， ， ,2， ， ，

(1.河南科技學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.新鄉(xiāng)市第二十八中學(xué)， 河南 新鄉(xiāng) 453000)

人工老化對(duì)小麥種子活力及醇溶蛋白組成的影響

張自陽(yáng)1，馬景周1，王智煜1,2，朱啟迪1，茹振鋼1，劉明久1

(1.河南科技學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.新鄉(xiāng)市第二十八中學(xué)， 河南 新鄉(xiāng) 453000)

為揭示種子活力與醇溶蛋白組成變化的關(guān)系，以小麥品種百農(nóng)矮抗58、周麥18、新麥208、鄭麥9023和雜交小麥(BNS/05525)為材料，高溫(43±1)℃、高濕(95%相對(duì)濕度)老化處理0，4，6，9，12，15 d和20 d，對(duì)老化處理種子的活力及醇溶蛋白組成進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)，小麥種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)逐漸降低，老化20 d的小麥種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均降為0，種子活力喪失。在同一老化程度下，雜交小麥種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均高于百農(nóng)矮抗58、周麥18、新麥208、鄭麥9023，說(shuō)明雜交小麥的抗老化能力較強(qiáng)；電導(dǎo)率在種子老化的0～12 d內(nèi)變化較小，種子老化到15 d時(shí)電導(dǎo)率迅速升高；5個(gè)小麥品種種子老化20 d后，發(fā)芽率從100%下降到0，醇溶蛋白的表達(dá)均出現(xiàn)了帶型的變化，ω區(qū)醇溶蛋白出現(xiàn)了譜帶的丟失、新蛋白的增加及蛋白表達(dá)量的上升和下降。種子活力喪失與蛋白的丟失、新譜帶的產(chǎn)生都是在同一時(shí)間(種子老化20 d)，說(shuō)明種子活力的喪失與ω區(qū)域醇溶蛋白的消失和新增加的蛋白質(zhì)有關(guān)；種子老化程度的加劇，導(dǎo)致了某些存活能力差的基因型消失，消失的基因可能與種子活力的表達(dá)相關(guān)。

人工老化； 小麥； 種子活力； 醇溶蛋白

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的基本資料，種子的質(zhì)量決定了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的質(zhì)和量，而種子活力是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，它與田間出苗、幼苗生長(zhǎng)勢(shì)和健壯度關(guān)系密切。種子在貯藏過(guò)程中的劣變或老化[1]不可避免，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中經(jīng)常會(huì)使用經(jīng)過(guò)貯藏的種子，儲(chǔ)藏不當(dāng)?shù)姆N子發(fā)芽率下降，田間播種導(dǎo)致斷壟缺苗，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。研究表明，種子活力與種子貯藏蛋白的關(guān)系密切[2]，許多研究將種子蛋白質(zhì)的變化作為種子活力的研究熱點(diǎn)[3-5]。在種子老化過(guò)程中，種子貯藏物質(zhì)如可溶性糖、蛋白質(zhì)等經(jīng)歷了一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程。種子貯藏蛋白中的醇溶蛋白在種子萌發(fā)后為幼苗的生長(zhǎng)提供各種氨基酸和含氮化合物，對(duì)種子的萌發(fā)和早期生長(zhǎng)作用重大[6-8]。但是，對(duì)于種子活力、種子萌發(fā)與其醇溶蛋白組成和表達(dá)量變化關(guān)系尚不明確，對(duì)于種子活力喪失的機(jī)制尚不完全清楚，筆者于2014年研究了老化20 d的小麥種子醇溶蛋白組成的變化，發(fā)現(xiàn)老化20 d小麥種子醇溶蛋白ω區(qū)域的蛋白質(zhì)出現(xiàn)了丟失和部分增加的現(xiàn)象，初步推斷丟失的蛋白質(zhì)與種子活力存在相關(guān)性[9]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，探討種子活力下降過(guò)程中醇溶蛋白的變化，探究種子活力與醇溶蛋白組成變化的關(guān)系，本試驗(yàn)以5個(gè)小麥品種為材料，通過(guò)人工老化的方法逐步降低小麥的種子活力，研究種子活力下降過(guò)程中種子活力及醇溶蛋白組成的變化，進(jìn)一步揭示種子活力下降與醇溶蛋白組成變化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為百農(nóng)矮抗58、新麥208、鄭麥9023、周麥18、雜交小麥(BNS/05525)，由河南科技學(xué)院小麥中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 人工加速老化處理

人工加速老化處理采用張自陽(yáng)等[9]的方法，試驗(yàn)材料放于LH-150 S種子老化箱[溫度：(43±1 )℃；相對(duì)濕度：95%]中分別處理20，15，12，9，6，4 d，處理后自然晾干，放入4 ℃冰箱備用，以未老化處理的種子為對(duì)照。

1.2.2 種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)的測(cè)定

采用張自陽(yáng)等[10]的方法做標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)，每個(gè)品種100粒種子，重復(fù)4次，在20 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)，每天記載發(fā)芽數(shù)，第4天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，發(fā)芽結(jié)束測(cè)定正常單株幼苗鮮重，并計(jì)算發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

發(fā)芽勢(shì)(%)=第4天發(fā)芽種子數(shù)/檢測(cè)種子總數(shù)×100%;

發(fā)芽率(%)=第7天發(fā)芽種子數(shù)/檢測(cè)種子總數(shù)×100%;

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt);

活力指數(shù)(VI)=GI×S;

式中：Gt為當(dāng)天的發(fā)芽數(shù)，Dt為當(dāng)日天數(shù)，S為發(fā)芽結(jié)束時(shí)單株幼苗鮮重。

1.2.3 電導(dǎo)率的測(cè)定，醇溶蛋白提取及聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用張自陽(yáng)等[9]的方法測(cè)定種子電導(dǎo)率、提取醇溶蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 老化處理對(duì)小麥發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率的影響

從圖1可知，5個(gè)小麥品種的種子隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)，種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率隨著老化天數(shù)增加呈逐漸下降趨勢(shì)，老化20 d的小麥種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)均為0，表明種子已完全失去活力。老化4～9 d的種子發(fā)芽率下降緩慢，老化15 d的種子發(fā)芽率呈急劇下降的趨勢(shì)；百農(nóng)矮抗58、周麥18、雜交小麥在老化4～9 d內(nèi)，種子發(fā)芽勢(shì)下降緩慢，老化到第12天時(shí)發(fā)芽勢(shì)急劇下降。新麥208、鄭麥9023在老化至9 d時(shí)發(fā)芽勢(shì)驟降。

2.2 老化處理對(duì)小麥發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)的影響

由圖2可知，5個(gè)小麥品種的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)隨著老化程度的加深而逐漸降低。當(dāng)老化處理時(shí)間達(dá)到20 d時(shí)發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)為0。5個(gè)小麥品種的發(fā)芽指數(shù)在老化0～6 d時(shí)下降緩慢，當(dāng)老化至9 d時(shí)發(fā)芽指數(shù)下降迅速。發(fā)芽指數(shù)在種子老化至6 d時(shí)表現(xiàn)為急速下降。

從圖2結(jié)果還可知，雜交小麥在不同的老化程度下，發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均高于百農(nóng)矮抗58、周麥18、新麥208、鄭麥9023，表明雜交小麥的抗老化能力較強(qiáng)。

2.3 老化處理對(duì)小麥種子電導(dǎo)率的影響

由圖3可知，5個(gè)小麥品種的種子在老化0～12 d內(nèi)，電導(dǎo)率變化比較平緩，當(dāng)種子老化15 d時(shí)，種子電導(dǎo)率迅速增大。

2.4 老化處理對(duì)小麥種子醇溶蛋白組成的影響

由圖4，5，6，7，8可知，與未老化處理種子相比，5個(gè)小麥品種種子經(jīng)酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，人工老化4，6，9，12 d和15 d的小麥種子譜帶沒(méi)有發(fā)生變化，人工老化20 d的種子醇溶蛋白出現(xiàn)了譜帶丟失、增加、表達(dá)量的上升和下降的現(xiàn)象。

圖1 人工老化對(duì)不同小麥品種發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)的影響

圖3 人工老化對(duì)不同小麥品種電導(dǎo)率的影響

由圖4可以看出，與對(duì)照相比，老化20 d后，百農(nóng)矮抗58醇溶蛋白ω蛋白區(qū)ω 2、ω 3完全消失。在老化的4～15 d內(nèi)，隨老化天數(shù)的增加百農(nóng)矮抗58的醇溶蛋白ω蛋白區(qū)ω 4、ω 6、ω 7、ω 8、γ蛋白區(qū)的γ 1表達(dá)量有所增加。

由圖5可知，新麥208在老化20 d后醇溶蛋白ω 3譜帶丟失、同時(shí)出現(xiàn)了新的ω 4、ω 8 2條譜帶。

由圖6可知，鄭麥9023在老化20 d后醇溶蛋白ω 1表達(dá)量升高，ω 2蛋白譜帶丟失，新出現(xiàn)了ω 3、ω 4、ω 6 三條醇溶蛋白譜帶。

由圖7可以看出，老化20 d的周麥18種子醇溶蛋白ω區(qū)ω 2譜帶消失，ω 4表達(dá)量嚴(yán)重下降，幾乎消失，同時(shí)出現(xiàn)了1條表達(dá)量比較弱的ω 3譜帶。

由圖8可以看出，雜交小麥在老化20 d后醇溶蛋白ω 3、ω 4譜帶消失，ω 2表達(dá)量降低，新出現(xiàn)了1條ω 0譜帶。

注：A0為中國(guó)春；ck為未老化種子；4,6,9,12,15,20 分別代表老化4,6,9,12,15,20 d的種子。下同。圖4 不同老化程度百農(nóng)矮抗58種子醇溶蛋白電泳圖譜

圖5 不同老化程度新麥208種子醇溶蛋白電泳圖譜

圖6 不同老化程度鄭麥9023種子醇溶蛋白電泳圖譜

3 討 論

由于高溫、高濕環(huán)境可以加速種子衰老，同時(shí)又是研究種子活力衰退的一種快速方法。由結(jié)果分析可知，5個(gè)小麥品種種子經(jīng)過(guò)人工老化后，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均隨老化時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明人工老化導(dǎo)致了小麥種子活力下降。反映種子活力變化的發(fā)芽指標(biāo)變化幅度依次為活力指數(shù)>發(fā)芽指數(shù)>發(fā)芽勢(shì)>發(fā)芽率，說(shuō)明活力指數(shù)能更靈敏地反映種子活力水平和老化程度,這與劉旭歡等[12-13]研究結(jié)果一致。同時(shí)可以看出，雜交小麥與百農(nóng)矮抗58、周麥18、鄭麥9023、新麥208相比，在老化程度一樣的情況下，雜交小麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均高于其它4個(gè)常規(guī)品種，說(shuō)明雜交小麥的抗老化能力較強(qiáng)。

圖7 不同老化程度周麥18種子醇溶蛋白電泳圖譜

圖8 不同老化程度雜交小麥種子醇溶蛋白電泳圖譜

電導(dǎo)率測(cè)定法是測(cè)定種子活力較簡(jiǎn)易、快速的方法，有研究表明，電導(dǎo)率與人工老化種子活力之間密切相關(guān)[14-16]。本研究結(jié)果表明，5個(gè)小麥品種的種子在老化0～12 d內(nèi)，電導(dǎo)率變化較小，當(dāng)種子老化15 d時(shí)，種子電導(dǎo)率才迅速增大，種子活力的下降與電導(dǎo)率的變化相關(guān)性較小。

種子老化過(guò)程中內(nèi)部會(huì)發(fā)生了一系列的生理化學(xué)反應(yīng)，誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的種類、數(shù)量或存在形式也因此發(fā)生改變[17]。種子中的貯藏蛋白在種子老化期間下降[18-19]，甚至?xí)霈F(xiàn)新的蛋白質(zhì)[9,20]。本研究結(jié)果表明，5個(gè)小麥品種的種子老化20 d，發(fā)芽率從100%下降到0，醇溶蛋白的表達(dá)出現(xiàn)了帶型的變化，即譜帶(醇溶蛋白)的丟失及新蛋白的增加，這與張晗等[21]的研究結(jié)果相似。百農(nóng)矮抗58的醇溶蛋白ω 4、ω 6、ω 7、ω 8、γ蛋白區(qū)的γ 1表達(dá)量有所增加；新麥208 ω蛋白區(qū)ω 1表達(dá)量增加，同時(shí)出現(xiàn)了ω 4、ω 8兩條新譜帶；鄭麥9023 ω蛋白區(qū)ω 1表達(dá)量升高，新出現(xiàn)了ω 3、ω 4、ω 6 3條譜帶；周麥18種子醇溶蛋白ω區(qū)ω 4表達(dá)量嚴(yán)重下降，幾乎消失，出現(xiàn)了1條表達(dá)量比較弱的ω 3譜帶；雜交小麥在老化20 d后醇溶蛋白ω 3、ω 4譜帶消失，ω 2表達(dá)量降低，新出現(xiàn)了1條ω 0譜帶。老化20 d的小麥種子發(fā)芽率為0，種子活力喪失，種子失活與蛋白的丟失、新譜帶(醇溶蛋白)的產(chǎn)生是在同一時(shí)期，說(shuō)明種子活力與消失和增加的蛋白質(zhì)有關(guān)，這與吳曉亮等的研究結(jié)果相似[22-23]。種子萌發(fā)需要蛋白質(zhì)的合成[24]，蛋白表達(dá)量的下調(diào)引起種子不能合成新的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致植物體發(fā)芽所需的能量供應(yīng)不足，從而降低了種子發(fā)芽率。蛋白的消失使種子萌發(fā)失去能量來(lái)源導(dǎo)致種子失活，種子貯藏物質(zhì)中蛋白質(zhì)分解應(yīng)是種子老化或種子活力喪失的顯著特征及最可能的原因。醇溶蛋白是種子發(fā)育特定時(shí)期的基因產(chǎn)物。它的基因定位在第1和第6部分同源染色體的短臂上，全部γ和ω醇溶蛋白基因位于第1部分同源染色體短臂上，編碼基因?yàn)镚li-1。種子老化到一定程度時(shí)外在逆境使遺傳組成可能發(fā)生了變化，隨著種子老化的加劇，導(dǎo)致了某些存活能力差的基因型的消失[25]，消失的基因可能與種子活力的表達(dá)相關(guān)。

[1]Elena A G Hank V A,Folkert A H.Membrane chemical stability and seed longevity[J].European Biophysics Journal,2010,39(4):657-668.

[2]劉軍,黃上志,傅家瑞,等.種子活力與蛋白質(zhì)關(guān)系的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào),2001,18(1):46-51.

[3]王繼紅,陳紹寧,白冰,等.人工老化對(duì)玉米種子蛋白質(zhì)組的影響[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,43(3):232-235.

[4]周峰.種子貯藏蛋白質(zhì)豐度研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,44(1):1-3,76.

[5]舒英杰,陶源,王爽,等.高等植物種子活力的生物學(xué)研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào),2013,33(8):1 709-1 706.

[6]Muntz K,Belozersky MA,Dunaevsky YE,et al.Stored proteinases and the initiation of storage protein mobilization in seeds during germination and seedling growth[J].Journal of Experimental Botany,2001,52(362):1 741-1 752.

[7]Tiedemann J,Neubohn B,Muntz K. Different functions of vicilin and legumin are reflected in the histopaettern of globulin mobilization during germination of vetch (ViciasativaL.)[J].Planta,2000,211(1):1-12.

[8]Tiedemann J,Schlereth A,Muntz K.Differential tissue-specific expression of cysteine proteinases forms the basis for the fine-tuned mobilization of storage globulin during and after germination in legume seeds[J].Planta,2001,212(5-6):728-738.

[9]張自陽(yáng),茹振鋼,劉明久,等.人工老化小麥種子的活力與醇溶蛋白、谷蛋白組成分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,43(2):24-27.

[10]張自陽(yáng),朱俊華,程媛,等.不同成熟度小麥種子活力及其與生理性狀的相關(guān)性研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,43(12):6-9.

[11]張自陽(yáng),姜小苓,茹振鋼,等.人工老化對(duì)雜交小麥種子生理特性和種子活力變化的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(2):81-83.

[12]劉旭歡,賈永紅,阿里別里根·哈孜太.人工老化對(duì)春小麥種子萌發(fā)及根尖超微結(jié)構(gòu)的影響[J].西北植物學(xué)報(bào),2015,35(4):761-765.

[13]劉旭歡,加得拉·努爾蘭,童婷,等.不同老化時(shí)問(wèn)和收獲期對(duì)春小麥種子活力的影響[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,51(8):1 394-1 399.

[14]梁海榮,邢侗姬,周小梅.不同活力的小麥種子生理生化及其修復(fù)的研究[J].山西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,33(2):286-290.

[15]張玲麗,郭月霞,宋喜悅.不同類型小麥品種人工老化處理后種子活力特性的研究[J].種子,2008,27(10):52-55.

[16]朱銀,顏偉,楊欣,等,電導(dǎo)法測(cè)定小麥種子活力[J],江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(9):78-80.

[17]Hochholdinger F,Sauer M,Dembinsky DN,et al.Proteomic dissection of plant development[J].Proteomics,2006,6(14),4 076-4 083.

[18]Ching TM,Schoolcraft I.Physiological and Chemical Differences in Aged seeds[J].Crop Science,1968,8(4):407-409.

[19]范國(guó)強(qiáng),秦文靜,劉玉禮.花生種子人工老化過(guò)程中發(fā)芽率和蛋白質(zhì)的變化[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1995(4):337-340.

[20]王繼紅,陳紹寧,白冰,等.人工老化對(duì)玉米種子蛋白質(zhì)組的影響[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,44(3):232-235.

[21]張晗,盧新雄,張志娥,等.種子老化誘導(dǎo)小麥染色體畸變及大麥醇溶蛋白帶型頻率變化的研究[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)2004,5(1):56-61.

[22]吳曉亮,陳曉玲,辛萍萍,等.超干燥處理對(duì)豌豆種子抗氧化系統(tǒng)酶及熱穩(wěn)定蛋白的影響[J].園藝學(xué)報(bào),2006,33(3):523-528.

[23]董貴俊.向日葵(HelianthusannuusL.)種質(zhì)資源的基礎(chǔ)研究[D].北京:中國(guó)科學(xué)院,2006.

[24]Rajjou L,Gallardo,K,Debeaujon L,et al.The effect of α-amanitin on the Arabidopsis seed proteome highlights the distinct roles of stored and neosynthesized mRNAs during germination[J].Plant Physiology,2004,134(4):1598-1613.

[25]Parzies H K,Spoor W,Ennos R A.Genetic diversity of barley landrace accessions (Hordeumvullgaressp.vulgare)conserved for different lengths of time in ex situ gene banks.Heredity,2000,84(4):476-486.

Effects of Aging Treatment on Seed Vigor and Constitutes of Gliadin in Wheat

ZHANGZiyang1,MAJingzhou1,WANGZhiyu1，2,ZHUQidi1,RUZhen’gang1,LIUMingjiu1

(1.He’nan Institute of Science and Technology，Xinxiang He’nan 453003，China； 2.Xinxiang No.28 Middle School，Xinxiang He’nan 453000，China)

In order to investigate the relationship of seed vigor and gliadin composition,Bainong aikang 58,Zhoumai 18,Xinmai 208,Zhengmai 9023 and hybrid wheat seed(BNS/05525) were studied by using artificial accelerated aging(temperature:(43±1)℃,RH:95%) with aging 0,4,6,9,12,15 and 20 days.The seeds vigor and gliadin composition which were aged were analyzed.The result show that wheat seed germination potential,germination rate,germination index,vitality index were gradual decrement trend,the wheat seed losing germination ability when it aging 20 days.The germination germination potential,germination rate,germination index,vitality index of hybrid wheat seed were higher than Bainong aikang 58,Zhoumai 18,Xinmai 208,Zhengmai 9023 under the same aging degree,which illustrate hybrid wheat with a strong anti-aging ability.The conductivity of seeds were changes slightly within the seed aging 0-12 days,it rise rapidly when the seed aging to 15 days.The gliadin composition were changed and the loss of the band,the new protein increased and the rise and fall of the amount of protein expression,the seed germination percentage decreased from 100% to 0 after aging of 20 d.The loss of seed vigor were connected with the disappearance of the gliadin and the appearance of new proteins,because they happened at the same time. Because of the intensification of seed aging,some poor survivability genotype were disappeard,which the disappearance of genes may be associated with the expression of seed vigor.

artificial aging； wheat； seed vigor； gliadin

2017-01-10

科技部創(chuàng)新方法工作專項(xiàng)項(xiàng)目(2015 IM 010400)；河南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(162300410142)；河南科技學(xué)院青年教師資助計(jì)劃(201010714004)。

張自陽(yáng)(1984—)，男，河南舞鋼人；實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事作物遺傳育種研究；E-mail:lanfeng0615@163.com。

劉明久(1966—)，男，河南獲嘉人；教授，主要從事種子學(xué)的教學(xué)和科研工作；E-mail:liumingjiu@hist.edu.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.08.042

S 512.1

A

1001-4705(2017)08-0042-06