， ， ， ，， ， ， (.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所， 南寧 530007； 2.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點實驗室， 南寧 530007)

苦瓜種子蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)條件的優(yōu)化

黃玉輝1,2，黃如葵1,2，梁家作1，黃熊娟1，馮誠誠1,2，陳小鳳1，劉杏連1，秦健1
(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所， 南寧 530007； 2.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點實驗室， 南寧 530007)

通過對苦瓜種子蛋白質(zhì)樣品的提取方法、等電聚焦參數(shù)、SDS-PAGE分離膠濃度以及膠條pH范圍的優(yōu)化篩選，建立了適合苦瓜種子蛋白組分析的雙向電泳體系。結(jié)果表明：使用TCA-丙酮提取方法提取苦瓜種子蛋白，更適用于雙向電泳分析，結(jié)合使用pH=5～8 IPG膠條以及優(yōu)化的聚焦程序，能獲得分辨率較高、蛋白點清晰、重復(fù)性好的2-DE圖譜。經(jīng)銀染顯色，可檢測約660個蛋白點，主要分布在pH=5～8；該體系適合用于分析苦瓜種子的蛋白質(zhì)組。

苦瓜種子； 蛋白質(zhì)組； 雙向電泳； 系統(tǒng)優(yōu)化

苦瓜(MomordicacharantiaL. ) 系葫蘆科苦瓜屬的一年生草本植物, 含有藥用有效成分及豐富營養(yǎng)物質(zhì), 具有降血糖、抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等功效[1-4],目前對于苦瓜的藥用成分及其功效的研究已成為當(dāng)前不同領(lǐng)域?qū)W者都感興趣的一個熱點。雙向電泳(2-dimensional electrophoresis,2-DE)技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一種蛋白質(zhì)分離方法， 近年來, 雙向電泳技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域。本研究采用TCA-丙酮法、丙酮法和酚抽提法對苦瓜種子總蛋白質(zhì)的提取方法進(jìn)行比較篩選和對雙向電泳體系進(jìn)行優(yōu)化, 為苦瓜種子蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料MC 26為泰國苦瓜品種。

提取液Ⅰ：0.5 mol/L Tris-HCl(pH=7.5),50 mmol/L EDTA (pH=8.0),0.7 mol/L蔗糖,0.1 mol/L KCl；提取液Ⅱ：65 mmol/L Tris-HCl(pH=6.8),10%甘油,0.5%SDS；提取液Ⅲ：0.5 mol/L Tris-HCl (pH=7.5),1 mol/L PMSF,1 mmol/L DTT,0.01 mol/L KCl；裂解液： 2 mol/L硫脲,7 mol/L尿素,60 mmol/L DTT，2%(v/v)IPG緩沖液,2%(m/v)Chaps；水化液：8 mol/L尿素,40 mmol/L DTT,2%(m/v)Chaps, 1%(v/v)IPG緩沖液,1%溴酚藍(lán)；平衡液：6 mol/L 尿素,35 mmol/L Tris-HCl(pH=8.8),2%(m/v)SDS,20%(v/v)甘油, 1%溴酚藍(lán)。

1.2 方 法

1.2.1 總蛋白的提取方法

1) 酚抽提法。蛋白提取主要參考Saravanan等[5]的方法。稱取1 g苦瓜種子(去殼)用液氮研磨成粉,然后加入10 mL提取液Ⅰ,渦旋混勻后于4 ℃放置20 min,然后再加入10 mL Tris飽和酚,混勻后于4 ℃放置20 min,4 ℃下12 000 r/min離心10 min,取上清液,加等體積提取液Ⅰ重復(fù)抽提2次。轉(zhuǎn)移上清液,加5倍體積0.1 mol/L醋酸氨甲醇溶液,-20 ℃下放置過夜,于4 ℃下12 000 r/min離心10 min,沉淀用5 mL 0.1 mol/L醋酸氨甲醇溶液洗3次,晾干,即為提取的粗蛋白。

2) 丙酮法。稱取1 g苦瓜種子(去殼)用液氮研磨成粉，加5倍體積的冷丙酮(含0.07%ME),振蕩渦旋,4 ℃下12 000 r/min離心10 min,重復(fù)2次。待丙酮揮發(fā)完全,加入3倍體積的蛋白提取液Ⅱ,充分混勻,于4 ℃放置1 h(每隔10 min振蕩1次)。4 ℃下12 000 r/min離心10 min,去沉淀。上清液加5倍體積的冷丙酮(含0.07%ME),-20 ℃沉降蛋白1 h,12 000 r/min離心10 min,沉淀用80%冷丙酮洗2～3次，于-80 ℃冷凍干燥。

3) TCA-丙酮法。主要參考Damerval等[6]的方法。稱取1 g苦瓜種子(去殼)用液氮研磨成粉,然后加入15 mL蛋白提取液Ⅲ，充分混勻后4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液。加入25 mL 10%三氯乙酸和PMSF溶液，渦旋混勻后4 ℃下12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入25 mL冷丙酮，置-20 ℃過夜。第2天取出4 ℃下12 000 r/min離心10 min，沉淀用80%冷丙酮洗2～3次，于-80 ℃冷凍干燥。

1.2.2 第一向等電聚焦( IEF)電泳

采用PROTEAN IEF Cell(BIO-RAD)等電聚焦系進(jìn)行等電聚焦, IPG干膠條分別為長17 cm、pH=3～10和長17 cm、pH=5～8兩種。分別設(shè)計3個等電聚焦(IEF)電泳參數(shù),篩選合適的IEF條件。Ⅰ：50 V，10 h； 500 V，1 h；1 000 V，1 h；8 000 V，1 h；8 000 V，20 000 Vh；Ⅱ: 50 V，12 h；250 V，1 h；500 V,1 h,1 000 V,1 h；3 000 V,1 h；80 00 V ，80 000 Vh；Ⅲ:50 V，12 h；250 V,1 h；500 V，1 h；1 000 V，1 h；3 000 V，1 h；10 000 V， 60 000 Vh。

1.2.3 第二向聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳

聚丙烯酰胺凝膠制備采用垂直電泳系統(tǒng)制備，參照郭堯君[7]的方法,聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠濃度為12%(40%單體36 mL，Tris緩沖液30 mL pH=8.8，10%SDS 1.2 mL，ddH2O 52.8 mL，APS 0.6 mL，TEMED 0.06 mL),電泳參數(shù)為80 V 30 min左右，之后為200 V 5 h，直至溴酚藍(lán)前沿到膠下底部停止電泳。取出玻璃板并小心撬開，凝膠切角作記號，采用銀染染色法對凝膠進(jìn)行染色[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單向SDS-PAGE分析

計算樣品蛋白液用量后，采用12%的分離膠濃度取蛋白上清液進(jìn)行SDS-PAGE，在相同上樣蛋白量條件下，TCA-丙酮法、酚抽提法和丙酮沉淀法分別得到23、19、13 條蛋白條帶，TCA-丙酮法得到的蛋白電泳條帶數(shù)量最多、濃度大且清晰,分離效果很好,說明該方法提取的蛋白質(zhì)量好；而酚抽提法和丙酮沉淀法相對于TCA-丙酮法提取的蛋白存在部分條帶缺失，蛋白濃度也較低，比較3種提取方法從單向SDS-PAGE(圖1)可看出,TCA-丙酮法比其它2種方法更適用于苦瓜種子全蛋白的提取。

注：A為TCA-丙酮法;B為酚抽提法;C為丙酮沉淀法。下同。圖1 苦瓜種子總蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.2 不同提取方法雙向電泳的比較

比較采用TCA-丙酮法、酚抽提法和丙酮沉淀法3種方法提取的苦瓜種子全蛋白進(jìn)行雙向電泳的圖譜發(fā)現(xiàn)，采用pH=3～10寬范圍的膠條進(jìn)行電泳時，蛋白點都比較集中，其中TCA-丙酮法2-DE圖譜中蛋白點較多(圖2-A),而酚抽提法和丙酮沉淀法蛋白質(zhì)相對TCA-丙酮法蛋白點明顯減少,缺失蛋白點較多( 圖2-B、C)。由此得出TCA-丙酮法適用于苦瓜種子總蛋白提取，是進(jìn)行雙向電泳分析的最優(yōu)方法。

圖2 不同蛋白提取方法的苦瓜種子總蛋白的2-DE圖譜

注：A為聚焦程序Ⅰ圖譜;B為聚焦程序Ⅱ圖譜;C為聚焦程序Ⅲ圖譜圖3 不同聚焦程序下的苦瓜種子總蛋白的2-DE圖譜

2.3 IPG膠條pH選擇

選用線性寬范圍的pH=3～10膠條進(jìn)行雙向電泳時(見圖2-A)，發(fā)現(xiàn)大部分蛋白質(zhì)點集中在等電點為pH=5～8范圍內(nèi)，兩端蛋白點較少，造成中間蛋白點重疊分不開，導(dǎo)致集中的蛋白點分辨率較低，影響電泳圖譜分析。而選擇同樣長度的線性窄范圍pH=5～8 IPG膠條,能更好的把蛋白點間的距離拉大，分離蛋白點，得到背景清晰、分離效果好的蛋白質(zhì)圖譜(見圖3-C)。

2.4 最佳等電聚焦條件的優(yōu)化

本試驗在參考BIO-RAD公司提供的《雙向電泳原理與方法》等電聚焦程序的基礎(chǔ)上,對等電聚焦電泳的運行參數(shù)進(jìn)行了不同調(diào)整設(shè)置， 優(yōu)化篩選最佳的苦瓜種子蛋白質(zhì)雙向電泳的等電聚焦運行參數(shù)，結(jié)果見圖3。采用程序Ⅰ和程序Ⅱ得到的電泳圖譜結(jié)果不理想，背景橫向條紋較重，部分點存在拖尾的現(xiàn)象，蛋白點模糊不清，分辨率相對較差。采用程序Ⅲ進(jìn)行2-DE效果最佳，在凝膠上顯現(xiàn)的蛋白質(zhì)點分離效果好、蛋白點清晰、分辨率高，背景干凈；這表明程序Ⅲ是最適于苦瓜種子蛋白質(zhì)雙向電泳分離的等電聚焦條件。

2.5 不同發(fā)育階段苦瓜種子蛋白質(zhì)2-DE圖譜的比較

經(jīng)蛋白質(zhì)提取方法的篩選和雙向電泳體系的優(yōu)化后，本試驗對不同發(fā)育階段的苦瓜種子蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳分析。結(jié)果(見圖4)表明,在苦瓜種子發(fā)育前、中、后期,蛋白質(zhì)的種類和表達(dá)量存在明顯差異?？梢?采用TCA-丙酮法提取蛋白, pH=5～8的IPG膠條及合適的IEF電泳參數(shù)進(jìn)行雙向電泳可有效分離苦瓜種子的蛋白,圖譜清晰，分辨率好，重復(fù)性佳，可用于苦瓜種子差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

注：A為16 d;B為22 d;C為28 d。圖4 不同發(fā)育階段苦瓜種子蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜比較

3 討 論

在雙向電泳中，為了獲得最佳的電泳效果，必須不斷優(yōu)化樣品制備和第一向等電聚焦的條件，以確保蛋白樣品得以充分分離，而不同蛋白樣品的最佳IEF條件可能相差甚遠(yuǎn)，因此不同樣品必須單獨摸索。蛋白質(zhì)樣品的制備是雙向電泳結(jié)果的好壞決定因素之一。蛋白的提取方法種類很多，材料不同，方法差別很大?？喙戏N子中主要由蛋白質(zhì)，脂肪、激素等化學(xué)物質(zhì)組成[9],為達(dá)到樣品蛋白的最大抽提量，選擇合適的裂解緩沖液，通過不同試劑的合理組合，在蛋白提取過程中去除脂肪、核酸、多糖等大分子以及鹽類小分子等干擾物質(zhì)成為關(guān)鍵所在。雙向電泳的第一向等電聚焦中聚焦時間和總伏時數(shù)影響到2-DE圖譜的質(zhì)量，聚焦時間過短使得聚焦不完全，聚焦時間過長，引起膠內(nèi)滲水，并且改變了凝膠的內(nèi)部電場微環(huán)境，使得蛋白質(zhì)樣品再次發(fā)生移動，導(dǎo)致橫紋。因此，等點聚焦運行的參數(shù)至關(guān)重要，直接影響到雙向電泳圖譜的重復(fù)性和分辨率。

本研究通過對苦瓜種子蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳體系的優(yōu)化, 建立了適合苦瓜種子蛋白組分析的雙向電泳體系。試驗結(jié)果表明：采用TCA-丙酮法提取蛋白,選用pH=5～8的IPG膠條為載體及合適的IEF電泳參數(shù)進(jìn)行雙向電泳，蛋白點分辨率好，數(shù)量較多，重復(fù)性佳，能充分反映蛋白質(zhì)組信息，為適合苦瓜種子蛋白分離的雙向電泳體系，為后續(xù)研究創(chuàng)造條件。

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Optimiztion of Two-dimensional Gel Electrophoresis for Proteome of Momordica charantia Seed

HUANGYuhui1,2,HUANGRukui1,2,LIANGJiazuo1,HUANGXiongjuan1,FENGChengcheng1,2,CHENXiaofeng1,LIUXinglian1,QINJian1
(1.Vegetable Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007,China;2.Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab,Nanning 530007,China)

Through optimization and screening of two-dimensional electrophoresis sample preparation methods of seeds protein of Momordica charantia,the procedure of isoelectric focus，concentration of the second-dimensional SDS separation gel and the pH range of solidifying strips,electrophoresis system that was suitable to seed protein of Momordica charantia was structured.The results showed that highly pure seed protein can be obtained with trichloroacetic acid(TCA)-acetone method,2-DE images of protein of high resolution ratio and good repetitiveness can be got with optimized isoelectric focus procedure.About 660 clear protein spots were detected by two dimensional electrophoresis (2-DE) and silver staining with isoelectric points at pH 5-8.

momordica charantia seed; proteome; two-dimensional electrophoresis(2-DE);system optimization

2017-03-11

廣西自然科學(xué)基金(2013 GXNSFDA 019010)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-25)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(2015 YT 66)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(2015 YZ 01)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(桂農(nóng)科2016 YM 24)。

黃玉輝(1978—)，女，廣西宜州人；碩士，助理研究員，主要從事苦瓜分子輔助育種研究工作。

黃如葵，E-mail：:rkhuang@gxaas.net。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.10.042

S 642.5

A

1001-4705(2017)10-0042-04