>提取時(shí)間，最佳提取工藝條件為料液比1∶29（g/mL），提取時(shí)間42 min，提取溫度62℃，在此條件下多糖得率實(shí)際值為8.03%，與理論值8.14%差距較小。表明該回歸模型合理有效，對石斛須根多糖提取工藝的優(yōu)化有很好的指導(dǎo)作用。

鐵皮石斛；多糖；超聲輔助技術(shù)；響應(yīng)面分析法

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimuraet Migo）是蘭科石斛屬植物，是一種藥食同源植物，歷代典籍奉其為“藥中之上品”和“九大仙草之首”，具有增強(qiáng)體質(zhì)、滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳的功效[1-4]。鐵皮石斛中含有多種化學(xué)成分，包括生物堿類、菲類、聯(lián)芐類和氨基酸[5]、多糖類、芴酮類、倍半萜類、香豆素類及甾體糖苷類化合物，其中多糖類成分是鐵皮石斛中具有免疫促進(jìn)和抗腫瘤作用的活性成分[6-7]，具有較高的藥理活性，還有防癌、抗癌、抗衰老的作用[8]，而且是鐵皮石斛中含量最多的有效成分。鐵皮石斛須根是其換茬時(shí)的產(chǎn)物，在生產(chǎn)中會出現(xiàn)大量的鐵皮石斛須根，既沒有綜合利用，在堆放時(shí)還會產(chǎn)生污染。據(jù)報(bào)道，鐵皮石斛全身是寶，本著二次資源綜合利用的原則，充分開發(fā)鐵皮石斛須根的潛在價(jià)值。

目前植物多糖的提取技術(shù)主要以水提醇沉法[9]，超聲波協(xié)同復(fù)合酶法[10]、微波法[11]、超聲波輔助水提法[12]、超臨界流體萃取法[13]等。而超聲波輔助水提法與許多傳統(tǒng)提取方法相比，其優(yōu)勢之處在于：操作簡便快速，提取效率高，速度快，工藝成本低，綜合經(jīng)濟(jì)效益顯著，媒質(zhì)結(jié)構(gòu)不被損壞等。超聲波技術(shù)[14]可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、機(jī)械振動、高加速度、乳化、擴(kuò)散、擊碎和攪拌作用，可以有效破壞植物細(xì)胞壁從而有利于多糖的提取。

本試驗(yàn)首先采用超聲波輔助法提取鐵皮石斛根中的多糖，然后再用苯酚-硫酸法[15]測定其中多糖的含量，再根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[16]設(shè)計(jì)并優(yōu)化其提取工藝，為鐵皮石斛的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛須根：采自云南瑞麗。

1.2 主要儀器及試劑

RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海萊亞生化儀器廠；HH-2型電熱恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；0408-1型低速臺式離心機(jī)：上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠；AR224CN型分析天平：奧賽斯儀器有限公司；JJ-2型粉碎機(jī)：金壇市岸頭良友實(shí)驗(yàn)儀器；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式多用真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；722型可見光分光光度計(jì)：天津冠澤科技有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KH-500TDB型超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀有限公司。

無水葡萄糖、氯仿、無水乙醇、石油醚、正丁醇、苯酚（以上試劑均為分析純）、濃硫酸（優(yōu)級純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水：西南林業(yè)大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)文獻(xiàn)[17]的方法，精確稱取0.100 0 g干燥至恒重的無水葡萄糖，配制成濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取 7 支試管，分別加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加蒸餾水至總體積為2 mL，加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，再加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，沸水浴煮沸15 min。冰浴中冷卻后在490 nm處測量吸光度，以濃度和吸光度為橫縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

1.4 多糖的提取及其含量測定

1.4.1 樣品預(yù)處理

將鐵皮石斛須根洗凈，55℃烘干，粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，加入4倍體積的石油醚超聲30 min進(jìn)行脫脂處理，抽濾，濾渣55℃烘干至恒重備用。

1.4.2 工藝流程

精確稱取1 g石油醚處理后的樣品，加入一定體積的蒸餾水在一定的溫度下超聲輔助提取一定的時(shí)間。濾液濃縮，再加入95%乙醇，至乙醇濃度為80%，放置過夜，過濾，沉淀用適量蒸餾水溶解，采用Sevage法去除蛋白質(zhì)，按照方法1.3測定吸光度，計(jì)算多糖得率。

1.5 提取工藝條件的優(yōu)化

1.5.1 單因素試驗(yàn)

分別考察料液比、提取時(shí)間、提取溫度3個因素對多糖得率的影響。

1.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，以料液比、提取時(shí)間、提取溫度為因素，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，利用Box-Behnken組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案優(yōu)化提取工藝條件，并最終確定出最佳提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對多糖得率的影響

在溫度為50℃的條件下，用超聲波提取20 min，確定料液比 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）對多糖得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對多糖得率的影響Fig.2 Effect of feed liquid ratio on the yield of polysaccharides

由圖2可知，料液比對多糖得率影響的效果較為明顯，在 1 ∶10（g/mL）到 1 ∶30（g/mL）之間，多糖得率隨著溶劑量的增加而增加，1∶30（g/mL）之后，隨著溶劑的增加多糖得率有明顯下降，所以較佳的料液比為1 ∶30（g/mL）。

2.1.2 提取時(shí)間對多糖得率的影響

固定料液比為 1∶30（g/mL），提取溫度為 50℃，考察超聲提取時(shí)間 10、20、30、40、50 min 對多糖得率的影響，結(jié)果如下圖3所示。

圖3 時(shí)間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of time on the yield of polysaccharides

由圖3可知，隨著超聲提取時(shí)間的不斷延長，其多糖的得率也在顯著增加，在40 min時(shí)候達(dá)到最大值，之后多糖得率有所下降，可能原因是多糖在溶液中時(shí)間較長發(fā)生部分水解。因此較佳的提取時(shí)間為40 min。

2.1.3 提取溫度對多糖得率的影響

選取料液比為1∶30（g/mL），超聲提取時(shí)間為20 min，考察提取溫度 40、50、60、70、80、90 ℃對多糖得率的影響，其結(jié)果如下圖4所示。

圖4 溫度對多糖得率的影響Fig.4 Effect of temperature on yield of polysaccharides

由圖4可知，溫度較低時(shí)，多糖得率也比較低，隨著溫度的升高，多糖得率也不斷增加，在60℃時(shí)多糖得率達(dá)到最大，此后有所下降，可能是溫度多高多糖發(fā)生部分的水解。因此選取60℃為較佳水平進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，以多糖得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）3個因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析見表3。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Results of response surface design

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 3 Variance Analysis of response surface regression model

由表3可知，通過數(shù)據(jù)分析得到該模型的決定系數(shù)R2=0.986 5，表明模型與實(shí)際試驗(yàn)值擬合度較高，具有可靠性，調(diào)整校正后系數(shù)為R2Adj=0.969 2，表明回歸方程擬合度較好，可解釋96.92%響應(yīng)值的變化；失擬項(xiàng)的F值為3.04，P值為0.155 2>0.05，表明不存在未知因素可顯著影響試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)Design expert8.0.6.1軟件回歸擬合后二次回歸方程為：R=-57.722 5+0.454 87A+0.0865B+1.85738C-0.0001AB-0.000175AC+0.000 05BC-0.007 462 5A2-0.001 037 5B2-0.015 013C2。

根據(jù)回歸方程可知：當(dāng)A=29.47，B=41.76，C=61.75時(shí)，R出現(xiàn)極大值（R=8.14%），即當(dāng)提取條件為料液比1∶29.47，超聲提取時(shí)間41.76 min，提取溫度61.75℃時(shí)，多糖得率達(dá)到最高，理論上為8.14%。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)回歸分析結(jié)果可得到等高線圖及三維響應(yīng)面圖，如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對多糖得率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.5 Contour plots and response surface plots of the interaction of various factors on the yield of polysaccharides

圖5簡明直觀的反映了A、B、C各因素間交互作用對多糖得率的影響，由圖5可知：因素C對多糖得率的影響最顯著，表現(xiàn)為曲線最陡峭，其次是因素A，最后是因素B，與方差分析的結(jié)果一致，即3個因素的顯著性大小為C>A>B（提取溫度>料液比>提取時(shí)間）。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了簡化試驗(yàn)，在提取條件為料液比1∶29（g/mL）、超聲提取時(shí)間42 min、提取溫度62℃時(shí)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，得到多糖得率的平均值為8.03%，與理論試驗(yàn)結(jié)果非常相近，表明該回歸模型合理有效。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)應(yīng)用超聲波技術(shù)、單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化了鐵皮石斛須根的多糖提取工藝，得到二次回歸方程為：R=-57.722 5+0.454 87A+0.086 5B+1.857 38C-0.000 1AB-0.000 175AC+0.000 05BC-0.007 462 5A2-0.001 037 5B2-0.015 013C2。確定出最佳提取工藝條件為料液比1∶29（g/mL），超聲提取時(shí)間42 min，提取溫度62℃，各因素的顯著性水平為提取溫度>料液比>提取時(shí)間，在此條件下多糖得率的理論值為8.14%，實(shí)際值為8.03%。因此，使用響應(yīng)面分析法建立模型優(yōu)化得到的最佳提取工藝參數(shù)具有準(zhǔn)確度高和可行性好的優(yōu)點(diǎn)，具有實(shí)際利用價(jià)值，可為鐵皮石斛多糖及其多糖類產(chǎn)品的研究開發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)。

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Optimization of Extraction Technique of Polysaccharides of Dendrobium Roots by Response Surface Methodology

ZHANG Shui-tao，LI Na，XU Juan，LEI Ran，LI Yun-xian，LIU Xiang-yi*
（School of Chemical Engineering，Southwest Forestry University，Kunming 650224，Yunnan，China）

Dendrobium roots as raw material，the polysaccharide was extracted by ultrasonic assisted technique.On the basis of single factor experiment，the design principle of Box-Behnken center combination in response surface methodology（RSM）was applied to analyze and optimize the technological conditions such as liquid to liquid ratio，extraction time and extraction temperature.The results showed that the size of three factors as extraction temperature>solid-liquid ratio>extraction time，the optimal extraction conditions of solid-liquid ratio 1∶29（g/mL），extraction time 42 min，extraction temperature of 62℃，the rate of the actual value of 8.03%polysaccharides under this condition，the smaller the gap with the theoretical value of 8.14%.Showed that the regression model was reasonable and effective，to optimize the extraction process of polysaccharide of Dendrobium roots had very good guidance.

Dendrobium；polysaccharides；ultrasonic assisted technique；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.013

張水滔（1994—），男（漢），本科在讀，應(yīng)用化學(xué)專業(yè)。

*通信作者：劉祥義（1964—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：天然產(chǎn)物開發(fā)與應(yīng)用。

2017-05-22