， ， ， ， (.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系， 昆明 6500； .云南省草地動物研究院， 昆明 6500)

·研究報告·

青藏高原野生百脈根種子休眠及萌發(fā)特性的研究

任健1，代微然1，宋麗梅1，歐陽青2，馬向麗1
(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系， 昆明 650201； 2.云南省草地動物研究院， 昆明 650220)

百脈根(LotuscorniculatusL.)是一種富含營養(yǎng)物質(zhì)的豆科牧草，適應(yīng)酸性、干旱及貧瘠的土壤，在我國分布廣泛，然而種子的休眠特性限制了它的利用。為此，以青藏高原亞高山草甸的野生百脈根種子為試驗材料，通過擦破種皮、化學(xué)腐蝕、低溫冷凍等方法研究打破種子休眠的辦法。研究結(jié)果表明，野生百脈根種子的硬實率高達92.3%，種皮厚度為(65.63±2.26)μm，比對照高出60.4% (plt;0.01) ，可見野生百脈根種子以種皮厚、透水性差為特點。試驗還發(fā)現(xiàn)，擦破種皮后，種子的發(fā)芽率由8.7%提高到85%；濃度為98%的濃硫酸浸泡5，15，25 min均能有效地降低種子的硬實率，提高發(fā)芽率，其中以15，25 min處理效果最好，相比而言，濃度為40%的NaOH處理效果不明顯。GA3、低溫濕沉積+GA3及-4 ℃，-20 ℃及液氮超低溫冷凍能顯著提高發(fā)芽率。

百脈根； 休眠； 硬實； 發(fā)芽率； 平均發(fā)芽天數(shù)

種子萌發(fā)涉及到形態(tài)、生理生化的變化，是一個復(fù)雜的過程。在自然界，一些具有活力的種子，在適宜的環(huán)境條件下仍然不能萌發(fā)，處于休眠狀態(tài)。休眠是植物對環(huán)境的一種適應(yīng)，通過休眠使得植物能度過干旱、高溫等不良環(huán)境[1]。種子休眠的機理主要是種皮透性差、胚沒有完全成熟等引起的休眠。對一些豆科植物來說，種皮的不透性是造成種子休眠的主要原因。

百脈根(LotuscorniculatusL.)是豆科百脈根屬多年生牧草，又名牛角花、五葉草，原產(chǎn)于歐亞溫暖地區(qū)，在世界各地均有廣泛種植，在我國主要分布在華東、華中、西南及西北[2]。在青藏高原東緣的亞高山草地上，百脈根是分布最廣的草種之一，營養(yǎng)價值高，適口性好，再生能力強，具有耐牧的特點，可青貯、刈割及放牧利用，是牛、馬、兔等家畜的優(yōu)良牧草[3]，然而種子的發(fā)芽率較低，出苗率差。盡管目前國內(nèi)已在百脈根遺傳[4]、抗旱性[5]等方面展開研究，但對野生百脈根種子硬實處理方法的研究少見報道。本研究以青藏高原天然草地上采集的野生百脈根種子為試驗材料，通過測定種皮厚度，利用酸、堿、液氮冷凍等方法了解種子休眠的原因，并篩選出打破種子休眠的適宜處理方法，為野生百脈根資源的利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為野生百脈根種子，種子于2011年秋采自云南省香格里拉縣海拔3 150～3 220 m的亞高山草甸(27°29′59.8′′N 、99°51′18.7′′E)，當?shù)啬昃涤炅繛?49.8 mm，年均溫為5.8 ℃。采收后，混勻，常溫貯藏于實驗室(相對濕度40%～60%)。從2012年8—10月，參照國際種子檢驗規(guī)程[6]進行種子發(fā)芽實驗。試驗中，隨機取100粒種子置于紙床，每個處理重復(fù)3次，置于人工氣候箱25 ℃下恒溫(變溫處理中白天29 ℃，晚上25 ℃)培養(yǎng)，光照強度180μmol/(m·s)，光照時間為8 h/d，每天更換蒸餾水。每天記錄種子發(fā)芽數(shù)，以胚根伸出種皮作為種子萌發(fā)的標準。第8天統(tǒng)計發(fā)芽率，并計算平均發(fā)芽天數(shù)[7]。

發(fā)芽率(%)=規(guī)定時間內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

平均發(fā)芽天數(shù)=∑(Gt×Dt)/∑Gt；

式中，Gt為逐日發(fā)芽數(shù)(粒)；Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)(d)。

1.2 方 法

1.2.1 種皮厚度、種子千粒重、硬實率的測定

種皮厚度：先利用冷凍切片機(SLEE，德國)對干種子切片，然后在顯微鏡下(DM 2000, 德國)進行測量，與沒有休眠的百脈根品種進行種皮的比較。

種子千粒重：從凈種子中隨機數(shù)1 000粒種子稱重，重復(fù)3次(精確到0.01 g)。

種子硬實率：隨機取100粒野生百脈根種子，在25 ℃下用100 mL蒸餾水浸種48 h，統(tǒng)計未吸脹種子的粒數(shù)，計算硬實率。重復(fù)3次，以下一致。

1.2.2 擦破種皮(Sc)處理

取2張木工用80目砂布，將種子置于其間，2張砂布在水平面上作相對旋轉(zhuǎn)運動進行磨擦，至種皮發(fā)毛，然后在25 ℃恒溫和29 ℃/25 ℃變溫條件下進行發(fā)芽試驗。

1.2.3 強酸、強堿處理

將種子放置在100 mL燒杯中，分別加入98%濃硫酸、49%硫酸對種子進行酸蝕處理，處理過程中，不斷攪拌，以防結(jié)塊，處理時間分別為5，15，25 min。處理后，立即用蒸餾水反復(fù)沖洗種子，然后進行發(fā)芽試驗。

將種子放入100 mL燒杯中，加入40%的氫氧化鈉溶液沒過種子，分別浸泡10，20，30 min。用蒸餾水反復(fù)沖洗，然后進行發(fā)芽試驗。

1.2.4 低溫沉積、低溫和超低溫冷凍處理

取適量種子置于冰箱不同的冷藏室中，貯藏室溫度分別為4，-4，-20 ℃，在4 ℃貯藏室中，種子分別進行干沉積和濕沉積處理。處理8周后取出，在室溫下解凍，以未處理的種子作為對照，進行發(fā)芽試驗。

用紙袋將種子包起來，在液氮中處理5，10，15，20 min，室溫下解凍后置于25 ℃下進行發(fā)芽試驗。

1.2.5 赤霉素(GA3)處理

用濃度為50，100，200 mg/L GA3浸泡種子24 h后，用蒸餾水反復(fù)沖洗，然后進行發(fā)芽試驗。另外，取部分擦破種皮的種子、低溫濕沉積后的種子分別與GA3進行復(fù)合處理，GA3的濃度分別為50，100，200 mg/L，然后在25 ℃下開展發(fā)芽試驗。

1.2.6 溫水浸種處理

取適量種子分別在40 ℃溫水中浸種3，5，10，60，120，180 min，以及80 ℃溫水浸種3，5，10 min后，取出冷卻至室溫，然后進行發(fā)芽試驗。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，不同處理之間的差異性比較采用SNK進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子千粒重、硬實率

試驗結(jié)果表明，野生百脈根種子千粒重為1.12 g ，硬實率高達92.3%，說明野生百脈根種子自然狀態(tài)下硬實率較高。從種子切片來看，外表皮是排列緊密的柵欄組織，種皮的厚度為(65.63±2.26)μm，與休眠程度低的種子相比，種皮厚度存在顯著差異，前者較后者高出60.4%。

2.2 不同處理對野生百脈根種子萌發(fā)的影響

2.2.1 擦破種皮(Sc)處理

由圖1可知，擦破種皮后，百脈根種子的發(fā)芽率提高到68%以上，平均發(fā)芽天數(shù)明顯縮短，與對照之間存在顯著差異(plt;0.05)。另外，29 ℃/25 ℃變溫處理的發(fā)芽率顯著高于25 ℃恒溫(plt;0.05)，不過平均發(fā)芽天數(shù)變化不明顯。

注：Student-Newman-Keuls開展多重比較，相同小寫字母表示處理間發(fā)芽率差異顯著; 相同大寫字母表示處理間平均發(fā)芽天數(shù)差異顯著(plt;0.05)。下同。圖1 擦破種皮(Sc)對百脈根種子發(fā)芽率、平均發(fā)芽天數(shù)的影響

2.2.2 強酸、強堿處理

由表1可知，98%濃H2SO4和40% NaOH處理對種子萌發(fā)的影響不一致。40% NaOH浸泡百脈根種子10～30 min后，與對照相比，發(fā)芽率、平均發(fā)芽天數(shù)沒有明顯變化。相反，98%的濃硫酸處理種子5，15，25 min均顯著地提高了種子的發(fā)芽率，縮短了平均發(fā)芽天數(shù)，其中浸泡15 min和25 min對發(fā)芽率的影響好于5 min。相比而言，濃度為49% H2SO4處理對種子發(fā)芽率沒有明顯影響，盡管平均發(fā)芽天數(shù)較對照縮短。

表1 不同濃度的H2SO4、NaOH對百脈根種子萌發(fā)的影響

處理發(fā)芽率(%)平均發(fā)芽天數(shù)(d)H2SO449%×5min9．0±3．2c3．2±0．6AB49%×15min10．3±2．3c3．0±0．1AB49%×25min9．7±0．9c3．4±0．1AB98%×5min38．7±2．3b2．4±0．1B98%×15min72．7±1．8a2．7±0．1AB98%×25min74．7±0．7a2．6±0．4ABNaOH40%×10min8．0±0．6a2．0±0．2A40%×20min8．0±0．6a3．0±0．2A40%×30min6±1．5a2．1±0．6A對照8．7±0．9a3．9±0．3A

2.2.3 低溫沉積、低溫和超低溫冷凍處理

與對照相比，-4，-20 ℃低溫冷凍和液氮超低溫冷凍5，10，15，20 min顯著地提高了種子發(fā)芽率(plt;0.05)(圖2)，各個處理之間差異不顯著。就平均發(fā)芽天數(shù)而言，液氮超低溫冷凍處理均延長了發(fā)芽天數(shù)，其中冷凍20 min最為明顯。

圖2 低溫和超低溫冷凍處理對百脈根種子發(fā)芽率、平均發(fā)芽天數(shù)的影響

2.2.4 赤霉素及其復(fù)合脅迫對種子萌發(fā)的影響

由表2可見，種子在GA3的處理下，發(fā)芽率、平均發(fā)芽天數(shù)與對照相比有顯著差異(plt;0.05)，能顯著縮短平均發(fā)芽天數(shù)，說明GA3能一定程度的促進野生百脈根種子的萌發(fā)，提高種子的發(fā)芽力。但隨著處理濃度的增加，發(fā)芽率、平均發(fā)芽天數(shù)無顯著變化。

4 ℃干沉積和濕沉積處理對發(fā)芽率沒有顯著影響。不過，濕沉積后，再進行GA3處理，發(fā)芽率和平均發(fā)芽天數(shù)均發(fā)生了變化，其中發(fā)芽率得到了明顯提高(plt;0.05)。另外，與擦破種皮相比，3種濃度的GA3浸泡并沒有進一步提高種子發(fā)芽率或縮短發(fā)芽天數(shù)(表3)。

表2 干沉積、濕沉積、GA3及其復(fù)合處理對百脈根種子萌發(fā)的影響

處理發(fā)芽率(%)平均發(fā)牙天數(shù)(d)干沉積12．7±1．8a4．2±0．8b濕沉積8．0±2．0a3．8±0．8abGA350mg/L×濕沉積46．7±5．3b2．6±0．2aGA3100mg/L×濕沉積50．7±3．7b2．6±0．3aGA3200mg/L×濕沉積49．3±0．7b2．4±0．1a對照18．0±1．2a3．5±0．1ab擦破種皮85．0±1a3．1±0．2bcGA350mg/L×擦破種皮87．3±1．8a3．9±0．3cdGA3100mg/L×擦破種皮81．7±1．7a3．7±0．1abGA3200mg/L×擦破種皮76．7±5．0a3．2±0．1bcGA350mg/L23．3±0．7a2．1±0．1bGA3100mg/L24．3±2．0a2．0±0．2bGA3200mg/L24．0±1．5a2．2±0．3b對照8．7±0．9b3．9±0．3a

2.2.5 溫水浸泡對種子萌發(fā)的影響

由表3可見，種子在40，80 ℃浸種處理下，種子發(fā)芽率并沒隨著處理時間的延長而增加，相比而言，當浸種時間超過60 min以后，平均發(fā)芽天數(shù)較對照明顯縮短,說明野生百脈根種子經(jīng)40℃浸種長時間的處理后能縮短其發(fā)芽天數(shù)。

表3 溫水浸種對種子萌發(fā)的影響

處理發(fā)芽率(%)平均發(fā)牙天數(shù)(d)40℃浸種3min9．7±2．0a3．7±0．4a5min8．7±0．9a3．2±0．5a10min8．7±3．8a3．0±0．5a60min9．7±1．5a2．4±0．2b120min5．7±1．2a2．2±0．1b180min7．3±1．3a2．6±0．3b80℃浸種3min12．0±2．6a4．6±0．1a5min14．3±1．8a5．0±0．3a10min10．3±2．0a4．7±0．3a對照8．7±0．9a3．9±0．3a

3 討論與結(jié)論

據(jù)Baskin等報道，70%以上高山植物的種子具有休眠特性[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，來自青藏高原東緣的野生百脈根種子硬實率高達92.3%，只有少量的種子能吸脹，休眠程度高。與休眠性低的百脈根種子相比，野生百脈根種子的種皮厚度增加了60%，因此，百脈根種子的休眠與種皮厚度有一定關(guān)系。豆科植物硬實率高的原因與種子在成熟過程中的干燥有關(guān)[9]。硬實率高導(dǎo)致種子吸水困難，使得種子處于休眠之中，從而有利于度過不良的環(huán)境。但是，對于種子在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的利用與開發(fā)是不利的。

熱水浸種可以軟化種皮, 去掉種皮表層的蠟質(zhì)和油脂, 提高透性和浸出種子內(nèi)發(fā)芽抑制物[10]，然而，試驗中熱水浸種對野生百脈根種子萌發(fā)的影響與其它植物不一致，說明熱水浸種去除野生百脈根種子硬實的效果不好。氫氧化鈉具有強烈的腐蝕性，可以增加種皮的通透性，解除種子休眠。然而，試驗中40%氫氧化鈉浸泡10～30 min效果不明顯，可見野生百脈根種皮較堅硬。因而，要打破野生百脈根種子的休眠特性，需要采用一些物理方法，或使用腐蝕性更強的藥品，才能改變種皮的透性。研究結(jié)果表明，擦破種皮、98%的濃硫酸處理、-4，-20 ℃及液氮超低溫冷凍種子都是不錯的方法，種子發(fā)芽率得到了顯著提高。其中98%的濃硫酸浸泡15 min和25 min對發(fā)芽率的影響好于5 min。相比而言，49% H2SO4處理對種子發(fā)芽率均沒有明顯影響。當然，98% H2SO4處理效果好于擦破種皮，因為擦破種皮過程中很容易造成胚結(jié)構(gòu)的損傷，影響種子萌發(fā)。

赤霉素是提高種子發(fā)芽率的一種簡單易行方法，該方法可以抑制脫落酸的活性物質(zhì), 從而有利于種子的吸水萌發(fā)[11]。在本實驗中，野生百脈根種子經(jīng)GA3處理后，發(fā)芽率得到了一定的提高，但處理效果不如其他處理，因此，生產(chǎn)中可以推廣擦破種皮，低溫冷凍或利用98%的濃硫酸處理15 min。限于實驗條件沒有進一步分析脫落酸含量的變化，下一步可以開展類似的研究。

綜上所述，種皮厚、透水性差是野生百脈根種子休眠的主要原因，擦破種皮和98%的濃硫酸處理，-4，-20 ℃、液氮超低溫冷凍及變溫處理能有效地打破種子休眠，促進種子萌發(fā)。

[1]Basra AS.Dormancy and Germination[M].In:Handbook of seed science and Technology (Eds Basra AS).Food products press:New York.2005:271-290.

[2]王棟,任繼周.牧草學(xué)各論[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,1989:230-231.

[3]徐桂芬,崔茂盛,匡崇義,等.云南野生優(yōu)良豆科牧草百脈根的開發(fā)利用[J].牧草與飼料,2012,6(1):10-11.

[4]孫艷香,楊紅梅,耿紅云,等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的百脈根遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化研究[J].南開大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2006,39(2):51-57.

[5]趙海明,孫桂枝,王學(xué)敏，等.百脈根種質(zhì)苗期抗旱性鑒定及綜合評價[J].草原與草坪,2011,31(6):18-26.

[6]國際種子檢驗協(xié)會編．國際種子檢驗規(guī)程[M].中國農(nóng)業(yè)出版社,1996.

[7]Scott SJ,Jones RA,Williams WA.Review of data analysis methods for seed germination[J].Crop Science,1984,24:1 192-1 198.

[8]Baskin JM,Baskin CC.Seeds:Ecology,biogeography and evolution of dormancy and germination[M].Academic Press:New York,1998.

[9]Van Asssche,JA,Debucquoy,KLA and Romments,WAF.Seasonal cycles in the germination capacity of buried seeds of some leguminosae(Fabaceae)[J].New Phytologist,2003,158:315-323.

[10]王瓊,宋桂龍.鹽膚木種子硬實與萌發(fā)特性研究[J].種子,2008,27(4):59-61.

[11]饒貴珍.2種植物生長調(diào)節(jié)劑浸種對芹菜種子發(fā)芽的影響[J].種子,2000,19(4):18-20.

Study on Seed Dormancy and Germination Characteristics of Birdsfoot Trefoil from Qinghai-Tibetan Plateau

RENJian1,DAIWeiran1,SONGLimei1,OUYANGQing2,MAXiangli1
(1.Department of Grassland Sciences,Yunnan Agriculture University,Kuming 650201，China;2.Yunnan Academy of Grassland and Animal Science,Kunming 650220，China)

Birdsfoot trefoil (LotuscorniculatusL.) is a nutritional legume species.It adapts to slightly acidic,droughty,infertile or wet soils and widely distributes in China.However,seed dormancy results in poor subsequent stand establishment.Seeds were collected from sub-alpine meadow of Qinghai-Tibetan plateau.The objective of this study was to break dormancy by treating seeds with scarification,chemical soaking and gibberellic acid (GA3) immersion as well as freezing.Results indicated average hard seed rate of Birdsfoot trefoil was up to 92.3% and coat thickness of dormant seeds was (65.63±2.26)μm,which was 60.4 percent larger than control.Mechanical scarification significantly removed seed dormancy,and the final germination percentage (FGP) was increased from 8.7 % to 85 %.Chemical scarification treated by concentrated sulphuric acid (98% H2SO4) of 5,15,25 min was also effective in reducing hard seed and improving seed germination.Moreover,15 and 25 min-soaking were better compared with control.However,no significant effects were observed between 40% NaOH treatment and control.In addition,the higher germination rate was achieved by use of gibberellic acid or combination of cold-wet storage and GA3,-4 ℃，-20 ℃and Ultra-low temperature freezing.

LotuscorniculatusL.； dormancy; hardness seed； germination rate；mean germination time

2016-08-19

公益行業(yè)專項“青藏高原社區(qū)天然草地保護與合理利用技術(shù)研究與示范”(編號：201203006);“十二五”國家科技支撐計劃項目子課題(編號：2011 BAD 17 B 02)。

任 健(1971—)，男，四川彭山人；博士，副教授，主要從事草地生態(tài)的教學(xué)和科研工作；E-mail:renjian172@126.com。

代微然(1974—)，女，實驗師，主要從事牧草種質(zhì)資源的研究；E-mail:iced_d@ynau.edu.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.02.001

S 812.8

A

1001-4705(2017)02-0001-04