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(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 長(zhǎng)春 130118)

高效糯玉米單倍體加倍方法的研究

鄧?yán)i，李向永，景桂昕，魯彬，邢政，趙仁貴

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 長(zhǎng)春 130118)

以DR 5為父本誘導(dǎo)5份糯玉米雜交種獲得的單倍體籽粒為試驗(yàn)材料，探究處理方法、濃度、處理時(shí)間和溫度對(duì)糯玉米單倍體的加倍效果。結(jié)果表明，浸芽法的加倍效果最好，加倍率均值達(dá)11.02%。秋水仙素濃度為0.8 mg/mL時(shí)，加倍率最高，均值達(dá)10.47%。處理時(shí)間以8 h最好，加倍率均值達(dá)7.58%。處理溫度為21 ℃時(shí)達(dá)到最佳，加倍率均值達(dá)10.96%。

糯玉米； 單倍體； 加倍率；

糯玉米(Waxy Corn)是玉米九大類(lèi)型之一，又稱(chēng)為蠟質(zhì)玉米，起源于中國(guó)的西南地區(qū)，是普通玉米第9號(hào)染色體上的基因發(fā)生隱性突變由WX突變?yōu)閣x而形成的一種特殊玉米類(lèi)型[1]。由于糯玉米100%的支鏈淀粉含量[2]，具有較高的粘滯性和適口性,經(jīng)過(guò)蒸煮后的糯玉米粘軟而富有糯性，使糯玉米深受人們歡迎。不僅僅在食用方面，隨著社會(huì)的進(jìn)步，糯玉米的用途越來(lái)越廣泛。運(yùn)用糯玉米可以釀制風(fēng)味獨(dú)特的優(yōu)質(zhì)黃酒，由于其100%的支鏈淀粉含量，使其成為加工支鏈淀粉的重要原料[3]。

在糯玉米育種研究方面，我國(guó)與國(guó)外相比發(fā)展緩慢[4]，一般采用回交轉(zhuǎn)育法和二環(huán)系法，育成了一大批生產(chǎn)上推廣面積較大的雜交種[5]，但上述方法存在流程繁瑣、育種周期長(zhǎng)、成本高等諸多問(wèn)題，不易滿(mǎn)足現(xiàn)實(shí)的生產(chǎn)需求，因此需要一種新的育種方法來(lái)代替。單倍體育種是利用孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)雜交種產(chǎn)生單倍體，然后對(duì)單倍體進(jìn)行加倍獲得雙單倍體即DH系的育種方法。常規(guī)玉米育種方法需要自交5～7代才能獲得比較穩(wěn)定的自交系，而單倍體育種只需要2代即可獲得穩(wěn)定的自交系，大大縮短了育種年限，對(duì)推進(jìn)品種的更新具有重要作用[6]。就目前來(lái)看，單倍體育種在普通玉米育種方面應(yīng)用比較廣泛，而在糯玉米育種上的研究和應(yīng)用還比較少。

在單倍體育種上，加倍率是限玉米DH育種的關(guān)鍵因素之一[7-8]。單倍體加倍一般采用秋水仙素加倍和自然加倍，自然加倍率比較低[9]，應(yīng)用秋水仙素處理加倍比較普遍。本試驗(yàn)主要探究溫度、秋水仙素濃度、處理方法和處理時(shí)間對(duì)糯玉米單倍體加倍率的影響，從而推進(jìn)單倍體育種技術(shù)在糯玉米育種方面的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)所采用的單倍體誘導(dǎo)系為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)特用玉米育種團(tuán)隊(duì)引進(jìn)的新型誘導(dǎo)系DR 5。2014年冬在海南育種基地分別以基礎(chǔ)材料吉白糯115、吉香糯187、京科糯2000、吉糯288、吉糯420為母本，進(jìn)行雜交誘導(dǎo)，然后在F1中挑選胚為無(wú)色，胚乳為紫色的單倍體作試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

1.2.1對(duì)上述5種基礎(chǔ)材料誘導(dǎo)出來(lái)的單倍體用5種秋水仙素濃度0.6 mg/mL加倍方法和自然加倍法，其中浸種、浸芽和浸根在20 ℃條件下處理8 h，然后種植進(jìn)行鑒定其加倍率，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1.2.2以吉白糯115為基礎(chǔ)材料，在20 ℃條件下用浸芽法處理誘導(dǎo)的單倍體，在不同秋水仙素濃度不同處理時(shí)間下進(jìn)行加倍，然后種植鑒定。

1.2.3以5種糯玉米品種為基礎(chǔ)材料，誘導(dǎo)獲得的單倍體在不同溫度下，在0.6 mg/mL秋水仙素濃度下用浸芽法浸泡8 h，然后種植鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種糯玉米單倍體用不同方法處理的加倍率

試驗(yàn)結(jié)果表明，5種糯玉米單倍體用6種方法進(jìn)行加倍,效果見(jiàn)表1。利用無(wú)重復(fù)雙因素方差分析表明，處理方法間達(dá)到極顯著水平，品種間未達(dá)到顯著水平。說(shuō)明處理方法是影響糯玉米單倍體加倍的重要因素。由表3可看出，5種加倍方法除植株注射法外，加倍率均極顯著高于自然加倍，說(shuō)明前4種藥劑處理具有明顯的加倍效果，平均加倍率達(dá)3.82%～11.02%，植株注射法與自然加倍法差異不顯著，原因是本試驗(yàn)秋水仙素濃度用注射法對(duì)單倍體苗的毒害比較大，注射法平均加倍率為1.50%。而自然加倍率平均只有1.14%。6種加倍方法中，浸芽法加倍效果最好，平均加倍率達(dá)到11.02%，極顯著高于其方法。浸根法也具有較好的加倍效果，達(dá)到6.28%，僅次于浸芽法的加倍效果。浸種法和摘心葉法也顯著高于植株注射法和自然加倍法。因此，浸芽法最適合于糯玉米單倍體加倍，是糯玉米單倍體加倍的首選方法，浸根法次之。

表1 5種糯玉米單倍體用不同方法處理的加倍率(%)

加倍方法吉白糯115吉香糯187京科糯2000吉糯288吉糯420浸種4．25．63．22．07．5浸芽11．68．511．912．410．7浸根5．86．37．16．75．5摘心葉3．32．84．55．33．2植株注射1．22．21．30．52．3自然加倍0．51．30．22．21．5

表2 方差分析

變異來(lái)源平方和自由度均方F值區(qū)組間1．9840．490．27處理間330．83566．1736．16??誤差36．60201．83總變異369．4029

注：“**”為達(dá)到0.01極顯著水平。下同。

表3 5種糯玉米單倍體用不同方法處理的加倍率差異顯著性比較

處理方法平均加倍率(%)5%顯著水平1%極顯著水平浸芽11．02aA浸根6．28bB浸種4．50bcBC摘心葉3．82cCD植株注射1．50dD自然加倍1．14dD

2.2 吉白糯115在不同濃度不同時(shí)間下的加倍效果

在20 ℃條件下，在不同濃度不同浸泡時(shí)間下浸芽的加倍效果見(jiàn)表4，無(wú)重復(fù)雙因素方差分析表明(表5)，濃度間、時(shí)段間均達(dá)到極顯著差異。說(shuō)明秋水仙素的濃度和浸泡的時(shí)間是影響糯玉米單倍體加倍的重要因素。

由表4可知，在相同處理時(shí)間下，隨著濃度的增高，加倍率越來(lái)越高，達(dá)到一定濃度后，會(huì)出現(xiàn)抑制作用，濃度再增加加倍率反而下降。這可能是由于秋水仙素具有一定的毒性，濃度太大對(duì)單倍體的毒害也比較大，從而導(dǎo)致了加倍率的下降。由表6可知，當(dāng)濃度為0.8 mg/mL時(shí)，加倍率范圍為9.5%～12.4%，平均加倍率最高達(dá)10.47%，極顯著高于其它濃度。濃度為0.6，1.2 mg/mL時(shí)，平均加倍率差異不顯著，分別為6.93%、6.60%。濃度為0.2，1.4 mg/mL時(shí)，平均加倍率最低，分別為4.10%和2.07%。不同浸泡時(shí)間的加倍效果的差異顯著分析表明(表7)，8 h的處理與4 h和12 h處理的時(shí)段間差異達(dá)極顯著水平。說(shuō)明8 h處理的加倍效果最好，加倍率范圍為2.4%～12.4%，平均加倍率為7.58%。12 h和4 h效果不佳，差異不顯著，分別為5.48%、5.04%。

表4 吉白糯115在不同濃度不同時(shí)間下的加倍率(%)

濃度(mg/mL)4h8h12h0．23．55．66．20．66．38．310．60．89．512．410．51．24．47．36．51．44．52．42．3

表5 方差分析

變異來(lái)源平方和自由度均方F值濃度120．77430．1932．40??時(shí)間18．4329．219．89??誤差7．4580．93總變異146．6514

表6 吉白糯115在不同濃度下的加倍效果差異顯著性比較

濃度(mg/mL)平均加倍率(%)5%顯著水平1%極顯著水平0．810．47aA0．66．93bB1．26．60bBC0．24．10cCD1．42．07dD

表7 吉白糯115在不同處理時(shí)間下的加倍效果差異顯著性比較

時(shí)間(h)平均加倍率(%)5%顯著水平1%極顯著水平87．58aA125．48bB45．04bB

2.3 5種糯玉米單倍體在不同溫度處理下的加倍率

由表9可知，品種間未達(dá)到顯著差異，溫度間達(dá)到極顯著差異。說(shuō)明溫度是影響糯玉米單倍體加倍的重要因素。

由表8可知，在品種相同的情況下，隨著溫度的升高，糯玉米單倍體加倍率先增加，達(dá)到一定溫度后，加倍率逐漸下降。溫度為21 ℃時(shí)加倍效果最好，加倍率范圍為8.4%～13.9%，平均加倍率為10.94%，顯著高于其它溫度。由表8和表10可知，當(dāng)溫度為18 ℃和24 ℃時(shí)，加倍率范圍分別為6.4%～10.4%和5.7%～8.2%，平均加倍率分別為8.54%和7.08%，僅次于21 ℃時(shí)的平均加倍率。當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，加倍率明顯下降，30 ℃時(shí)加倍率最低，范圍為 1.2%～3.3%，顯著低于27 ℃條件下的加倍率，原因可能是溫度過(guò)高的情況下糯玉米單倍體芽吸收的秋水仙素比較多，造成了較大的藥害。而溫度過(guò)低時(shí)，芽吸收的秋水仙素比較少，導(dǎo)致了加倍率較低。15 ℃時(shí)，加倍率范圍為3.5%～6.3%，平均加倍率為4.88%，極顯著低于18 ℃條件下的平均加倍率。

表8 不同處理溫度下糯玉米單倍體加倍率(%)

溫度(℃)吉白糯115吉香糯187京科糯2000吉糯288吉糯420156．34．55．53．54．61810．38．37．36．410．42110．313．98．412．49．8248．26．45．77．87．3275．66．74．35．63．5303．32．42．23．21．2

表9 方差分析

變異來(lái)源平方和自由度均方F值品種間11．9142．981．58溫度間225．92545．1823．93??誤差37．76201．89總變異275．5929

表10 不同處理溫度的加倍率差異顯著性比較

溫度(℃)平均加倍率(%)5%顯著水平1%極顯著水平2110．96aA188．54bAB247．08bBC275．14cC154．88cCD302．46dD

3 結(jié)論與討論

單倍體育種技術(shù)在現(xiàn)代作物遺傳育種中占據(jù)重要地位，隨著單倍體育種技術(shù)的發(fā)展，育種家培育出越來(lái)越多的玉米優(yōu)良DH系，為推進(jìn)玉米新品種的選育，做出了重要貢獻(xiàn)。單倍體育種技術(shù)在國(guó)外的研究比較廣泛，技術(shù)也相對(duì)比較成熟，很多國(guó)外的育種公司都選用單倍體技術(shù)培育自交系。目前，我國(guó)也越來(lái)越重視單倍體育種技術(shù)，但是發(fā)展還是比較緩慢，技術(shù)不夠成熟。在糯玉米育種上的研究和應(yīng)用則是更少。

在糯玉米單倍體育種技術(shù)中，加倍率仍然是限制其發(fā)展的重要瓶頸。找到高效的糯玉米單倍體加倍技術(shù)，是推進(jìn)該項(xiàng)技術(shù)研究和應(yīng)用中的重要環(huán)節(jié)。從普通玉米單倍體加倍方法來(lái)看，秋水仙素濃度、溫度、浸泡時(shí)間、處理方法是影響加倍率的重要因素。本研究選取5種糯玉米雜交種誘導(dǎo)得到的單倍體為試驗(yàn)材料，比較了6種糯玉米單倍體加倍方法，研究結(jié)果方差分析表明，單倍體處理方法間存在極顯著差異，說(shuō)明加倍處理方法是影響糯玉米單倍體加倍的重要因素。而品種間的差異不顯著，但在普通玉米單倍體加倍上，當(dāng)品種的血緣關(guān)系比較遠(yuǎn)時(shí)，品種間差異顯著[10]。估計(jì)可能與本研究選取的基礎(chǔ)材料的血緣關(guān)系比較近有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究，才能更能清楚這一機(jī)理。5種秋水仙素加倍方法除植株注射法外，其它加倍率均極顯著高于自然加倍，說(shuō)明合適的藥劑處理方法具有明顯的加倍效果，前4種加倍方法平均加倍率達(dá)3.82%～11.02%，而自然加倍率只有1.14%。6種加倍方法中，浸芽法加倍效果最好(達(dá)11.02%)，顯著高于其它5種方法，說(shuō)明浸芽法是適合糯玉米單倍體加倍的較好方法。

在普通玉米單倍體加倍上，浸芽處理時(shí)間經(jīng)常是8 h，濃度為0.6 mg/mL左右。本研究選取吉白糯115誘導(dǎo)獲得的單倍體為基礎(chǔ)材料，用浸芽法在不同濃度不同時(shí)間下進(jìn)行處理，方差分析表明，濃度間和處理時(shí)段間均存在極顯著差異，說(shuō)明濃度和時(shí)間是重要的影響因素。當(dāng)濃度為0.8 mg/mL時(shí)，平均加倍率最大達(dá)到10.47%，極顯著高于其它濃度。8 h處理的加倍效果最好，平均加倍率為7.58%。說(shuō)明在糯玉米單倍體加倍上，適合選用8 h處理時(shí)間，適合選用的濃度為0.8 mg/mL。

在品種相同的情況下，隨著溫度的升高，糯玉米單倍體加倍率先增加，達(dá)到一定溫度后，加倍率逐漸下降。溫度為21 ℃時(shí)加倍效果最好，加倍率范圍為8.4%～13.9%，平均加倍率為10.96%。極顯著高于其它溫度的。說(shuō)明糯玉米單倍體加倍適合溫度為21 ℃左右。

由于秋水仙素是劇毒藥品，目前在普通玉米上研究了除草劑甲基胺草磷，炔苯酰草胺和氟樂(lè)靈來(lái)代替秋水仙素，但效果不甚理想[11]，這些藥品在糯玉米單倍體加倍上效果怎樣，還需要進(jìn)一步的研究。

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Preliminary Study on Efficient Waxy Maize Haploid Doubling Metho

DENGKunpeng,LIXiangyong,JINGGuixin,LUBin,XINGZheng,ZHAORengui

2016-09-15

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2015 GA 660007)；吉林省財(cái)政廳科研育種項(xiàng)目(吉財(cái)2012002)。

鄧?yán)i(1991—)，男，吉林公主嶺人；在讀碩士研究生，主要從事特用玉米育種工作；E-mail:8090655550@qq.com。

趙仁貴，E-mail:zhaorengui@sina.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.01.082

S 513

A

1001-4705(2017)01-0082-04