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(海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園林花卉研究所， ?？?571100)

黃花馬鈴苣苔不定芽高頻再生研究

潘梅，符瑞侃，戚華莎，呂德任，王景飛，黃賽

(海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園林花卉研究所， ?？?571100)

以無菌植株葉片作為外植體，從接入方式、培養(yǎng)基pH值、MS無機鹽濃度、糖濃度、植物激素種類及配比等方面研究了黃花馬鈴苣苔葉片不定芽再生的影響因素。結(jié)果表明，黃花馬鈴苣苔葉片再生芽的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L，滅菌前pH值為6.5，在此培養(yǎng)基上，葉面朝上接種的葉片經(jīng)過50 d的培養(yǎng)，可獲得100%的再生率和平均32.33個不定芽，黃花馬鈴苣苔(OreocharisflavidaMerr.)是苦苣苔科馬鈴苣苔屬多年生草本植物，生于海拔1 600～1 800 m山坡林下，是海南特有的野生花卉，分布于保亭、樂東、定安、白沙、陵水、東方、瓊海7縣市[1]。其株型緊湊，葉全部基生，具長柄，葉片卵形至寬卵形，聚傘花序傘狀，每花序具3～4花，花冠斜鐘狀，淡黃色，花期約10月，果期11月[2]。是盆栽觀賞、陰生地被的優(yōu)秀植物材料。苦苣苔科野生植物的組織培養(yǎng)與快速繁殖已有報道[3-14]，多以葉片作為誘導(dǎo)外植體，但對不定芽的再生均無詳細(xì)的研究，而葉片不定芽的高效再生是苦苣苔科植物組培快繁的最為關(guān)鍵的步驟之一。目前，對黃花馬鈴苣苔的研究只有資源分布及觀賞性等方面的報道，尚無組織培養(yǎng)的研究，本屬植物的組培快繁研究也未見有報道。該試驗以黃花馬鈴苣苔無菌植株葉片作為試驗材料，對其離體培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽的相關(guān)因子進行研究，以期建立黃花馬鈴苣苔的離體快速繁殖技術(shù)，為該植物的種質(zhì)保存、繁育和開發(fā)利用等提供技術(shù)基礎(chǔ)。

黃花馬鈴苣苔； 葉片； 不定芽； 培養(yǎng)基

1 材料與方法

1.1 供試材料

植物材料采用從野外引種種植于海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶園藝研究所種質(zhì)圃的黃花馬鈴苣苔葉片，取健康幼嫩葉片進行表面滅菌培養(yǎng)所得的無菌植株葉片作為試驗材料。

培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，無特殊說明情況下，以MS為基本培養(yǎng)基，添加30.0 g/L的食用白糖，9.0 g/L的卡拉膠，滅菌前pH=6.5，培養(yǎng)溫度為(26±2)℃，光照強度為1 500 lx，光照時間9 h/d。

1.2 試驗方法

1.2.1 接入方式對不定芽再生的影響

在MS培養(yǎng)基中添加6-BA和NAA各0.1 mg/L，以葉面朝上或葉背朝上2種方式將葉片接入培養(yǎng)基上。

1.2.2 pH值對不定芽再生的影響

在MS培養(yǎng)基中添加6-BA和NAA各0.1 mg/L，pH值設(shè)置分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0。

1.2.3 無機鹽濃度對不定芽再生的影響

設(shè)置4種MS無機鹽濃度：1/4、2/4、3/4 MS和MS，分別添加6-BA和NAA各0.1 mg/L。

1.2.4 細(xì)胞分裂素種類對不定芽再生的影響

在MS+NAA 0.1 mg/L的基本培養(yǎng)基中分別添加6-BA、KT和TDZ各0.1 mg/L。

1.2.5 蔗糖濃度對不定芽再生的影響

在MS培養(yǎng)基中添加6-BA和NAA各0.1 mg/L，設(shè)置5個蔗糖濃度：10、20、30、40、50 g/L。

1.2.6 溫度對葉片不定芽再生的影響

在MS培養(yǎng)基中添加6-BA和NAA各0.1 mg/L，設(shè)置3個培養(yǎng)溫度：25、28、31 ℃。

1.2.7 光照強度對葉片不定芽再生的影響

在MS培養(yǎng)基中添加6-BA和NAA各0.1 mg/L，設(shè)置3種光照強度：1 000，1 500，2 000 lx。

1.2.8 植物激素配比對不定芽再生的影響

基本培養(yǎng)基為MS，6-BA與NAA濃度配比設(shè)置6個處理：0.1∶0.1、0.1∶0.5、0.5∶0.1、.05∶0.5、1.0∶0.1、1.0∶0.5。

1.3 數(shù)據(jù)分析

無菌植株葉片約0.5 cm×0.5 cm，無特殊說明，均是以葉面朝上接入培養(yǎng)基中(見圖1)，每種處理設(shè)3次重復(fù)，每次8袋，每袋接入3片葉，50 d后調(diào)查不定芽再生率和平均不定芽數(shù)。不定芽再生率(%)=出芽葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100%，平均不定芽數(shù)=不定芽總數(shù)/出芽葉片數(shù)。用Excel 2007和Duncan進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接入方式對不定芽再生的影響

接入15 d左右葉片外植體逐漸膨大，20 d開始出現(xiàn)愈傷組織，呈綠色透明狀，35 d左右長出翠綠色不定芽(圖2)，50 d后在葉片周邊和葉片上下面均分化出大量的不定芽。2種接入方式的不定芽再生率差值較小(見表1)，葉背接觸培養(yǎng)基的再生率為97.22%，葉面接觸培養(yǎng)基的再生率則為93.83%，平均每葉不定芽數(shù)分別為26.70個和21.62個，2種接種方式不定芽的長勢均表現(xiàn)良好，芽粗大。方差檢測結(jié)果表明，接入方式對不定芽的再生率和平均不定芽數(shù)的影響極為顯著，因此，宜以葉面朝上的接種方式進行黃花馬鈴苣苔的不定芽再生誘導(dǎo)。

表1 接入方式對黃花馬鈴苣苔不定芽再生的影響

接種方式不定芽再生率(%)平均不定芽數(shù)(個/葉)生長狀況葉背朝下97．22Aa26．70Aa芽大，長勢好葉面朝下93．83Bb21．62Bb芽大，長勢好

圖1 黃花馬鈴苣苔接種葉片

圖2 培養(yǎng)35 d分化的不定芽

2.2 pH值對不定芽再生的影響

由表2可知，黃花馬鈴苣苔的不定芽誘導(dǎo)所需的pH值較高，pH=5.0時，不定芽再生率最低，只有83.330%，誘導(dǎo)的不定芽數(shù)小而少，平均每葉僅有11.62個，愈傷組織多；pH=5.5時，不定芽再生率偏低，為86.11%，誘導(dǎo)的不定芽數(shù)有較大的提高，達到20.26個，但芽也較為細(xì)小，愈傷組織較多；pH=6.0時，不定芽再生率提高到95.46%，不定芽數(shù)與pH=5.5時差異不大，但芽較大，可見2～4張小葉，高0.2～0.5 cm，仍有較多的愈傷組織；pH=6.5時，不定芽再生率最高，達到97.10%；葉片發(fā)生不定芽的時間早，培養(yǎng)35 d時已有少量的不定芽長出，50 d每葉分化的不定芽數(shù)平均達到26.22個，且分化整齊無愈傷組織，芽較大，多為0.5～0.8 cm，有2～4張小葉；pH=7.0時，不定芽再生率下降，不定芽數(shù)減少，芽致密較小，芽長0.2～0.4 cm。經(jīng)方差分析，pH=6.5與其它各處理間不定芽再生率的差異達到極顯著或顯著性水平；平均不定芽數(shù)與其它各處理間的差異則達到極顯著性水平。因此，pH=6.5最適合黃花馬鈴苣苔的葉片培養(yǎng)。

表2 pH值對黃花馬鈴苣苔不定芽再生的影響

pH值不定芽再生率(%)平均不定芽數(shù)(個/葉)生長狀況5．083．33De11．62Cc1/3芽，2/3愈傷組織5．586．11Cd20．26Bb2/3芽，1/3愈傷組織6．095．46ABb22．04Bb2/3芽，1/3愈傷組織6．597．10Aa26．22Aa分化整齊，芽多而大7．093．94Bc21．59Bb分化整齊，芽致密較小

2.3 無機鹽濃度對不定芽再生的影響

從表3可知，各處理不定芽再生率介于95.0%～96.97%之間，其中MS、3/4 MS、2/4 MS間差異不顯著，但三者與1/4 MS間的差異達到顯著性水平；不同的無機鹽濃度對不定芽數(shù)的影響則達到極顯著性水平，對芽的生長影響也極大，1/4 MS誘導(dǎo)的不定芽生長勢差，芽少而小，多呈芽點狀，有較多的愈傷組織；2/4 MS誘導(dǎo)的不定芽小而密，發(fā)根多；3/4 MS誘導(dǎo)的芽長勢好，但芽??；MS誘導(dǎo)的不定芽生長勢好，芽體大而整齊。因此，黃花馬鈴苣苔葉片誘導(dǎo)培養(yǎng)宜選擇全量的MS。

表3 MS無機鹽濃度對黃花馬鈴苣苔不定芽再生的影響

無機鹽濃度不定芽再生率(%)平均不定芽數(shù)(個/葉)不定芽生長狀況1/4MS95．0Ab9．63Dd愈傷多，芽少而小，高0．1～0．2cm2/4MS95．65Aa13．56Cc芽小而密，高0．2～0．4cm，長根3/4MS96．97Aa19．46Bb芽小，多為0．3cmMS96．97Aa25．11Aa長勢好，芽整齊，高多為0．5cm

2.4 細(xì)胞分裂素對不定芽再生的影響

從表4可看出，6-BA對黃花馬鈴苣苔葉片不定芽的誘導(dǎo)效果最好，不定芽的再生率和不定芽數(shù)最高，分別達到98.59%和25.32個，其不定芽的再生率極顯著優(yōu)于TDZ，與KT的差異也達到顯著性水平；不定芽數(shù)則極顯著優(yōu)于KT和TDZ，KT與TDZ的差異也極顯著。從生長狀況看，不同細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的芽均生長正常，沒有玻璃化苗出現(xiàn)。含6-BA的培養(yǎng)基，愈傷組織分化整齊，不定芽長勢好，芽長；KT誘導(dǎo)的不定芽長勢也好，但仍有少量的愈傷組織，芽較為短小；而TDZ誘導(dǎo)的芽長勢差，芽小，且愈傷組織多，因此，黃花馬鈴苣苔不定芽再生的最佳細(xì)胞分裂素為6-BA。

表4 細(xì)胞分裂素對黃花馬鈴苣苔不定芽再生的影響

細(xì)胞分裂素不定芽再生率(%)平均不定芽數(shù)(個/葉)生長狀況6?BA98．59Aa25．32Aa無愈傷，芽長0．4～0．7cm，長勢好KT95．83Ab21．81Bb極少愈傷，芽長0．2～0．5cm，長勢好TDZ91．67Bc15．93Cc愈傷多，芽小，多為0．2cm，長勢差

2.5 蔗糖濃度對不定芽再生的影響

蔗糖濃度對黃花馬鈴苣苔不定芽的再生有較大的影響，過高或過低的蔗糖均不利于不定芽的誘導(dǎo)和生長(見表5)。就不定芽再生率而言，適宜的蔗糖濃度為20～40 g/L，再生率達到95%以上，20 g/L、30 g/L、40 g/L蔗糖間的差異不顯著，而三者與10 g/L和50 g/L蔗糖間的差異達到極顯著性水平。從不定芽數(shù)看，以30 g/L蔗糖濃度為佳，平均每葉不定芽數(shù)最多，達到24.56個，與其它各處理間的差異則達到顯著性水平。從生長狀況看，10～20 g/L的蔗糖培養(yǎng)50 d仍有愈傷組織未分化，其芽較小，長勢較差；40 g/L蔗糖誘導(dǎo)的芽小而密，長勢差；50 g/L蔗糖有較多的愈傷組織，芽發(fā)生晚、且小而密，長勢差，接種葉片出現(xiàn)褐化死亡；30 g/L的蔗糖誘導(dǎo)的芽整齊，高多為0.5 cm，長勢好。綜合考慮，30 g/L的蔗糖濃度最適合黃花馬鈴苣苔葉片不定芽的發(fā)生。

表5 蔗糖濃度對黃花馬鈴苣苔不定芽再生的影響

蔗糖濃度(g/L)不定芽再生率(%)平均不定芽數(shù)(個/葉)生長狀況1089．66Bb16．44Cc愈傷多，芽小，多為0．2cm，長勢較差2095．83Aa21．37Bb愈傷極少，芽小，多為0．2cm，長勢較好3097．22Aa24．56Aa芽整齊，高多為0．5cm，長勢好4096．97Aa21．64ABb芽小而密、多為0．2cm，長勢差5091．30Bb15．44Cc愈傷多，芽發(fā)生晚、小而密、多為0．2cm，長勢差，4張接種葉片褐化死亡

2.6 溫度對葉片不定芽再生的影響

從表6可看出，黃花馬鈴苣苔葉片不定芽再生率和不定芽數(shù)由高至低依次為28 ℃gt;25 ℃gt;31 ℃，25 ℃和28 ℃的不定芽再生率不定芽數(shù)接近，31 ℃培養(yǎng)條件下，不定芽再生率大幅下降至66.67%，不定芽數(shù)減少1/2以上。差異顯著性檢驗結(jié)果表明，25 ℃和28 ℃間不定芽再生率和平均不定芽數(shù)的差異不顯著，而與31 ℃間的差異極顯著。25～28 ℃時，不定芽生長良好，葉色綠；31 ℃時，芽生長勢差，芽細(xì)小，部分葉片黃化，有少量芽死亡。因此適合黃花馬鈴苣苔葉片不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)溫度為25～28 ℃。

表6 培養(yǎng)溫度對黃花馬鈴苣苔不定芽再生的影響

溫度(℃)不定芽再生率(%)平均不定芽數(shù)(個/葉)生長狀況2597．22Aa24．15Aa芽長0．3～0．6cm，長勢好2898．61Aa24．41Aa芽長0．3～0．60cm，長勢好3166．67Bb11．52Bb芽細(xì)小，芽長多為0．2cm，出現(xiàn)死芽

2.7 光照強度對葉片不定芽再生的影響

隨著光照強度的增加，黃花馬鈴苣苔不定芽再生率和平均不定芽數(shù)也隨之增高，2 000 lx的培養(yǎng)效果最好，不定芽再生率達到100%，平均每葉不定芽數(shù)最高，為28.52個(見表7)，且芽體較大，生長勢好。1 500 lx的誘導(dǎo)效果次之，不定芽再生率98.60%，平均不定芽數(shù)23.20個，芽較小，芽長0.2～0.4 cm，有少量愈傷組織；1 000 lx光照強度下，不定芽再生率低，只有88.89%，平均不定芽數(shù)13.41個，芽細(xì)小，長0.1～0.2 cm，少量接種葉片褐化死亡。從差異顯著性測驗結(jié)果看，1 500 lx和2 000 lx的不定芽再生的差異不顯著，而二者與1 000 lx的差異則極為顯著；3種光照強度對不定芽數(shù)的影響則達到極顯著水平?？梢?，黃花馬鈴苣苔的不定芽誘導(dǎo)需要較強的光照強度，以2 000 lx為最佳。

2.8 植物激素配比對不定芽再生的影響

黃花馬鈴苣苔在6種培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d均有愈傷組織長出，35 d有少量芽分化，隨后芽分化增多和長大。6個組合不定芽再生率均在91%以上，其值差較??；而平均不定芽數(shù)的差值較大，介于14.15～32.33之間(見表8)。其中組合6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的誘導(dǎo)效果最優(yōu)，不定芽再生率達到100%，平均不定芽數(shù)分別為32.33個，芽苗生長勢好，芽體大而整齊，有2～4張小葉且健壯(見圖3)。其次為6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L組合，不定芽再生率98.33%，平均不定芽數(shù)25個，分化整齊，芽大，長勢好，葉綠色。其它各組合均有不同程度的愈傷組織，分化出的芽都較為細(xì)小，其中組合6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L有少量芽微黃。方差分析結(jié)果表明，組合6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L不定芽再生率與其它組合間的差異達到極顯著或顯著性水平，而平均不定芽數(shù)與其它組合間的差異則達到極顯著性水平，因此，黃花馬鈴苣苔不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的最佳植物激素配比為6-BA 0.5 mg/L，NAA 0.1 mg/L。

表7 光照強度對黃花馬鈴苣苔不定芽再生的影響

光照強度(lx)不定芽再生率(%)平均不定芽數(shù)(個/葉)生長狀況100088．89Bb13．41Cc芽細(xì)小，多為0．2cm，6張接種葉片褐化死亡150098．60Aa23．20Bb少量愈傷，芽較小，芽長0．2～0．4cm2000100Aa28．52Aa極少愈傷，芽大，長0．3～0．6cm

圖3 培養(yǎng)50 d分化的不定芽

表8 植物激素配比對黃花馬鈴苣苔不定芽再生的影響

激素(mg/L)6?BANAA不定芽再生率(%)平均不定芽數(shù)(個/葉)生長狀況0．10．198．33Ab25．00Bb分化整齊，芽大，多為0．5cm，0．10．595．83BCcd15．04Cc芽細(xì)小，長0．2～0．4cm，少量芽微黃0．50．1100Aa32．33Aa芽大整齊，多為0．8cm，長勢好0．50．597．10ABbc14．15Cc1/2愈傷，芽細(xì)小，多為芽點1．00．194．44Cd14．73Cc1/3愈傷，芽細(xì)小，長0．2～0．3cm1．00．591．67De14．20Cc1/3愈傷，芽小，長0．1～0．3cm

3 結(jié)論與討論

初代培養(yǎng)是建立組培快繁最為重要和關(guān)鍵的步驟之一，葉片外植體不定芽再生是一個復(fù)雜的過程，受到基因型、激素以及其它營養(yǎng)、環(huán)境條件等內(nèi)外因素影響。

葉片的植入方式對芽的再生有影響。基因型不同物種的葉片再生培養(yǎng)所需的放置方式不一樣[15]。王艷等研究蘋果砧木葉片再生時發(fā)現(xiàn)，葉片正放的再生效果遠(yuǎn)好于葉片的反置[16]，肖蓉等[17]對辣椒棗的研究也得出相同的結(jié)論。王樹曜等[18]對84 K楊樹葉片的再生研究所得結(jié)論則相反。在苦苣苔科植物葉片的再生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，多采用葉背接觸培養(yǎng)基的放置方式。本研究結(jié)果表明，葉片以葉背朝下放置的不定芽再生率和平均不定芽數(shù)均極顯著高于葉面朝下放置。這可能與葉片的構(gòu)成有關(guān)，不定芽一般是從葉片的近軸面向上生長，而葉片遠(yuǎn)軸面的氣孔多，組織較疏松，與培養(yǎng)基易充分接觸吸收養(yǎng)分[19]。

苦苣苔科植物組培培養(yǎng)基pH值多為5.8～6.0，蔗糖濃度為20～30 mg/L，而桂林小花苣苔的誘導(dǎo)培養(yǎng)pH值達到了8.0[9]。本研究結(jié)果表明，滅菌前pH值6.5，蔗糖30 mg/L更適合于黃花馬鈴苣苔的不定芽再生，極顯著優(yōu)于其它處理。

MS培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中最為廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，現(xiàn)有苦苣苔科植物的組培快繁研究結(jié)果顯示，MS培養(yǎng)基適合于葉片的誘導(dǎo)培養(yǎng)。在全量的MS培養(yǎng)基中，黃花馬鈴苣苔的不定芽再生率和平均不定芽數(shù)均優(yōu)于無機鹽減量的培養(yǎng)基，說明黃花馬鈴苣苔的葉片再生需要的礦質(zhì)元素含量較高。

適宜的培養(yǎng)溫度和光照強度是培養(yǎng)中的細(xì)胞所必需的，不同植物試管芽苗對光照強度有不同的反應(yīng)[20]。已有研究表明，苦苣苔科植物組培最適溫度多為是25～28 ℃，對光的需求則差異較大，介于1 500～3 000 lx之間。黃花馬鈴苣苔不定芽誘導(dǎo)適宜的培養(yǎng)溫度為25～28 ℃；最適光照強度為2 000 lx。因此不同的物種所需的光溫培養(yǎng)條件必須經(jīng)過試驗確定，以達到最好的培養(yǎng)效果。

調(diào)節(jié)植物激素種類和組合是獲得高效再生芽的重要手段?？嘬奶浦参锏慕M培研究表明，細(xì)胞分裂素在不定芽的再生中起著關(guān)鍵的作用，其中6-BA對外植體的生長和再生分化的促進效果最好，生長素則起輔助作用，多使用IBA或NAA，二者濃度均不宜過高，適宜濃度6-BA為0.1～1.0 mg/L，IBA或NAA為0.01～0.1 mg/L[3-4，6-14]。但在異裂苣苔和吊石苣苔的不定芽再生中6-BA的使用濃度達到3.0 mg/L[5,10]。本研究結(jié)果表明，6-BA與NAA組合使用，黃花馬鈴苣苔再生芽的發(fā)生頻率極顯著高于其它幾種植物生長物質(zhì)組合，最適濃度為6-BA 0.5 mg/L與NAA 0.1 mg/L，不定芽再生率達到100%，平均每葉不定芽數(shù)32.33個，芽體均勻，生長正常無畸形；6-BA濃度達到1.0 mg/L時不利于芽的誘導(dǎo)和生長，愈傷組織分化不整齊芽體細(xì)小。在不同的6-BA濃度下，NAA 0.1 mg/L均較NAA 0.5 mg/L表現(xiàn)出較好的誘導(dǎo)效果，其不定芽再生率高，平均不定芽數(shù)多，所誘導(dǎo)的芽體較大，說明較高的NAA濃度會抑制不定芽的形成和生長。因此在黃花馬鈴苣苔葉片誘導(dǎo)不定芽過程中6-BA和NAA濃度應(yīng)分別控制在0.5 mg/L和0.1 mg/L。

綜合試驗結(jié)果得出，葉片外植體以葉面朝上接入培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L，在溫度25～28 ℃，光照強度2 000 lx的培養(yǎng)條件下，黃花馬鈴苣苔不定芽的再生效果最好。

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Research on the Adventitious Buds High-frepuency Regeneration ofOreocharisflavidaMerr

PANMei,FURuikan,QIHuasha,LüDeren,WANGJingfei,HUANGSai

2016-08-28

海南省科學(xué)事業(yè)費項目(kyys-2013-12)。

潘 梅(1962—)，女(壯族)，廣西隆安縣人；高級園藝師，主要從事植物組織培養(yǎng)研究與開發(fā)利用；E-mail：panmei200@sina.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.01.085

Q 943.1

A

1001-4705(2017)01-0085-05