，

(貴州大學(xué)， 貴陽 550025)

巴西、印度玉米材料新選自交系的遺傳多樣性研究

張開武，彭忠華

(貴州大學(xué)， 貴陽 550025)

利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，選用均勻覆蓋玉米基因組的32對(duì)帶型穩(wěn)定、多態(tài)性好的引物，研究了 33份巴西、印度玉米材料新選的自交系和6份國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種的遺傳多樣性。結(jié)果表明，32對(duì)引物總共檢測(cè)到147個(gè)等位基因；每對(duì)引物檢測(cè)到的基因位點(diǎn)變化范圍為3～8個(gè),平均為4.59個(gè)；每個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)信息量(PIC)變化幅度為0.546 4～0.862 4,平均為0.732 6；39份自交系間的遺傳相似系數(shù)幅度為0.156 2～0.843 7 ，平均值為0.517 7。按UPGMA聚類方法，39份自交系可以劃分為6大類型，與已知系譜來源基本一致。初步劃分了雜種優(yōu)勢(shì)群。

巴西、印度玉米； 遺傳多樣性； 聚類分析

玉米是我國重要的糧食、飼料和工業(yè)原料，在國家糧食安全戰(zhàn)略和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有至關(guān)重要的地位?！凹Z安天下，種鑄基礎(chǔ)”，種質(zhì)資源是玉米育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，優(yōu)異的玉米種質(zhì)資源的挖掘、發(fā)現(xiàn)與利用是玉米育種成功的關(guān)鍵。自“雜種優(yōu)勢(shì)”概念的提出及運(yùn)用于玉米育種實(shí)踐后，隨著玉米雜交種的推廣，玉米種質(zhì)資源的匱乏且遺傳基礎(chǔ)狹窄已經(jīng)成為玉米育種界的共識(shí)。20世紀(jì)70年代開始，我國便開始從墨西哥、中南美洲等玉米起源和遺傳多樣性中心引進(jìn)了熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)資源。在熱帶、亞熱帶獨(dú)特的自然環(huán)境下的玉米材料生長茂盛，根系發(fā)達(dá)，持綠性好，使其在不良環(huán)境下具有較強(qiáng)的抗病性和抗逆性等優(yōu)點(diǎn)。由于熱帶、亞熱帶玉米的光溫反應(yīng)較強(qiáng)，且與溫帶玉米種質(zhì)交流少，遺傳差異大，故而與溫?zé)岱N質(zhì)互導(dǎo)成為種質(zhì)改良的重要手段之一。巴西、印度玉米材料不僅具有熱帶、亞熱帶種質(zhì)資源的優(yōu)點(diǎn)，而且還具有較高配合力等特點(diǎn)。目前，玉米育種主要是利用“雜種優(yōu)勢(shì)”、“難在選系，重在組配”。關(guān)鍵是對(duì)親本遺傳系譜關(guān)系以及親本所在雜種優(yōu)勢(shì)群的挖掘與利用。SSR(Simple Sequence Repeat)標(biāo)記又稱微衛(wèi)星DNA(Micro-satellite DNA )，具有高度重復(fù)性、穩(wěn)定可靠性、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，SSR標(biāo)記是鑒定玉米種質(zhì)資源親緣關(guān)系的有效途徑之一。因此，本研究利用SSR分子標(biāo)記對(duì)33份巴西、印度玉米新選自交系和6份國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在分清33份巴西、印度玉米自交系之間的遺傳系譜關(guān)系及其所在的雜種優(yōu)勢(shì)群。為利用巴西、印度玉米材料提供一定的理論基礎(chǔ)，從而在玉米育種實(shí)踐中避免盲目性，提高玉米育種的工作效率。

1 材料與方法

1.1 材 料

本實(shí)驗(yàn)的33份巴西、印度玉米新選自交系和6份國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種材料名稱及系譜來源見表1，其中名稱為96、101、206、340、342、393的為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種材料，其余為巴西、印度玉米材料選系。

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取

將39份自交系材料各取4～5粒種子在恒溫箱下培養(yǎng)，至長出2、3片葉時(shí)取樣，采用CTAB法提取DNA。將樣品DNA濃度稀釋至60 ng/μL，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 SSR引物來源

本研究以DL 2000片段為DNA Maker，選擇90對(duì)均勻覆蓋全部玉米基因組的SSR引物，根據(jù)玉米遺傳和基因組數(shù)據(jù)庫(http//www.maizegdb.org)提供的SSR引物系列信息，從中篩選出32對(duì)帶型穩(wěn)定、多態(tài)性好的引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 玉米材料及其來源

編號(hào)名稱系譜來源編號(hào)名稱系譜來源195 K07(印度材料)選系21223 8201(巴西材料)雜株選系296 蘭卡斯特選系22230 F19(巴西材料)×墨白選系397 Bdsd265(印度材料)選系23236 171(巴西材料)×F19(巴西材料)選系4101 瑞德選系24240 奧瑞金×8201(巴西材料)選系5102 K07(印度材料)選系25250 171(巴西材料)×F19(巴西材料)選系6103 Bdsd87?1(印度材料)選系26263 F19(巴西材料)×墨白選系7105 Bdsd265(印度材料)選系27270 F19(巴西材料選系)8116 Bdsd265(印度材料)選系28274 瑞德×8201(巴西材料)選系9121 K07(印度材料)選系29279 S1371×F19(巴西材料)選系10125 B06(印度材料)選系30285 瑞德×F19(巴西材料)選系11130 瑞德×8201(巴西材料)選系31293 瑞德×8201(巴西材料)選系12131 地方品種×F19(巴西材料)選系32327 Bdsd265(印度材料)選系13133 黃C×8201(巴西材料)選系33340 貴州地方種選系14135 B06(印度材料)選系34342 旅大紅骨改良系15137 B06(印度材料)選系35350 Bdsd265(印度材料)選系16141 S137×F19(巴西材料)選系36363 Bdsd265(印度材料)選系17149 Bdsd87?1(印度材料)選系37377 171(巴西材料)雜株選系18159 171(巴西材料)雜株選系38393 蘇灣1群體19193 8201(巴西材料)雜株選系39396 蘭卡×8201(巴西材料)選系20206 78599選系

1.2.3 PCR擴(kuò)增、凝膠電泳、銀染、顯影

PCR擴(kuò)增體系10μL，反應(yīng)程序如下：

預(yù)變性94 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s,35個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；4 ℃保存。

制備10%的聚丙烯酰胺凝膠，將變性的PCR 產(chǎn)物2μL加入點(diǎn)樣孔，在DYY-6 C型電泳儀上電壓360 V，電泳40 min左右；然后取下膠，固定，銀染，顯影。具體方法可參考CIMMYT《Laboratory protocols》，實(shí)際操作過程中可適當(dāng)作改進(jìn)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳銀染結(jié)果顯示,在相同遷移位置上,有帶記為1,無帶記為0,缺失記為9，按照NTSYS 2.10 e軟件要求在Excel 2003上建立數(shù)據(jù)庫。

按公式GS=a/(a+b),GD=1-GS 分別計(jì)算自交系間的遺傳相似系數(shù)(Genetic Similarity )和遺傳距離(genetic distance),其中a表示基因型間共有帶數(shù)目;b表示基因型間差異帶數(shù)目。

按公式PIC=1-∑Pi2計(jì)算多態(tài)性信息量(polymorphism information content),其中Pi表示i 位點(diǎn)的等位基因頻率。

聚類分析按UPGMA(Unweighted Pair Group Method using Arithmeti Average)方法進(jìn)行。 利用NTSYS 2.10 e軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR檢測(cè)結(jié)果分析

32對(duì)引物對(duì)39份玉米自交系材料檢測(cè)到的等位基因數(shù)及多態(tài)性信息量(表2)。

由表2可以看出,在這39份玉米自交系中,32對(duì)引物總共檢測(cè)到147個(gè)等位基因，每對(duì)引物檢測(cè)到的基因位點(diǎn)變化范圍為3～8個(gè),平均為4.59個(gè)，每個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)信息量(PIC)變化幅度為0.546 4～0.862 4,平均為0.732 6.其中引物umc 1505位點(diǎn)的PIC值(0.546 4)最小,引物umc 1239位點(diǎn)的PIC值(0.862 4)最大。多態(tài)信息量(PIC)取決于檢測(cè)的等位基因的數(shù)目和它們的頻率分布。通常用來衡量座位多態(tài)性高低的程度。自交系群體PIC值越大，表明該群體的變異程度越高，在本研究中，每個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)信息量(PIC)的平均值高達(dá)0.732 6，表明了供試的39份玉米自交系遺傳差異較大，擁有豐富的遺傳多樣性基礎(chǔ)。

2.2 種質(zhì)間遺傳差異分析

根據(jù)32對(duì)引物對(duì)39份玉米自交系材料擴(kuò)增結(jié)果建立的數(shù)據(jù)庫，利用NTSYS 2.10 e軟件計(jì)算了這39份玉米自交系間的遺傳相似系數(shù)(GS)，結(jié)果得出相似系數(shù)幅度為0.156 2～0.843 7，平均值為0.517 7，其中自交系223和自交系377的遺傳相似系數(shù)最小(GS=0.156 2)，自交系250和自交系263的遺傳相似系數(shù)最大(GS=0.843 7)。表明了這39份自交系間有較大的遺傳差異，遺傳變異范圍廣。

圖1 引物bnlg 125對(duì)39份自交系材料的擴(kuò)增結(jié)果

表2 33份巴西、印度玉米自交系和6份國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種材料用SSR分析鑒定的遺傳變異

編號(hào) 引物位置等位基因數(shù)多態(tài)信息量1umc18836．0040．66682bnlg1615．0540．79433umc16811．1170．72394phi0229．0330．71475umc11498．0530．68326umc02312．0340．77537bnlg11894．0760．84158umc11674．0830．71999bnlg19313．0650．774010umc186310．0340．701511bnlg6671．1070．821112umc1538a1．1150．807913bnlg1252．0250．737114umc23813．0640．635215umc21645．0560．850216umc14127．0460．794417phi0316．0460．745118umc58096．0040．582519umc17371．1050．734420umc16124．0840．697621umc17149．0740．693722umc15056．0430．546423umc14949．0550．787924umc11276．0760．781125umc23096．0030．582526umc23327．0480．789627phi2998526．0740．827828umc17956．0530．704829phi0659．0340．739730umc123910．0340．862431umc18474．0750．641732umc16349．0330．6864

2.3 種質(zhì)間的UPGMA聚類分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算出39份玉米自交系間的遺傳相似系數(shù)矩陣，按照類平均聚類法(UPGMA)對(duì)這39份玉米自交系進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2。

2.4 喀斯特高海拔山區(qū)地方玉米自交系的多樣性分析

結(jié)果表明，39份自交系按閥值0.53可以劃分為6類：自交系95，121，149,206,223,250,263,125,137,193,230為第Ⅰ類，其中自交系206為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種，屬于78599選系優(yōu)勢(shì)群；自交系342,105,116,103為第Ⅱ類，其中自交系342為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種，應(yīng)屬于旅大紅骨雜種優(yōu)勢(shì)群；自交系97,102,96,396,159為第Ⅲ類，其中自交系96為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種，屬于蘭卡斯特雜種優(yōu)勢(shì)群；自交系240,141,236,274,135,101,279,270,285,293為第Ⅳ類，101是標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種，屬于瑞德選系優(yōu)勢(shì)群；自交系327,133,130,350,377,363,393為第Ⅴ類，其中393是標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種，屬于蘇灣雜種優(yōu)勢(shì)群，自交系340,131為第Ⅵ類，其中自交系340是測(cè)驗(yàn)種，屬于貴州地方種質(zhì)雜種優(yōu)勢(shì)群。結(jié)合已知材料系譜來源分析，這39份玉米骨干自交系的SSR標(biāo)記聚類結(jié)果與系譜來源基本一致，但也有個(gè)別材料有所偏差，如自交系130聚在蘇灣類群，系譜上其選自瑞德與8201雜株改良材料；而系譜來源于蘇灣與巴西材料的自交系141卻聚在瑞德雜種優(yōu)勢(shì)群種中，出現(xiàn)這樣的聚類結(jié)果可能是外來種質(zhì)資源多年來在貴州特殊的立體型氣候條件下種植，材料間的雜交打破基因遺傳連鎖選系的結(jié)果；因此SSR分子標(biāo)記方法用于鑒定玉米自交系材料的系譜來源具有一定的可靠性。

表3 根據(jù)SSR分析劃分39份玉米自交系的雜種優(yōu)勢(shì)群

類群 自交系 備注Ⅰ95，121，149，206，223，250，263，125，137，193，230自交系206為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種，屬于78599選系優(yōu)勢(shì)群Ⅱ342，105，116，103自交系342為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種，應(yīng)屬于旅大紅骨雜種優(yōu)勢(shì)群Ⅲ97，102，96，396，159自交系96為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種，屬于蘭卡斯特雜種優(yōu)勢(shì)群Ⅳ240，141，236，274，135，101，279，270，285，293101是標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種，屬于瑞德選系優(yōu)勢(shì)群Ⅴ327，133，130，350，377，363，393393是標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種，屬于蘇灣雜種優(yōu)勢(shì)群Ⅵ340，131340是標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種，屬于貴州地方種質(zhì)雜種優(yōu)勢(shì)群

圖2 39個(gè)玉米自交系根據(jù)SSR數(shù)據(jù)的聚類分析樹狀圖

3 結(jié)論與討論

本研究采用SSR分子標(biāo)記，對(duì)33份印度、巴西玉米材料新選自交系和6份國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種進(jìn)行種質(zhì)間的遺傳多樣性分析。結(jié)果表明,32對(duì)引物總共檢測(cè)到147個(gè)等位基因，每對(duì)引物檢測(cè)到的基因位點(diǎn)變化范圍為3～8個(gè),平均為4.59個(gè)，每個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)信息量(PIC)變化幅度為0.546 4～0.862 4,平均為0.732 6。多態(tài)信息量( PIC)取決于檢測(cè)的等位基因的數(shù)目和它們的頻率分布。通常用來衡量座位多態(tài)性高低的程度。自交系群體PIC值越大，表明該群體的變異程度越高，在本研究中，每個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)信息量(PIC)的平均值高達(dá)0.732 6，表明了新選的這33份巴西、印度玉米自交系間遺傳差異較大，遺傳變異范圍廣，遺傳多樣性豐富。而運(yùn)用類平均聚類法(UPGMA)對(duì)這39份骨干自交系進(jìn)行聚類，結(jié)果顯示，這39份玉米骨干自交系以0.53為閥值，可以分為6大類，與國內(nèi)6大標(biāo)準(zhǔn)測(cè)驗(yàn)種所在雜種優(yōu)勢(shì)群的劃分一致。表明了可選擇SSR分子標(biāo)記技術(shù)作為玉米自交系的系譜來源劃分的方法之一。

玉米種質(zhì)資源匱乏，遺傳基礎(chǔ)狹窄制約玉米育種的順利進(jìn)展，而從國外玉米起源中心引進(jìn)熱帶、亞熱帶種質(zhì)資源并對(duì)其馴化、改良、擴(kuò)增進(jìn)而利用，暫時(shí)緩解了玉米資源匱乏困境。但是，隨著大量國外玉米種質(zhì)資源的引進(jìn)，使得國內(nèi)種質(zhì)資源和國外種質(zhì)資源相互滲透而混雜，導(dǎo)致種質(zhì)資源間的血緣關(guān)系混亂不清，而SSR分子標(biāo)記技術(shù)是對(duì)自交系材料進(jìn)行系譜劃分的途徑之一，從而更加清楚玉米自交系間的血緣關(guān)系和系譜來源，提高玉米育種效率，避免盲目性。

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Research on Genetic Diversity of the New Selection Inbred Lines ofCorn Material of Brazil and India

ZHANGKaiwu，PENGZhonghua

2016-11-16

優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)“貴農(nóng)玉”系列玉米品種中試與示范(2014 G B 2 F 200259)。

張開武(1985—)，男，貴州凱里人；在讀研究生，主要從事玉米遺傳育種的研究；E-mail：zhangkaiwu110@163.com。

彭忠華(1967—)，男，貴州遵義人；教授，主要從事玉米遺傳育種的教學(xué)與研究；E-mail：pzh-1215@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.03.059

S 513

A

1001-4705(2017)03-0059-04