孫作剛，趙曉鳳

（新疆獸藥飼料監(jiān)察所，新疆烏魯木齊830063）

用酶聯(lián)免疫吸附法測定畜產(chǎn)品、飼料中β-興奮劑類藥物

孫作剛，趙曉鳳

（新疆獸藥飼料監(jiān)察所，新疆烏魯木齊830063）

本實驗采用酶聯(lián)免疫吸附法測定β-興奮劑類藥物，在添加濃度為0.5 μg/L，1.0 μg/L的空白尿液中的回收率均在88.6%～110.3%之間；在添加濃度25 μg/kg，50 μg/kg的空白豬配合飼料中的回收率均在83.1%～106.2%之間；在添加濃度為0.5 μg/kg，1.0 μg/kg的空白羊肉中的回收率均在73.6%～106.3%之間；在添加濃度為0.5 μg/kg，1.5 μg/kg的空白牛肉中的回收率在76.5%～106.5%之間。各添加濃度的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于11%，滿足殘留檢測方法回收率在60%～120%；批內(nèi)、批間變異系數(shù)小于等于20%的要求。結(jié)論：用酶聯(lián)免疫吸附法可對畜產(chǎn)品、飼料中β-興奮劑類藥物殘留進(jìn)行初步篩選，對疑似陽性樣品再用儀器方法確認(rèn)。

β-興奮劑類藥物；畜產(chǎn)品；飼料；酶聯(lián)免疫吸附測定法

酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）是一種敏感性高，特異性強，重復(fù)性好的快速檢測方法。β-興奮劑類藥物（腎上腺素受體激動藥adrenoceptor agonists，簡稱BAA）是一類與腎上腺素受體結(jié)合，激動受體，產(chǎn)生腎上腺素樣的作用的藥物的總稱。基本化學(xué)結(jié)構(gòu)為β–苯乙胺，一般可分為含取代基的苯胺型（如克倫特羅）、苯酚型（如沙丁胺醇）、苯二酚型（如特布他林）等三大類。按其受體不同，又可分為六類，能與β受體結(jié)合的腎上腺素受體激動藥被稱為β腎上腺素激動藥，此類藥物作用于平滑肌后，會使心肌收縮力加強、興奮性增高，習(xí)慣又叫做β-受體激動劑[1]。許多生產(chǎn)者采用BAA作為飼料添加劑來提高瘦肉率和改善胴體品質(zhì)[6][7]。當(dāng)人體中累計攝入劑量超過一定值或一次食入高殘留量（＞100 ng/g）的內(nèi)臟組織如肝、腎、肺時易出現(xiàn)BAA的毒副作用[8][9]。人、畜中毒癥狀相似，主要有骨骼肌收縮增加，肌肉震顫，四肢和面部肌肉最明顯，輕者感覺不適，重者出現(xiàn)行走不穩(wěn)。嚴(yán)重者還可危及生命。目前對BAA類藥物殘留檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣/質(zhì)聯(lián)用分析法（GC/MS）、放射免疫分析法（IA）、氣相色譜法（GC）、高效薄層色譜法（HTLC）[3～5]、液/質(zhì)聯(lián)用分析法（LC/MS）、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）和放射受體分析法等[2]。在所有的檢測分析方法中，酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）是一種敏感性高、特異性強、重復(fù)性好的快速檢測方法[10][11]。它能在短短的幾個小時檢測幾十到上百個試樣，適合于對藥物殘留的初步篩選。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1試劑盒

勤邦生物技術(shù)有限公司β-興奮劑類殘留檢測試劑盒（以下簡稱勤邦試劑盒）包括：96孔酶聯(lián)板，系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度分別為0、0.1、0.4、1.6、6.4、25.6 μg/L），濃縮酶結(jié)合物，酶結(jié)合物稀釋液，濃縮洗滌液，底物A、B液，終止液，濃縮復(fù)溶液。

1.1.2 儀器

Waters液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀、微孔板酶標(biāo)儀（配備450nm濾光片）、渦旋儀、勻質(zhì)器、振蕩器、天平：感量0.01 g、離心機、微量移液器：單道20～200 μL、200～1 000 μL，多道250 μL、氮吹儀。

1.1.3 試劑

三氯乙酸、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、乙醇。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取一定量的克侖特羅、沙丁胺醇、塞布特羅、妥布特羅、克侖潘特、溴布特羅、溴氯布特羅、馬噴特羅、馬布特羅、特布他林標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品品牌Sigma），用甲醇配制為溶液1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.1.5 溶液

1.1.5.1 2.5%三氯乙酸溶液：稱取12.5 g三氯乙酸加入500 mL去離子水溶解混勻。

1.1.5.2 組織樣本稀釋液：稱取0.64 g無水碳酸鈉、1.184 g碳酸氫鈉和40 g氯化鈉加入500 mL去離子水溶解混勻。

1.1.5.3 飼料樣本稀釋液：稱取40 g氯化鈉加入500 mL去離子水溶解混勻。

1.2 樣品處理方法

1.2.1 試樣的制備

1.2.1.1 取適量試料（牛肉、羊肉）10 000 r/min勻漿1 min、取適量飼料10 000 r/min，磨碎。

1.2.1.2 取絞碎后的空白牛肉、羊肉，空白尿液和空白飼料作為空白測試樣品，所有空白樣品均經(jīng)過液質(zhì)方法確證過。

1.2.2 樣本前處理

按照試劑盒說明書上尿液、牛肉、羊肉、飼料樣品的樣本前處理方法進(jìn)行操作。

1.2.3 檢測

樣品經(jīng)處理后按勤邦試劑盒說明書上步驟進(jìn)行檢測。儀器法按《飼料中8種β-受體激動劑殘留檢測氣相色譜-質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部1063號公告-7-2008）和《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測液相色譜色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008）步驟進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 試劑盒靈敏度復(fù)核

2.1.1 按50%抑制法評價

標(biāo)準(zhǔn)曲線0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值50%處所對應(yīng)的藥物濃度，即IC50，來評價試劑盒的檢測限。做標(biāo)準(zhǔn)曲線5條，運用相應(yīng)軟件計算出每條曲線的IC50值，得到5個50%抑制濃度，見表1。

表1 IC50計算結(jié)果μg/L（kg）

由表1可知，試劑盒IC50平均值為0.67 μg/L。

2.1.2 按最低檢測限評價

樣品的最低檢測限也是靈敏度的評價指標(biāo)。分別測定尿液、牛肉、羊肉、飼料各20份空白樣本，求出空白樣品的平均值，在加上三倍標(biāo)準(zhǔn)差，即為最低檢測限。如此考察本檢測方法在尿液、牛肉、羊肉、底料中β-興奮劑類藥物的最低檢測限，空白尿液、牛肉、羊肉、飼料的測定結(jié)果分別見表2至表5。

表2 尿液樣本的最低檢測限μg/L

由表2可知，尿液的最低檢測限為0.32 μg/L。

表3 牛肉樣本的最低檢測限μg/kg

由表3可知，牛肉的最低檢測限為0.53 μg/L。

表4 羊肉樣本的最低檢測限μg/kg

由表4可知，羊肉的最低檢測限為0.55 μg/L。

表5 飼料樣本的最低檢測限μg/kg

由表5可知，飼料的最低檢測限為5.32 μg/L。

2.2 試劑盒的準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確度是指測得值與真實值的符合程度，在ELISA測定中，準(zhǔn)確度常以回收率表示，精密度常以變異系數(shù)來表示。在空白尿液中，將克侖特羅、沙丁胺醇、塞布特羅、妥布特羅、克侖潘特、溴布特羅、溴氯布特羅、馬噴特羅、馬布特羅、特布他林分別添加至濃度為0.5 μg/L、1.0 μg/L；在空白飼料中，將克侖特羅、沙丁胺醇、塞布特羅、妥布特羅、克侖潘特、溴布特羅、溴氯布特羅、馬噴特羅、馬布特羅、特布他林分別添加至濃度為25 μg/kg、50 μg/kg；在空白牛肉、空白羊肉中，將克侖特羅、沙丁胺醇、塞布特羅、妥布特羅、克侖潘特、溴布特羅、溴氯布特羅、馬噴特羅、馬布特羅、特布他林分別添加至濃度為0.5 μg/kg、1.0 μg/kg。每種樣品，每個濃度各4個平行測定3批。計算平均值、添加回收率及批內(nèi)批間變異系數(shù)。結(jié)果見表6、表7。

表6 尿液、飼料樣品添加平均回收率和變異系數(shù)（N=4）

表7 牛肉、羊肉樣品添加平均回收率和變異系數(shù)（N=4）

從表6、表7可知，測定三批試劑盒，每批試劑盒測定結(jié)果取均值計算顯示，克侖特羅、沙丁胺醇、塞布特羅、妥布特羅、克侖潘特、溴布特羅、溴氯布特羅、馬噴特羅、馬布特羅、特布他林在添加濃度為0.5 μg/L，1.0 μg/L的空白尿液中的回收率均在88.6%～110.3%之間；在添加濃度25 μg/kg，50 μg/kg的空白豬配合飼料中的回收率均在83.1%～106.2%之間；在添加濃度為0.5 μg/kg，1.0 μg/kg的空白羊肉中的回收率均在73.6%～106.3%之間；在添加濃度為0.5 μg/kg，1.5 μg/kg的空白牛肉中的回收率均在76.5%～106.5%之間；各添加濃度的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均低于11%。

2.3 與儀器方法對比試驗

用研制的試劑盒和儀器方法（動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測液相色譜色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008）分別測定了從市場上抽取的羊肉、牛肉樣品共20份樣品，勤邦試劑盒羊肉、牛肉最低檢測限為：0.5 μg/kg；液相色譜色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法克侖特羅定量限為：0.5 μg/kg；沙丁胺醇定量限為：0.5 μg/kg；結(jié)果如表8。

由于多殘留檢測試劑盒可同時檢測樣本中10種興奮劑殘留量，樣本03號試劑盒克侖特羅檢測結(jié)果高于儀器方法較多，推測可能樣本中有其他興奮劑藥物殘留。與儀器方法相比較，試劑盒的準(zhǔn)確度與儀器檢測結(jié)果符合，陰陽性樣本符合率100%。

表8 試劑盒和儀器方法對比實驗

3 討論

對于BAA類藥物殘留檢測來說，雖然高效液相色譜法、GC/MS和LC/MS/MS法等這些儀器方法具有精確可靠、靈敏度高、重復(fù)性好以及假陽性少等優(yōu)點，但需要昂貴的儀器設(shè)備，單位時間內(nèi)能處理樣品的能力有限。目前，最通用的BAA類藥物殘留檢測方法是用ELISA對樣品進(jìn)行初篩，再對陽性樣品用GC/MS或LC/MS/MS進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

本實驗用酶聯(lián)免疫吸附法測定克侖特羅、沙丁胺醇、塞布特羅、妥布特羅、克侖潘特、溴布特羅、溴氯布特羅、馬噴特羅、馬布特羅、特布他林在添加濃度為0.5 μg/L，1.0 μg/L的空白尿液中的回收率均在88.6%～110.3%之間；在添加濃度25 μg/kg，50 μg/kg的空白豬配合飼料中的回收率均在83.1%～106.2%之間；在添加濃度為0.5 μg/kg，1.0 μg/kg的空白羊肉中的回收率均在73.6%～106.3%之間；在添加濃度為0.5 μg/kg，1.5 μg/kg的空白牛肉中的回收率均在76.5%～106.5%之間；各添加濃度的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于11%，滿足殘留檢測方法回收率在60%～120%；批內(nèi)、批間變異系數(shù)小于等于20%的要求。

通過試劑盒與儀器方法的對比復(fù)核，ELISA檢測樣本與儀器方法檢測結(jié)果符合。用酶聯(lián)免疫吸附法對大批量畜產(chǎn)品、飼料中β-興奮劑類藥物殘留進(jìn)行初步篩選[A5]，對疑似陽性樣品再用儀器法確認(rèn)，可節(jié)約大量時間和成本。

[1] 王若軍.Beta-腎上腺素能興奮劑的作用機理及應(yīng)用效果[J].國外畜牧科技，1994，21（2）：32-34.

[2] 李俊鎖.獸藥殘留分析[M].上海：上海科技出版社，2002.

[3] 戴華，袁智能，黃志強.飼料中鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇高效液相色譜測定[J].分析測試學(xué)報，2003，22（3）：57-60.

[4]Shen S H，Jin O Y，Willy R G B.Determination ofβ2-agonists by ion chromatography with directconductivity detection[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2005，（38）：166-172.

[5] Zhou T S，Hu Q，Yu H.Separation and determination ofβ-agonists in serum by capillary zoneelectrophoresis with amperometric detection[J].Analytica Chimica Acta，2001，（441）：23-28.

[6] 何慶蘭.β-腎上腺素能受體興奮劑（BAA）在養(yǎng)豬中的應(yīng)用[J].浙江畜牧獸醫(yī)，1995，（4）：20-21.

[7] 曾占宏.完美的飼料復(fù)合添加劑及影響因素[J].國外畜牧學(xué)（豬與禽），1997，（6）：16-21.

[8] 屈健.β—興奮劑在動物飼養(yǎng)中的負(fù)效應(yīng)[J].飼料與畜牧，1998，（5）：27-28.

[9] 劉宣兵，龐玉芳，侯玉澤，等.沙丁胺醇的毒副作用及其殘留檢測[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008,（04）:83-85.

[10] 鄭紅.豬肉組織中β_2-受體激動劑殘留檢測方法研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2011.

[11] 汪慧蓉.β-興奮劑克倫特羅、沙丁胺醇的免疫檢測方法研究[D].西安：西北大學(xué)，2006.

Beta-stimulant Drugs in Animal Products and Feed Were Determined by Enzyme-linked Immunosorbent Assay

SUN Zuo-gang，ZHAO Xiao-feng
（Xinjiang Veterinary and Feed Supervision Institute,Urumqi 830063，China）

In this experiment,the enzyme linked immunosorption method was used to determine the betastimulant drug,and the recovery rate in the blank urine of 0.5 μg/L and 1.0 μg/L was between 88.6%and 110.3%.In add concentration（including 25 μg/kg,including 50 μg/kg of blank pig feed the recoveries are between 83.1%and 106.2%;The recovery rate of the blank mutton with the concentration of 0.5 μg/kg and 1.0 μg/kg was between 73.6%and 106.3%.The recovery rate in the blank beef with a concentration of 0.5 μg/kg and 1.5 g/kg was between 76.5%～106.5%.The variation coefficient of each addition concentration was less than 11%,and the recovery rate oshijihef the residual detection method was 60%～120%.The variation coefficient of the batch and batch is less than or equal to 20%.Conclusion:enzyme-linked immunosorbent assay can be used for preliminary screening of drug residues in animal products and feedstuffs,and can be confirmed by means of instrument for suspected positive samples.

beta-stimulant drugs;Animal products;feed;enzyme-linked immunosorbent assay

S854.4

A

1003-6377（2017）06-0031-07

孫作剛（1969-），男，大學(xué)本科，獸醫(yī)師，長期從事獸藥飼料監(jiān)察工作。E-mail：1428216280@qq.com

2017-09-03，

2017-09-20

10.16863/j.cnki.1003-6377.2017.06.007