古麗娜·巴克，迪麗胡瑪·吐爾遜，阿拉努爾·庫爾班，馬爾哈巴·帕爾哈提

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

不同濃度SDG對奶牛乳腺上皮細胞增殖及泌乳能力的影響

古麗娜·巴克，迪麗胡瑪·吐爾遜，阿拉努爾·庫爾班，馬爾哈巴·帕爾哈提

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

【目的】用植物雌激素亞麻籽木脂素（SDG）處理奶牛原代乳腺上皮細胞，觀察SDG對奶牛乳腺上皮細胞增殖及泌乳能力的影響?！痉椒ā繉⒂脽o血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)的對數(shù)生長期奶牛原代乳腺上皮細胞分為對照組和試驗組，即0 μg/mL的SDG組和添加1、10、50、100、150、200 μg/mL SDG的試驗組，分別處理0 h、12 h、24 h、48 h、72 h后收集各組細胞培養(yǎng)液，檢測奶牛乳腺上皮細胞增殖能力及活力以及奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白分泌情況?！窘Y(jié)果】不同濃度SDG對奶牛乳腺上皮細胞均有提高增殖能力及活力的作用，且添加不同劑量的SDG均具有促進奶牛乳腺上皮細胞分泌β-酪蛋白作用，且呈明顯的劑量依賴性?！窘Y(jié)論】濃度為150 μg/mL的SDG培養(yǎng)奶牛原代乳腺上皮細胞48 h，奶牛乳腺上皮細胞的增殖能力與活力以及分泌β-酪蛋白的效果最好。

SDG；乳腺上皮細胞；細胞增殖；細胞活力；泌乳性能

植物雌激素（Phytoestrogen，PE）是一類來源于植物的具有類雌激素活性的非甾族雜環(huán)多酚類化合物。因植物雌激素的雜環(huán)多酚母核與內(nèi)源雌激素的甾體結(jié)構(gòu)相似，可與雌激素受體（Estrogen Receptor，ER）結(jié)合，在哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[1]。目前研究較深入的植物雌激素主要有異黃酮類（Isoflavones）、木脂素類（Lignans）、二苯乙烯類（Stibenes）、香豆雌酚類（Coumestans）和真菌類（Mycoestrogen）等[2]。研究報道，亞麻籽中富含木脂素[3,4]，而亞麻籽木脂素（SDG）也是一種具有雌激素樣活性的物質(zhì)[1,2]，能促進大鼠乳腺發(fā)育并提高產(chǎn)奶量[5,6]。近年來，利用激素調(diào)控奶牛乳腺細胞的增殖已成為科研人員研究的熱點問題。然而，目前SDG在乳腺細胞方面的研究主要集中在動物模型大小白鼠上，而截止目前為止，SDG在奶牛乳腺細胞方面的研究幾乎空白。因此，本研究以體外培養(yǎng)泌乳期奶牛乳腺上皮細胞為研究對象，探討SDG對奶牛乳腺上皮細胞的增殖和分化效果，為今后SDG在奶牛乳腺上皮細胞中的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

奶牛原代乳腺上皮細胞購于上海生工生物工程有限公司。

DMEM/F12培養(yǎng)基購于美國Invitrogen公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清購于Gibco公司產(chǎn)品；β-酪蛋白標(biāo)準品和乳糖標(biāo)準品購于Sigma公司；其他常規(guī)試驗藥品及試劑為國產(chǎn)。

SDG（含量40%）購自陜西錦泰生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試驗儀器

P1201高效液相色譜儀（中國遼寧）；QP-80型CO2培養(yǎng)箱（國產(chǎn)）；全自動酶聯(lián)免疫分析儀（美國Thermo electron公司）；SZ-93自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；DFC280倒置相差顯微鏡（德國LEICA）；Model DT CASY細胞計數(shù)儀（CASY，德國）。

1.3 乳腺上皮細胞的培養(yǎng)

將奶牛原代乳腺上皮細胞稀釋至1×105/mL并接種于培養(yǎng)瓶，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，之后換1次培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細胞生長至70%～80%即可開展后續(xù)試驗。

1.4 試驗設(shè)計

將1.3中培養(yǎng)好的奶牛乳腺上皮細胞以1×105/mL的密度接種于6孔板中，細胞貼壁后用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d，之后將每3孔設(shè)為一組進行試驗。試驗分為對照組和試驗組，即對照組添加0 μg/mL SDG，試驗組分別添加1、10、50、100、150、200 μg/mL SDG組。分別處理0 h、12 h、24 h、48 h、72 h后收集各組細胞培養(yǎng)液進行試驗。

1.5 MTT法檢測細胞增殖

試驗方法參考[7-9]。

（1）將乳腺細胞懸液200 μL以1×105/mL接種于96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，去除96孔板加入20 μL/孔MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；

（2）去除96孔板，并輕輕吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μL/孔DMSO液，在室溫條件下，將96孔板置于震蕩器上震蕩10 min至藍紫色結(jié)晶物充分溶解；

（3）全自動酶聯(lián)免疫分析儀設(shè)定波長為490 nm用于檢測各孔OD值。

1.6 CASY細胞計數(shù)儀檢測細胞增殖能力與活力

重新在6孔板中接種對數(shù)生長期的1×105/mL的密度乳腺上皮細胞，待細胞貼壁后用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再進行分組試驗。試驗分組情況同1.4。分別收取處理24 h、48 h、72 h后的各組細胞樣品，用Model DT CASY細胞計數(shù)儀檢測細胞增殖能力與活力。

1.7 乳蛋白的測定

乳蛋白的測定方法參考[10]。

β-酪蛋白的含量采用高效液相色譜測定（HPLC）。HPLC的檢測條件：Φ7.8 mm×300 mm的TSK凝膠柱、室溫、280 nm波長；經(jīng)過0.22 μm無機濾膜過濾超聲脫氣的超純水、0.60 mL/min的流速、10 μL的進樣體積作為流動相。用0.22 μm無機濾膜過濾超聲脫氣的超純水溶解β-酪蛋白標(biāo)準品，分別按照1、5、10、15、20 mg/mL的濃度進樣，以β-酪蛋白濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立β-酪蛋白標(biāo)準曲線。分別收集已處理48 h的乳腺細胞培養(yǎng)液，液相色譜檢測β-酪蛋白含量。設(shè)3個重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進行數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計分析，進行單因素方差分析。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT法測定不同濃度SDG培養(yǎng)液處理奶牛乳腺細胞不同時間點對細胞增殖的影響

表1、圖1顯示：與對照組（0 μg/mL）相比，1 μg/mL的SDG無血清DMEM/F12培養(yǎng)基乳腺細胞，不同時間段增值效果差異均不顯著（P＞0.01）；10 μg/mL的SDG血清DMEM/F12培養(yǎng)基乳腺細胞12、24、72 h，與對照組比較各組乳腺細胞的增值效果差異均極顯著（P＜0.01），而48 h各組乳腺細胞的增值效果差異顯著（P＜0.05）；50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL的SDG無血清DMEM/F12培養(yǎng)基乳腺細胞，與對照組比較各組乳腺細胞的增值差異均極顯著（P＜0.01）；且48 h 150 μg/mL的SDG組乳腺細胞生長趨勢最好。

圖1 不同濃度SDG培養(yǎng)液處理乳腺細胞不同時間點對細胞增殖的影響

2.2 CASY細胞計數(shù)儀檢測不同濃度SDG對奶牛乳腺上皮細胞增殖能力及活力的影響

由表2得知，隨著添加的SDG濃度的增高，細胞的增殖能力與活力均得到明顯的提高，尤其是當(dāng)培養(yǎng)液中添加50、100、150、200 μg/mL濃度SDG時，細胞的增殖能力與活力均顯著提高（P＜0.05），且有一定的劑量依賴性，除去SDG濃度為150、200 μg/mL之間外，其他各組間均差異顯著（P＜0.05）；且從結(jié)果也可以看出，培養(yǎng)液中SDG的添加濃度為150 μg/mL時，細胞的增殖能力與活力為最好。

表2 不同濃度SDG培養(yǎng)液處理乳腺細胞48 h對細胞增殖能力及活力的影響（OD490nm，n=3）

2.3 SDG對奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白分泌情況的影響

2.3.1 β-酪蛋白標(biāo)準曲線的建立

將β-酪蛋白濃度設(shè)定為橫坐標(biāo)，峰面積設(shè)定為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準曲線得回歸方程。在1～20 μg/mL的范圍內(nèi)重復(fù)進樣，R2均在0.9996。

圖2 β-酪蛋白標(biāo)準曲線

2.3.2 不同濃度SDG對奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白分泌的影響

由表3可知，當(dāng)細胞培養(yǎng)液中分別添加50、100、150、200 μg/mL濃度SDG時，細胞分泌β-酪蛋白的量較對照組分別顯著提高了3.50%、6.74%、9.16%、8.36%（P＜0.05），且各組間差異顯著（P＜0.05）；而添加濃度為1、10 μg/mL時，細胞分泌的β-酪蛋白與對照組比較無明顯差異（P＞0.05）；且當(dāng)細胞培養(yǎng)液中SDG的添加量為150 μg/mL時，乳腺上皮細胞分泌的β-酪蛋白的效果最好。

表3 不同濃度SDG對乳腺上皮細胞分泌β-酪蛋白的影響（n=3）

3 討論

3.1 不同濃度SDG對奶牛乳腺細胞增殖與活力的影響

植物雌激素的結(jié)構(gòu)與內(nèi)源雌激素的甾體結(jié)構(gòu)相似，可與雌激素受體結(jié)合，在哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[1]，亞麻籽木脂素是植物雌激素的一種，能與乳腺細胞ER結(jié)合，通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-生長激素軸或催乳素軸來分泌GH和PRL，從而調(diào)控乳腺發(fā)育[11-15]。穆瑩等[10]研究報道，乳腺上皮細胞中加入不同濃度植物雌激素大豆黃酮培養(yǎng)24 h可一定濃度范圍內(nèi)促進奶牛乳腺上皮細胞的增殖；歐陽五慶等[16]試驗報道，植物雌激素大豆黃酮能促進大鼠乳腺上皮細胞的增殖；而劉春龍[17]發(fā)現(xiàn)，植物雌激素大豆黃酮能加速奶牛乳腺上皮細胞的增殖。在本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)液中添加50、100、150、200 μg/mL濃度植物雌激素亞麻籽木脂素（SDG）時，奶牛乳腺上皮細胞的增殖能力與活力均顯著高于0 μg/mL的對照組（P＜0.05）?？赡艿臋C制是：SDG通過作用于奶牛乳腺上皮細胞上的ER，并與之結(jié)合，產(chǎn)生一定的雌激素效應(yīng)，作用于乳腺上皮細胞進而促進乳腺上皮細胞的增值與分化。

3.2 不同濃度SDG對奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白分泌的影響

β-酪蛋白是檢測奶牛乳品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，牛乳中β-酪蛋白含量高牛乳質(zhì)量好，反之牛乳質(zhì)量差。β-酪蛋白的分泌受多重因素的調(diào)控，而內(nèi)分泌激素是重要的調(diào)控因子。Akers[18]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺上皮細胞中添加17β-雌二醇可以顯著增加催乳素誘導(dǎo)的α-乳白蛋白的表達。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細胞培養(yǎng)液中分別添加50、100、150、200 μg/mL濃度SDG時，細胞分泌β-酪蛋白的量顯著提高，表明一定濃度的SDG具有增強奶牛乳腺上皮細胞合成β-酪蛋白的能力。這一結(jié)果也為今后SDG的功能研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

MTT法測定不同濃度SDG處理奶牛乳腺上皮細胞時，SDG具有促進細胞增殖作用，且最佳作用時間為48 h和最佳濃度為150 μg/mL；

用CASY細胞計數(shù)儀檢測不同濃度SDG對奶牛乳腺上皮細胞增殖能力及活力，發(fā)現(xiàn)SDG的添加濃度為150 μg/mL時，細胞的增殖能力與活力為最好；

當(dāng)細胞培養(yǎng)液中分別添加50、100、150、200 μg/mL濃度SDG時，細胞分泌β-酪蛋白的量顯著提高，且呈明顯的劑量依賴性，且SDG的添加量為150 μg/mL時，乳腺上皮細胞分泌的β-酪蛋白的效果最好。

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Effects of Different Concentrations of SDG on the Mammary Gland Epithelial Cells Proliferation and Lactating Capacity in Cow

GULIA·Bake，DILIHUMA·Tursun，AILANUER·Kurba，MAIERHABA·Parhat
（College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）

s：The effects of different concentrations of flaxseed lignans（SDG）on the mammary gland epithelial cells proliferation and lactating capacity was investigated.DMEM/F12free serum culture medium added 1，10，50，100，150，200 μg/mL SDG were using primary mammary epithelial cells culture.After culture 0 h，12 h，24 h，48 h and 72 h，detection of proliferation and beta casein secretion.The result show that treatment with all concentrations of SDG can promote the proliferation and beta casein secretion of bovine mammary epithelial cells.For primary mammary epithelial cells，using the culture medium added 150 μg/mL SDG and cultured after 48 h culture is potent for cell proliferation and beta casein secretion.

SDG；mammary gland epithelial cells；cell proliferation;cell viability；lactation capacity

S823.9+1

A

1003-6377（2017）06-0005-06

新疆少數(shù)民族科技人才特殊培養(yǎng)計劃項目“亞麻籽木脂素對奶牛乳腺發(fā)育影響極其作用機理研究”（201523127）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目“亞麻籽木脂素的雌激素樣活性研究”（220141063）

古麗娜·巴克（1976-），女（維吾爾族）,新疆阿克蘇人，講師，博士。E-mail：gulnar@xjau.edu.cn

2017-09-16，

2017-09-28

10.16863/j.cnki.1003-6377.2017.06.002