胡 澄，蔣日磊，郭園園，張 旭，陳美娟

(南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

非小細(xì)胞肺癌 ( non-small cell lung cancer, NSCLC) 是全世界范圍內(nèi)肺癌致死的主要原因，也是肺惡性腫瘤的主要病理類型。NSCLC 的臨床和實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)研究盡管已取得了較大進(jìn)展，但其預(yù)后仍不理想[1]。細(xì)胞周期是保證細(xì)胞正常生命活動(dòng)的基本過程，通過細(xì)胞周期時(shí)相的有序變遷，細(xì)胞進(jìn)入增殖、分化、衰老和死亡等生理狀態(tài)。通過對腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控可以有效抑制腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展及其增殖能力。

麥冬皂苷B(ophiopogonin-B, OP-B)對NSCLC細(xì)胞株有廣譜性的增殖抑制作用，前期研究表明OP-B可明顯阻滯H460細(xì)胞的細(xì)胞周期在G0/G1期[2]，但導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯的相關(guān)原因并不清楚。本研究中，我們通過免疫組化及細(xì)胞核染色觀察OP-B對H460細(xì)胞有絲分裂的影響，通過對調(diào)控細(xì)胞周期的相關(guān)蛋白信號(hào)通路進(jìn)行Western blot檢測，試圖發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致周期阻滯及有絲分裂受限的主要原因，為OP-B的藥理學(xué)作用機(jī)制研究進(jìn)一步提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 NSCLC細(xì)胞株NCI-H460購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.2試劑 麥冬皂苷-B購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司 (ZL20110412B)，用二甲亞砜(DMSO)配成10 mmol·L-1的貯備液備用，細(xì)胞中使用時(shí)DMSO的最終濃度小于0.01%。胎牛血清及DMEM培養(yǎng)液購自Gibco公司；胰酶、牛血清白蛋白(BSA)、凝膠配制試劑盒、十字孢堿，均購自碧云天生物技術(shù)研究所； cyclinD1、cyclinD3、cyclinA2、cyclinE2、cyclinB1、CDK2、CDK4、CDK6、Myt1、p-Cdc2(Tyr15)、p-histone H3(Ser10)、p15、p21、p27、β-actin一抗及羊抗兔、羊抗鼠二抗、DAPI，均購自Cell Signaling公司；TUNEL 檢測試劑盒 (美國Roche B.M)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及給藥處理 將H460細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化，接種于6孔板。培養(yǎng)過夜后，分別給予0、5、10μmol·L-1的OP-B作用24 h，同時(shí)給予1μmol·L-1的十字孢堿作對照處理組，用作細(xì)胞核形態(tài)觀察。

1.2.2TUNEL免疫組化 將細(xì)胞以 2×108·L-1的密度接種到6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞貼壁后給藥處理。將爬片細(xì)胞在4%多聚甲醛中室溫固定25 min； PBS浸洗2次；0.2%的Triton X-100透化細(xì)胞5 min；PBS浸洗2次；新鮮配制的3% H2O2室溫處理細(xì)胞5 min； PBS浸洗2次；玻片干后，加50 μL TUNEL 反應(yīng)混合液(TdT與dUTP按1∶9混合)于細(xì)胞上，陰性對照組僅加50 μL dUTP液，避光濕盒37℃反應(yīng)60 min；PBS浸洗3次；玻片干后，加50 μL converter-POD 于細(xì)胞上，避光濕盒37℃反應(yīng)30 min；PBS浸洗3次；加100 μL DAB顯色劑，室溫反應(yīng)10 min；PBS浸洗3次；蘇木精復(fù)染數(shù)秒，立即用自來水沖洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每張切片在高倍鏡下(×200和 ×400)隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的視野進(jìn)行拍照。

1.2.3DAPI染色 H460細(xì)胞提前1 d接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，次日進(jìn)行OP-B給藥(10μmol·L-1)24 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS 洗細(xì)胞3次，加入DAPI(1 mg·L-1)室溫避光染色5 min，PBS洗滌細(xì)胞之后，于熒光倒置顯微鏡(徠卡DM18)下觀察并拍照(×200)。

1.2.4Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白變化 取對數(shù)生長期細(xì)胞消化接種到6孔板中，細(xì)胞密度為5×108·L-1。藥物處理一定時(shí)間后，收集細(xì)胞并用PBS洗滌2 次，每孔加入細(xì)胞裂解液200 μL，12 000 r·min-1離心20 min，收集蛋白并定量。取一定量的蛋白，加入5×電泳上樣緩沖液，沸水浴變性5 min，經(jīng)12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗4℃孵育過夜、二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，滴加 ECL發(fā)光液，置于Bio-Rad凝膠成像儀中曝光，并采集圖像。

2 結(jié)果

2.1OP-B對H460細(xì)胞核物質(zhì)及形態(tài)的影響如Fig 1所示，與對照組相比，細(xì)胞經(jīng)過10 μmol·L-1的OP-B給藥后，表現(xiàn)為細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，胞質(zhì)空泡化嚴(yán)重，細(xì)胞核邊緣化，但和十字孢堿處理組相比，并未出現(xiàn)細(xì)胞核嚴(yán)重固縮的明顯細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

2.2DAPI染色觀察細(xì)胞有絲分裂Fig 2的DAPI核染色結(jié)果表明，對照組細(xì)胞核在分布和形態(tài)上較均勻，且其中明顯觀察到處于有絲分裂狀態(tài)的細(xì)胞核(箭頭所示)，十字孢堿處理組細(xì)胞則明顯出現(xiàn)核固縮的凋亡特征，而10 μmol·L-1OP-B給藥組則既沒有有絲分裂現(xiàn)象，也沒有凋亡的細(xì)胞核形態(tài)。

2.3OP-B對H460細(xì)胞周期及有絲分裂調(diào)控蛋白表達(dá)水平的影響Fig 3結(jié)果表明，5、10μmol·L-1的OP-B明顯抑制cyclinD1的表達(dá)，在10μmol·L-1濃度下對CDK4、cyclinB1也有明顯抑制，對CyclinD3、CyclinA2、CyclinE2、CDK2、CDK6無顯著影響。另外，OP-B還明顯誘導(dǎo)Myt表達(dá)升高，繼而導(dǎo)致其下游Cdc2磷酸化水平明顯上調(diào)，Cdc2的磷酸化導(dǎo)致其活性被抑制，是導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂停止的主要原因。同時(shí)，我們檢測了histoneH3在Ser10位點(diǎn)的磷酸化水平，其和細(xì)胞有絲分裂水平直接相關(guān)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在5、10μmol·L-1的OP-B作用下，p-histoneH3均被明顯抑制，表明有絲分裂的停止；在細(xì)胞周期抑制性蛋白的表達(dá)上，觀察到OP-B上調(diào)p21的表達(dá)，而對p15、p27無明顯的調(diào)控作用。

3 討論

Fig 1 Observation of OP-B on nuclear morphology and nuclear matter in H460 cells by TUNEL immunohistochemical assay

Fig 2 Observation of OP-B on cell mitosis and apoptosis in H460 cells by DAPI staining

Fig 3 Western blot detection of effects of OP-B on cell cycle and mitosis regulated proteins in H460 cells

OP-B是一種對NSCLC具有多靶點(diǎn)作用的麥冬皂苷類單體化合物[3]。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，OP-B能誘導(dǎo)H460細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，但相關(guān)的分子機(jī)制尚不清楚[2]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步通過TUNEL免疫組化及DAPI核染色進(jìn)行H460細(xì)胞核物質(zhì)及核形態(tài)的觀察，發(fā)現(xiàn)OP-B并不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而是有抑制細(xì)胞有絲分裂的跡象。

眾所周知，細(xì)胞周期分為4個(gè)時(shí)相，即G1期(DNA 及蛋白質(zhì)合成準(zhǔn)備期)、S 期(DNA 合成期)、G2期(有絲分裂準(zhǔn)備期)、M期(有絲分裂期)。在G1/S與G2/M兩個(gè)過渡期各有1個(gè)檢查點(diǎn)，分別制止G1期受損DNA進(jìn)入S期進(jìn)行復(fù)制和G2期受損DNA進(jìn)入M期進(jìn)行有絲分裂，從而中止細(xì)胞周期。

細(xì)胞周期蛋白(cyclin)是細(xì)胞周期調(diào)控的變速器，細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK) 是細(xì)胞周期調(diào)控的發(fā)動(dòng)機(jī)，只有二者有機(jī)結(jié)合成cyclin/CDK復(fù)合物，并且作用于不同底物，才能對細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期運(yùn)行等過程進(jìn)行調(diào)控[4]。CyclinD1是調(diào)控細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白，其結(jié)合并激活G1期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，繼而G1期周期抑制蛋白(Rb)發(fā)生磷酸化，并從E2F轉(zhuǎn)錄因子上解離，使E2F轉(zhuǎn)錄因子起始轉(zhuǎn)錄激活細(xì)胞周期的基因，從而推動(dòng)細(xì)胞周期由G1時(shí)期進(jìn)入到S時(shí)期[5]。CyclinE主要在G1晚期發(fā)揮作用[6-7]。CyclinE-CDK2為細(xì)胞從G1進(jìn)入S期的關(guān)鍵激酶復(fù)合物[8-10]。CyclinE與CDK2結(jié)合后, 磷酸化其底物蛋白, 如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)、pRb家族成員p107、CDC6、定位于AT位點(diǎn)的核蛋白 p220(NPAT)等, 使DNA合成得以進(jìn)行, 細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。另外，有絲分裂調(diào)控的焦點(diǎn)是MPF，它由調(diào)節(jié)亞基cyclinB1和催化亞基CDK1組成，其活性調(diào)節(jié)在有絲分裂起始、中后期轉(zhuǎn)換以及有絲分裂退出調(diào)控中起重要作用。MPF活性主要受其催化亞基CDK1磷酸化/去磷酸化的調(diào)控以及其調(diào)節(jié)亞基cyclin B1的合成、亞細(xì)胞定位以及降解的調(diào)控。在G1期，cyclinB1蛋白水平極低；在S、G2期，其表達(dá)水平逐漸升高，并與CDK1形成MPF酶復(fù)合物，此時(shí)MPF主要定位于中心體，其催化亞基CDK1被Wee1、Myt1磷酸化而處于失活狀態(tài)[11]；在G2晚期，cyclinB1蛋白水平達(dá)到峰值，同時(shí)其N端發(fā)生磷酸化，促使MPF快速轉(zhuǎn)移入核，在CDC25C的作用下，CDK1去磷酸化，其活性抑制被解除，從而導(dǎo)致MPF被活化[12]?；罨腗PF磷酸化有絲分裂相關(guān)蛋白，如核纖層蛋白、組蛋白、微管蛋白等，導(dǎo)致核膜崩解、染色體凝集、有絲分裂微管形成，從而促使細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期[13-14]。

細(xì)胞周期的調(diào)控蛋白還有CKIs，其通過競爭性地抑制cyclin或cyclin/CDK復(fù)合物，導(dǎo)致cyclin生物學(xué)功能喪失，從而對細(xì)胞生長起負(fù)調(diào)控作用。目前發(fā)現(xiàn)的CKI分為Ink4 (inhibitor of CDK4)和Kip (kinase inhibition protein)兩大家族。Ink4包括P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c和P19ink4d，特異性抑制CDK4/cyclinD1、CDK6/cyclinD1復(fù)合物；Kip包括P21cip1(cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)和P57kip2等，能抑制大多數(shù) CDK 的激酶活性。

通過對細(xì)胞周期和有絲分裂調(diào)控蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，G0/G1期周期調(diào)控蛋白cyclinD1、cyclinE2、CDK4、cyclinB1的表達(dá)均被OP-B明顯抑制。另外，p-histoneH3(Ser10)水平代表著細(xì)胞的有絲分裂水平，我們觀察到OP-B給藥后明顯抑制了p-histoneH3(Ser10)水平，表明細(xì)胞有絲分裂的停滯，而導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂被阻止的直接原因就是OP-B明顯上調(diào)了Myt的表達(dá)水平及Cdc2的磷酸化水平，OP-B調(diào)控Myt /Cdc2信號(hào)通路的相關(guān)機(jī)制將有待進(jìn)一步探討。

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