殷繼永 霍軍生* 馬欣欣 孫 靜 黃 建

蛋白芯片檢測平臺檢測β-乳球蛋白的方法學(xué)評價*

殷繼永①霍軍生①*馬欣欣①孫 靜①黃 建①

目的：評價本研究前期建立的用于β-乳球蛋白的蛋白芯片檢測平臺，以滿足預(yù)防醫(yī)學(xué)實驗室的檢測需求。方法：應(yīng)用蛋白芯片檢測平臺對3份生牛乳樣品進行批內(nèi)重復(fù)8次檢測β-乳球蛋白，計算其批內(nèi)精密度；另對3份生牛乳分別重復(fù)8個批次檢測，計算批間精密度。對高濃度標準品連續(xù)2倍比例稀釋3種濃度后進行稀釋回收率實驗；另對3種濃度標準品進行加標回收率實驗。取10份生牛乳樣品，分別用蛋白芯片檢測平臺與商用ELISA試劑盒進行檢測并進行方法學(xué)比較。結(jié)果：用于β-乳球蛋白的蛋白芯片檢測平臺的批內(nèi)精密度為11.18%～17.62%，批間精密度為25.10%～29.96%；稀釋回收率為104.27%～128.15%，加標回收率為45.98%～129.33%，兩種方法的相關(guān)系數(shù)r=0.958，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.46，P＜0.05)；兩種方法配對比較t檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.592，P＞0.01)。結(jié)論：本研究建立的用于β-乳球蛋白的蛋白芯片檢測平臺能夠滿足預(yù)防醫(yī)學(xué)實驗室檢測需要，現(xiàn)存在的操作偏倚需進一步優(yōu)化。

蛋白芯片；β-乳球蛋白；檢測平臺；評價

牛乳是臨床營養(yǎng)中的重要食物來源。β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin，β-L)是牛乳中主要的蛋白質(zhì)，在乳清蛋白中總含量達50%，占牛乳總蛋白的10%。β-L是由乳腺上皮細胞合成的牛乳特有蛋白，其分子量約為18 kDa，由162個氨基酸殘基組成，其中4個半胱氨酸殘基在鏈內(nèi)形成了二硫鍵，這些特點保證了β-L結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定，并進而使其可以作為牛乳真?zhèn)舞b定時具有代表性的標志蛋白[1]。此外，因牛乳中的主要致敏蛋白包括β-L，因此其也可作為牛乳致敏性蛋白檢測時的標志蛋白[2]。

目前，有許多檢測方法應(yīng)用于牛乳蛋白的檢測[3-5]。然而，各種方法檢測過程復(fù)雜、不易于掌握和操作，且對檢測儀器要求高，使日常生活中飲用的牛乳質(zhì)量不能得到及時穩(wěn)定的檢測保證。為此，本研究前期利用蛋白芯片技術(shù)的檢測特點，建立針對β-L的蛋白芯片檢測平臺[6]。該平臺具有快速、高效、高靈敏度和操作性強的特點，但其具體的檢測性能是否能滿足實驗室階段的檢測需求，尚需相應(yīng)的評價實驗進行檢驗。對檢測平臺進行性能評價的實驗包括評價精確性的批內(nèi)精密度、批間精密度實驗，評價準確性的稀釋回收率、加標回收率及方法學(xué)對照實驗。因此，本研究利用前期建立的蛋白芯片檢測β-L的平臺進行檢測性能評價，以期為蛋白芯片技術(shù)在預(yù)防醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LuxScanTM10 K芯片掃描儀(北京博奧生物有限公司)；Personal ArrayerTM16蛋白芯片點樣儀(北京博奧生物有限公司)。牛乳β-L標準品(PCode1002101934，美國SIGMA)；β-L鼠單抗與兔多抗(北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司)；Cy3標記的羊抗兔多抗(code 111-165-003，美國，Jackson ImmunoResearch)；陰性兔IgG，蛋白芯片點樣液A(code 440015，北京博奧生物有限公司)；晶芯?高分子三維基片(code 420040，北京博奧生物有限公司)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)，Tween20。10份不同采樣點的生牛乳(北京三元食品股份有限公司)。

1.2 試驗方法

(1)本研究中所使用的蛋白芯片基本檢測方法，與前期建立蛋白芯片平臺研究中所優(yōu)選出的基本檢測方法相一致[6]。在精密度與準確度的方法學(xué)評價實驗中，參照《體外診斷試劑分析性能評估系列指導(dǎo)原則》(簡稱“指導(dǎo)原則”)中的評價方法進行評價，各實驗中所使用的標準曲線參考前期平臺建立時所建立的標準曲線并根據(jù)實際檢測需要略做調(diào)整。

(2)在批內(nèi)精密度與批間精密度評價中分別隨機選取三元食品股份有限公司提供的3份生牛乳進行實驗。研究中的重復(fù)次數(shù)參考“指導(dǎo)原則”；在稀釋回收率實驗中，為了減少大比例稀釋可能帶來的稀釋偏倚，選擇的3個稀釋濃度均在檢測標準曲線的中上部。在加標回收率實驗中，為確保加標前后的檢測結(jié)果都不超出標準曲線最高點與最低點，以保證評價的可行性，本研究結(jié)合相關(guān)文獻[7-8]報道，最終選擇了現(xiàn)在使用的3個基礎(chǔ)液濃度與加標液的濃度。方法學(xué)比較實驗中使用的生牛乳樣品選自北京周邊奶源，由于奶源地的生牛乳質(zhì)量相對穩(wěn)定，因此本次評價實驗中所使用的10份生牛乳已經(jīng)能夠滿足實驗室階段的檢測需求。

1.3 蛋白芯片檢測項目與方法

1.3.1 基本檢測方法

(1)將β-L的抗體探針β-L鼠單抗或β-L兔多抗和質(zhì)控品(陽性控制為無關(guān)兔IgG，陰性控制為1×點樣緩沖液，空白控制為PBS)分別重復(fù)點樣在三維基片的每一個陣列中。經(jīng)37 ℃固定18.5 h后，按以下操作完成實驗。

(2)加抗原β-L蛋白稀釋液(30 μl/陣列，37 ℃，1 h)→芯片洗滌(1‰PBST，5 min/次，5次)→甩干(1000 r/min，2 min)→加入檢測抗體β-L鼠單抗或β-L兔多抗(30 μl/陣列，37 ℃，1 h)→芯片洗滌(1‰PBST，5 min/次，5次)→甩干(1000 r/min，2 min)→加入Cy3標記的二抗(30 μl/陣列，37 ℃，1 h)→芯片洗滌(1‰PBST，5 min/次，5次)→甩干(1000 r/min，2 min)→芯片掃描→獲取檢測圖像與檢測數(shù)據(jù)。

1.3.2 批內(nèi)精密度

將β-L標準品以1‰PBST樣本稀釋液稀釋5個標準濃度(2209.6 ng/ml、1104.8 ng/ml、552.4 ng/ml、276.2 ng/ml、138.1 ng/ml)，以1‰PBST為陰性對照，做標準曲線。取3份生牛乳，編號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。其中生牛乳Ⅰ和Ⅱ按1∶400稀釋，生牛乳Ⅲ按1∶800稀釋后批內(nèi)重復(fù)8次檢測，以30μl/陣列加入各自相應(yīng)的陣列。批內(nèi)精密度計算為公式1：

1.3.3 批間精密度

取3份生牛乳，編號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。其中生牛乳Ⅰ和Ⅱ按1∶400稀釋，生牛乳Ⅲ按1∶800稀釋后，對3份生牛乳分8個批次檢測、每批次內(nèi)兩陣列重復(fù)，以30μl/陣列加入各自相應(yīng)的陣列。8個批次批間精密度檢測計算為公式2：

式中S批間為批間實驗的批間標準差；X1為每日每批的第一個檢測結(jié)果；X2為每日每批的第二個檢測結(jié)果；L為檢測天數(shù)(4 d，8次)。

1.3.4 稀釋回收率

對高濃度標準品(2984.4 ng/ml)連續(xù)稀釋3個濃度(1492.2 ng/ml，746 ng/ml，373 ng/ml)后，以30 μl/陣列加入各自相應(yīng)的陣列，進行稀釋回收率實驗，并根據(jù)實驗結(jié)果計算稀釋回收率。

1.3.5 加標回收率

對3個濃度基礎(chǔ)液(639.5 ng/ml，426.35 ng/ml，479.65 ng/ml)進行加標回收率實驗，每個濃度均加入其體積量1%體積的高濃度加標液(67150 ng/ml)，加標原則參照文獻[7-8]中的要求；以30 μl/陣列加入各自相應(yīng)的陣列。根據(jù)實驗結(jié)果計算加標回收率。

1.3.6 方法學(xué)對照

取10份生牛乳，于4 ℃、12000 r/min，離心30 min后各取中間清澈乳清部分并進行編號，各生牛乳乳清分為兩部分，一部分用于ELISA試劑盒檢測β-L含量，另一部分用于蛋白芯片檢測β-L的含量。對兩種方法的檢測結(jié)果，計算相關(guān)系數(shù)，并進行配對比較的t檢驗。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Microsoft Office Excel 2007與SPSS 17.0軟件對所有的數(shù)據(jù)進行分析處理。精密度評價實驗以重復(fù)檢測值的均數(shù)、標準差及由二者確定的變異系數(shù)表示；準確度評價以每個檢測信號值代入回歸方程求濃度的均數(shù)后進行計算；方法學(xué)對照評價，用配對比較的t檢驗和相關(guān)性分析對兩種方法檢測結(jié)果進行一致性評價。檢驗水準選定α=0.01，以P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 批內(nèi)精密度

對Ⅰ～Ⅲ的3份生牛乳樣品進行批內(nèi)重復(fù)檢測8次的結(jié)果顯示，蛋白芯片檢測平臺對生牛乳中β-L檢測的批內(nèi)精密度為11.18%～17.62%(見表1)。

表1 蛋白芯片檢測β-L的批內(nèi)精密度評價

2.2 批間精密度

對3份生牛乳樣品進行批間實驗4 d(8次)的結(jié)果顯示，蛋白芯片檢測平臺對生牛乳中β-L檢測時，每批內(nèi)2個結(jié)果間的批內(nèi)精密度為15.37%～18.35%，日間精密度為9.88%～30.24%，每批次之間的批間精密度為25.10%～29.96%，總批間精密度為31.05%～45.37%(見表2)。

2.3 稀釋回收率及加標回收率

(1)稀釋回收率結(jié)果顯示，蛋白芯片檢測平臺檢測3種濃度β-L的稀釋回收率為104.27%～128.15%，其平均回收率為113.75%(見表3)。

(2)加標回收率結(jié)果顯示，蛋白芯片檢測平臺檢測3種濃度β-L的加標回收率為45.98%～129.33%，其平均回收率為94.40%(見表3)。

2.4 方法學(xué)對照

兩種檢測方法的方法學(xué)對照結(jié)果顯示，兩種方法的相關(guān)系數(shù)r=0.958， 經(jīng)檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.46，P＜0.05)，如圖1所示。

圖1 蛋白芯片法與ELISA法檢測牛乳β-L的相關(guān)性分析示圖

配對比較t檢驗結(jié)果顯示，兩種方法比較其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.592，P＞0.01)，見表4。

表2 蛋白芯片檢測β-L的批間精密度評價(n=8)

表3 蛋白芯片檢測β-L的回收率及加標回收率評價

表4 蛋白芯片法與ELISA法配對比較的t檢驗(±s，ng/ml)

表4 蛋白芯片法與ELISA法配對比較的t檢驗(±s，ng/ml)

序號 蛋白芯片法 E L I S A法 差值1 2 2 9 6 0.6 1 5 7 7 3 3.6 0 -3 4 7 7 2.9 9 2 3 1 5 5 3.8 8 6 3 6 0 9.4 0 -3 2 0 5 5.5 2 3 2 2 8 4 0.1 0 8 0 4 8 0.7 9 -5 7 6 4 0.6 9 4 2 1 3 2 8.2 8 5 3 2 3 8.5 8 -3 1 9 1 0.3 0 5 8 7 1 7 0.0 5 4 5 3 0 2 6.9 7 -1 9 5 6 5 9.4 6 6 3 6 4 9 0.2 3 7 7 7 6 6.8 9 -4 1 2 7 6.6 6 7 5 1 9 5 1.9 2 2 0 0 7 2 7.1 2 -1 4 8 7 7 5.2 1 8 1 9 3 0 4.8 5 8 2 4 4 4.9 9 -6 3 1 4 0.1 4 9 3 2 5 0 5.2 8 9 4 1 4 5.1 0 -6 1 6 3 9.8 2 1 0 3 1 4 0 6.6 1 5 3 1 1 5.2 0 -2 1 7 0 8.5 9 ±s 3 5 7 5 1±2 0 4 4 7 1 2 1 6 2 8±1 2 4 1 9 0 -6 8 8 5 7±5 7 2 9 1

3 討論

利用蛋白芯片實現(xiàn)對樣品中特定物質(zhì)含量的測定是一種新興的檢測技術(shù)，目前國內(nèi)外尚未見有利用此技術(shù)對牛乳中β-L進行研究的報道。本研究前期建立了利用蛋白芯片檢測β-L的檢測平臺，并對此平臺的檢測條件進行了優(yōu)化與確定。本研究對蛋白芯片檢測β-L檢測平臺的檢測性能進行綜合評價，研究中所使用的芯片掃描儀(LuxScanTM10K Microarray Scanner)含有雙激光發(fā)射器，采用了包括光學(xué)、信號處理和運動控制系統(tǒng)在內(nèi)的10余項獨特技術(shù)，是進行高、中、低密度微陣列芯片檢測與分析的必備工具。芯片掃描儀采用532 nm和635 nm兩種激發(fā)波長，配合專業(yè)設(shè)計的信號采集與處理電路，從而使得該儀器具有良好的線性動態(tài)范圍和極高的檢測靈敏度。在本研究中芯片掃描儀充分發(fā)揮了技術(shù)優(yōu)勢，為獲得最終的評價結(jié)果提供了有力的技術(shù)支持。

檢測性能評價包括精密度評價，即批內(nèi)精密度與批間精密度；準確度評價，即稀釋回收率、加標回收率和方法學(xué)對照。這些指標分別可以從不同角度對所建立的檢測平臺的實用性能進行性能檢驗。關(guān)于批間精密度實驗的天數(shù)，不同的文獻有不同的報道[9-12]。本研究選擇檢測4 d，每日2個批次的實驗方式主要取決于本實驗室對同一樣品的重復(fù)驗證≤4 d或8次，因此本研究中所選擇的實驗天數(shù)與次數(shù)能夠滿足對批間精密度的評價要求。在本平臺進入生產(chǎn)階段時，將按照生產(chǎn)要求對精密度時間與次數(shù)重新進行評價。此外，本平臺的批內(nèi)變異系數(shù)均＜18%，批間變異系數(shù)均＜30%，這主要與實驗操作人員的熟練程度有關(guān)。本檢測平臺雖然在點制抗體與掃描階段都已實現(xiàn)一致性高的機械化操作，但在整個流程中仍存在多次手工操作的步驟，因此不熟練的手工操作是導(dǎo)致精密度偏高的主要原因。在后續(xù)的產(chǎn)品應(yīng)用階段中，如果提高操作人員熟練度，可以實現(xiàn)批間精密度低于20%的水平。目前，對于總精密度的認識還存在分歧，但按照蘇敏等[13]對總精密度的計算方法，可以分析出本研究中不同批次間差異與不同天數(shù)之間的差異是引起總精密度不理想的主要原因。因此，在產(chǎn)品應(yīng)用階段，從提高操作人員熟練程度出發(fā)，充分做好操作人員的上崗前培訓(xùn)、盡量減少其操作偏倚，進而降低不同批次間與不同檢測天次間的操作誤差。

稀釋回收率實驗結(jié)果顯示，回收率隨著稀釋次數(shù)的增多而減小，主要與連續(xù)稀釋時的操作偏倚有關(guān)。在后續(xù)的產(chǎn)品階段加強操作人員培訓(xùn)，或減少連續(xù)稀釋次數(shù)，可以使這一結(jié)果得到提高。在加標回收率實驗中，本研究參照吳樹宏等[7]和伍云卿等[8]的方法，對3種濃度的基礎(chǔ)液，分別加入基礎(chǔ)液體積1%的高濃度標液(67150 ng/ml)。本研究結(jié)果表明，最高濃度的基礎(chǔ)液回收效果不大理想。根據(jù)這一情況，在未來的產(chǎn)品應(yīng)用階段，應(yīng)將待測樣本按比例稀釋在標準曲線的中、低濃度范圍內(nèi)，以便獲得更為準確的檢測結(jié)果。

對方法學(xué)對照實驗的結(jié)果顯示，本研究所建立的平臺與目前在用的ELISA試劑盒之間具有較好的一致性。由于生物學(xué)檢測實驗無金標準，因此根據(jù)目前的實驗結(jié)果無法判斷哪種方法是更優(yōu)。

4 結(jié)語

本研究提供了一種新的與ELISA試劑盒等效的檢測方法，現(xiàn)有的實驗結(jié)果表明，這一方法已經(jīng)能夠滿足本實驗室的檢測需求。

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A methodology evaluation of detecting β-lactoglobulin by using proteinchip

YIN Ji-yong,HUO Jun-sheng, MA Xin-xin, et al

Objective:To evaluate the platform of proteinchip that established in the earlier stage of our study and was used to detect β-lactoglobulin in cow milk.Methods:Triplet cow milk samples were used to implement within-run precision of 8 repeats and other triplet cow milk samples were used to implement between-run precision of 8 batches. The high concentration standard was consecutively diluted so as to obtain dilution recovery. Three concentrations of standard substance were used to implement recovery experiment. And 10 cow milk samples were detected by proteinchip platform and commercial ELISA Kit, respectively.Results:The within-run precision and betweenrun precision were 11.18%-17.62% and 25.10%-29.96%, respectively. The dilution recovery and recovery were 104.27%-128.15% and 45.98%-129.33%, respectively. The relevant coefficient of the two detection methods was 0.958 and it was significant (t=9.46, P＜0.05), and the result of paired t test showed that there was no difference between the two methods (t=-2.592, P＞0.01).Conclusion:The platform of proteinchip for detecting β-Lactoglobulin in cow milk which was established in earlier stage of our research can satisfy the requirement of laboratory of prophylactic medicine, while its operation error need be further optimized.

Proteinchip; β-Lactoglobulin; Detection platform; Evaluation

National Institute for Nutrition and Health, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China.

1672-8270(2017)11-0143-04

R446.62

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.11.042

殷繼永,男,(1975- ),博士，副研究員。中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)研究。

中國疾病預(yù)防控制中心青年科研基金(2015A202)“蛋白質(zhì)芯片技術(shù)定量檢測牛乳中主要蛋白質(zhì)的檢測平臺的建立”

①中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所 北京 100050

*通訊作者：jshuo@263.net.cn

China Medical Equipment,2017,14(11):143-146.

2017-10-19