魯 松,熊鐵一

(1.四川省自然資源科學(xué)研究院,四川 成都 610015;2.峨眉山生物資源實(shí)驗(yàn)站,四川 峨眉山 614201)

正交設(shè)計(jì)在峨眉金線蓮組織培養(yǎng)中的應(yīng)用

魯 松1,2,熊鐵一1,2

(1.四川省自然資源科學(xué)研究院,四川 成都 610015;2.峨眉山生物資源實(shí)驗(yàn)站,四川 峨眉山 614201)

以野生峨眉金線蓮的莖段腋芽為外植體,采用正交設(shè)計(jì)L16(45)對(duì)野生峨眉金線蓮叢生芽誘導(dǎo)、生根的4個(gè)因素(基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA、AC(活性炭))在4個(gè)水平上進(jìn)行組織培養(yǎng)優(yōu)化試驗(yàn),以期建立完整、高效、廉價(jià)的培養(yǎng)體系。結(jié)果表明:基本培養(yǎng)基、不同激素濃度配比等因素對(duì)峨眉金線蓮的分化、生根有著顯著影響。外植體最佳消毒方案是75%酒精浸泡10s,0.1%的HgCl2浸泡消毒10min;峨眉金線蓮最佳叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+10%香蕉+6-BA3mg/L+NAA 0.5mg/L+AC 3g/L;最佳生根壯苗培養(yǎng)基為：1/2MS+10%土豆+NAA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L+AC 3g/L。該體系對(duì)峨眉金線蓮種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用具有一定的參考意義。

峨眉金線蓮;正交設(shè)計(jì);組織培養(yǎng);莖段腋芽;無(wú)性繁殖

峨眉金線蓮(Anoectochilus.roxburghiiK.Y.Lang.)隸屬于蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬(Anoectochilus)[1],是以峨眉山命名的峨眉地區(qū)特有種,與開唇蘭屬的其他種金線蓮一道統(tǒng)稱金線蓮,別名金線蘭、金絲草。金線蓮在民間有“藥中之王”的美譽(yù),治療范圍廣泛,多用于治療小兒急驚風(fēng)、高燒不退、腎炎、膀胱炎、高血壓、糖尿病、心臟病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝脾病、肺癆肺病、咳嗽血虛、血熱吐血、小兒發(fā)育不良、毒蛇咬傷等。金線蓮除了具有較高的藥用價(jià)值外,由于其金色或白色網(wǎng)狀脈,還是觀賞價(jià)值極高的室內(nèi)觀葉珍品[2]。由于該植物自然生態(tài)條件獨(dú)特、繁殖率低、生長(zhǎng)緩慢,加上蟲類與鳥類嗜食,特別是由于價(jià)格昂貴,當(dāng)?shù)厝藗冞^度采挖,使金線蓮野生資源日漸枯竭[3]。

許多研究表明,人工組織培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“組培”)繁育的金線蓮組培苗與野生金線蓮?fù)瑯泳哂泻芨叩乃幱脙r(jià)值。顧慧芬等比較了金線蓮組培苗與野生金線蓮藥材中多糖、氨基酸和總黃酮的含量[4],結(jié)果表明金線蓮組培苗與臺(tái)灣野生金線蓮中多糖的含量相近,而廣西種的多糖含量較低,組培苗與野生種的18種氨基酸組成相同含量相近,總氨基酸的含量組培苗遠(yuǎn)高于臺(tái)灣地區(qū)和廣西的野生種,總黃酮含量組培苗與野生植株的含量比較接近。李鳴等比較了野生、人工栽培與組織培養(yǎng)金線蓮的藥理作用[5],發(fā)現(xiàn)三種來(lái)源的金線蓮在安定、鎮(zhèn)痛劑抗炎效果上無(wú)顯著差異,認(rèn)為其藥理作用基本相近。黃高凌等比較了大棚栽培和野生金線蓮的粗蛋白、粗脂肪、總糖、維生素C、氨基酸、無(wú)機(jī)元素等成分的含量[6],結(jié)果表明,大棚栽培金線蓮的含水量、維生素C、粗蛋白、粗脂肪和氨基酸含量較高,而灰分和總糖分含量則比野生植株低,劉潤(rùn)東等的結(jié)果與上述一致[7]。唐健等比較了野生金線蓮與福建和臺(tái)灣組培金線蓮中水分、灰分、無(wú)機(jī)元素的含量[8],發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的金線蓮的水分、灰分含量沒有很大差異,但微量元素含量有較大差異。胡國(guó)海等的實(shí)驗(yàn)表明[9],野生與人工種植比較,其Fe、Mn、Zn、Co、Cu元素均比人工種植的高，而Cr元素含量人工種植比野生高,有害元素在人工種植和野生中的含量都很低或未檢出。綜上所述,通過組織培養(yǎng)方法進(jìn)行金線蓮野生資源的開發(fā)利用具有重要的實(shí)踐意義。

目前金線蓮的開發(fā)種類主要為常被稱作福建金線蓮的花葉開唇蘭(A.roxburghii)、臺(tái)灣開唇蘭(A.formosanus),臺(tái)灣開唇蘭因其葉面具有白色網(wǎng)脈常被稱為“臺(tái)灣銀線蓮”。組織培養(yǎng)常見的有福建金線蓮、臺(tái)灣金線蓮、滇越金線蓮(A.chapaensis)、白馬山地區(qū)金線蓮等[10,11],但對(duì)峨眉金線蓮的組織培養(yǎng)報(bào)道近乎空白。本文擬以正交法研究幾種因素對(duì)峨眉金線蓮組織培養(yǎng)體系構(gòu)建的影響,擬建立人工快速繁殖(簡(jiǎn)稱“快繁”)體系,為保護(hù)、開發(fā)和利用這一資源提供具有實(shí)用價(jià)值的資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野生峨眉金線蓮(AnoectochilusemeiensisK.Y.Lang.)于2014年7—8月采自四川省峨眉山海拔1000m的林區(qū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

消毒試驗(yàn)設(shè)計(jì):選取健康粗壯、剪去葉片的野生峨眉金線蓮莖段,在流水下用細(xì)毛刷刷洗干凈(特別是根部),再用肥皂水振蕩洗滌后流水沖洗2h,采用兩因素三水平完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)置75%酒精處理(時(shí)間10s、20s、30s)、0.1%的HgCl2處理(時(shí)間為8min、10min、15min)各3個(gè)水平,共9個(gè)處理。消毒完成后,剪成1—2cm只留一個(gè)腋芽的莖段,平鋪于滅菌后的MS培養(yǎng)基上,每處理20瓶,每瓶10個(gè)莖段,每處理3個(gè)重復(fù)。統(tǒng)計(jì)兩周內(nèi)的污染率,四周后統(tǒng)計(jì)成活率。

叢生芽的誘導(dǎo):試驗(yàn)選用L16(45)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),選擇基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA、活性炭(AC)四因素,濃度各設(shè)四水平(表1),共有16個(gè)試驗(yàn)組合。每組合接種10瓶,每瓶10個(gè)莖段,60天后統(tǒng)計(jì)叢生芽增殖數(shù),計(jì)算增殖率。

生根壯苗:將健壯的叢生芽接種于生根壯苗培養(yǎng)基上,選擇基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA、活性炭(AC)四因素,濃度各設(shè)四水平(表2),共有16個(gè)試驗(yàn)組合,每組合接種10瓶,每瓶10個(gè)叢生芽,120天后取出植株洗凈培養(yǎng)基后統(tǒng)計(jì)根數(shù)、葉片數(shù)、株高、單株重。叢生芽誘導(dǎo)、增殖及生根壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)條件都為光照16h/天,光強(qiáng)15—30μmol.m2/s,溫度23±2℃。

表1 不同消毒處理對(duì)外植體滅菌效果的影響

表2 叢生芽誘導(dǎo)正交試驗(yàn)結(jié)果

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本文采用SPSS22.0數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)和Microsoft Excel對(duì)試驗(yàn)觀察數(shù)據(jù)資料進(jìn)行方差分析、LSD多重比較等。結(jié)果統(tǒng)計(jì)中所涉及的測(cè)定項(xiàng)目計(jì)算公式為:污染率=污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%;成活率=存活的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%;增殖倍數(shù)=叢生芽個(gè)數(shù)/接種的外植體數(shù);生根數(shù)=每處理生根的總數(shù)/誘導(dǎo)出根的試管苗數(shù);葉片數(shù)=葉片總數(shù)/接種的叢生芽數(shù)×100%。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同滅菌處理對(duì)外植體滅菌效果的影響

峨眉金線蓮莖段滅菌試驗(yàn)結(jié)果表明(表1),75%酒精滅菌時(shí)間10s、20s、30s處理下莖段的污染率和成活率皆有顯著差異，而0.1%的HgCl2滅菌時(shí)間(8min、10min、15min)對(duì)污染率和成活率的影響也達(dá)到顯著水平,0.1%的HgCl210min和15min處理下的污染率差異不明顯。綜合分析表明,處理2和處理3的滅菌效果較好,考慮到成活率峨眉金線蓮莖段的滅菌效果以75%酒精滅菌10s、0.1%的HgCl2滅菌10min最好,外植體污染率為22%,成活率達(dá)55.32%。

2.2 不同培養(yǎng)基種類對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響

我們將峨眉金線蓮莖段置入?yún)采空T導(dǎo)、增殖培養(yǎng)基后,約1—2周時(shí)間莖段腋芽處開始分化出乳白色的不定芽,4周后可見明顯的叢生芽。從表2可見,不同組合對(duì)金線蓮莖芽的誘導(dǎo)有不同效果,其中未添加激素的培養(yǎng)基中芽體可繼續(xù)生長(zhǎng),不分化為不定芽,4—5個(gè)月后可長(zhǎng)成高8cm以上的完整植株。此外,由極差分析可知,6-BA和NAA對(duì)叢生芽的增殖影響顯著,其中6-BA影響最大,4種因素作用強(qiáng)弱依次是:6-BAgt;NAAgt;基礎(chǔ)培養(yǎng)基gt;AC。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)得到的峨眉金線蓮叢生芽誘導(dǎo)和增殖的最佳組合為A1B4C2D4,即MS+10%香蕉+6-BA 3mg/L+NAA0.5mg/L+AC 3g/L。我們把滅菌莖段接種于組合A1B4C2D4的培養(yǎng)基后,4周后原球莖的平均增值率達(dá)到2.71,比正交實(shí)驗(yàn)中的任何一個(gè)組合都高,從而證實(shí)了正交篩選的結(jié)果。

2.3 不同培養(yǎng)基種類對(duì)生根壯苗的影響

我們對(duì)經(jīng)繼代進(jìn)行增殖,長(zhǎng)度大于2cm的叢生芽置入生根壯苗培養(yǎng)基,通過分析不同組合的促根結(jié)果可知(表3),不同組合對(duì)生根和苗的生長(zhǎng)影響很大。

表3 生根壯苗正交試驗(yàn)結(jié)果

就本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)而言,由極差分析可知,NAA對(duì)生根及苗的生長(zhǎng)影響顯著,4種因素作用強(qiáng)弱依次是:NAAgt;6-BAgt;基礎(chǔ)培養(yǎng)基gt;AC。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)得到的峨眉金線蓮生根壯苗的最佳組合為A4B4C2D4,即1/2MS+10%土豆+NAA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L+AC 3g/L。我們將2—3cm高的叢生芽100株,每株10瓶置入A4B4C2D4組合配制的培養(yǎng)基中,經(jīng)過150天的培養(yǎng)統(tǒng)計(jì),平均生根率3.46、平均葉數(shù)5.83、平均株重2.89g、平均株高9.10cm,整體長(zhǎng)勢(shì)比正交設(shè)計(jì)中的組合高,證實(shí)了正交篩選的結(jié)果。

3 討論

以帶腋芽的金線蓮莖段作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)消毒常用70%—75%的酒精與0.1%—0.2%的HgCl2的組合。由于金線蓮含水量較高,高濃度酒精易造成莖段脫水而影響芽體的成活與生長(zhǎng),本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證明了這點(diǎn)。在75%酒精處理20s和30s的組合中,成活率顯著低于短時(shí)間的處理。研究證明,在0.1—0.2%的HgCl26—15min處理范圍內(nèi)莖段芽體的滅菌效果與成活率最好。羅曉青、宋麗莎在貴州金線蓮的實(shí)驗(yàn)中證明,以0.1%的HgCl210min的消毒處理為宜[12,13];劉丹的實(shí)驗(yàn)證明,在福建金線蓮中以0.1%的HgCl2處理10min[14],污染率可低至12.22%,成活率卻能達(dá)到82.22%;李艷冬等研究顯示,在福建金線蓮中用0.1%的HgCl2處理8—10min的效果最佳[15];闞世超等以0.15%的HgCl2處理云南金線蓮4min就可達(dá)到較好的效果[16]。本實(shí)驗(yàn)中用0.1%的HgCl2處理10min可達(dá)到有效效果,污染率低至22%,而成活率可達(dá)55.32%。有部分研究表明,添加表面活性劑吐溫-20可降低處理時(shí)間,如戴小英等加入吐溫-20后發(fā)現(xiàn)滅菌處理5—6min就可有效對(duì)外植體進(jìn)行消毒[17]。由于金線蓮在野外常匍匐生長(zhǎng),因此近腐殖質(zhì)的部分滅菌難度較大。實(shí)驗(yàn)表明,金線蓮頂部莖段采用0.1%的HgCl2消毒9min可達(dá)到最佳效果,而基部匍匐莖段則需要13min。除了常用的金線蓮莖段以外,也有實(shí)驗(yàn)曾采用葉片和種子作為外植體,表明葉片不適合作為外植體[18]。以福建金線蓮和廣東金線蓮種子為外植體的實(shí)驗(yàn)表明,雖然蒴果中種子含量高、易萌發(fā),但長(zhǎng)成的植株纖弱,需連續(xù)幾次繼代才可達(dá)到工廠化母苗的要求,周期時(shí)間太長(zhǎng),推廣意義不大[19,20]。

金線蓮增殖一般可分為原球莖和叢生芽?jī)煞N方式,以種子為外植體的常先經(jīng)過原球莖誘導(dǎo),而以莖段為外植體的則常選擇叢生芽誘導(dǎo)的增殖方式[21]。常用的培養(yǎng)基多為MS或1/2MS等。MS為金線蓮叢生芽提供了較豐富的有效成分。但有實(shí)驗(yàn)認(rèn)為,MS中大量元素的濃度過高會(huì)影響叢生芽的生長(zhǎng)與壯苗,而推薦以降低氮源等大量元素濃度的1/2MS或1/4MS為培養(yǎng)基[22],但也有部分文獻(xiàn)認(rèn)為MS培養(yǎng)基的增殖效果更好[21],本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn)。天然添加物的加入往往會(huì)影響叢生芽的生長(zhǎng),本實(shí)驗(yàn)選擇了香蕉汁、馬鈴薯汁與活性炭,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示香蕉汁在對(duì)峨眉金線蓮叢生芽誘導(dǎo)上有多種促進(jìn)作用,效果強(qiáng)于添加馬鈴薯汁,表現(xiàn)在叢生芽較健壯,且能促進(jìn)葉片發(fā)育,這與歐陽(yáng)凡等在鐵皮石斛上的結(jié)果相似[23]?；钚蕴康募尤肟晌狡棵绲拇x廢物以改善生長(zhǎng)環(huán)境,可促進(jìn)叢生芽增殖,本實(shí)驗(yàn)得到了證實(shí)。叢生芽誘導(dǎo)中常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物為6-BA、NAA、ZT、KT、IBA、2,4-D等[12,13],發(fā)現(xiàn)上述激素在各自的實(shí)驗(yàn)中都有明顯影響,但常用的仍是6-BA和NAA的組合。有報(bào)道顯示,在誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí),6-BA的最佳濃度為0.2mg/L,高于該濃度則有一定下降。但本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,峨眉金線蓮的莖段在叢生芽的誘導(dǎo)和增殖時(shí)對(duì)6-BA有一定的耐受力,在6-BA 3.0mg/L時(shí)增殖效果最好,增殖倍率最高,這與周偉香等人的結(jié)果一致[24]。陳永快等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,福建金線蓮在6-BA 4mg/L、臺(tái)灣金線蓮在5mg/L時(shí)增殖效果最佳[25]。由此可見,不同物種、不同產(chǎn)地對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的最佳適應(yīng)劑量差異較大。此外,郭捷華在白馬山金線蓮組培實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),金線蓮中部和基部莖段的增殖效果好于頂芽,中部莖段誘導(dǎo)的芽體質(zhì)量好于基部莖段[11]。

在金線蓮產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中,幼苗根系的粗細(xì)和發(fā)達(dá)程度大大影響后續(xù)土壤栽培的成活率與產(chǎn)量,而在生產(chǎn)中為了降低成本將生根和壯苗環(huán)節(jié)常合并在一起。眾多實(shí)驗(yàn)表明,1/2MS培養(yǎng)基有利于生根[26,27],即降低了無(wú)機(jī)鹽的濃度,而不同的有機(jī)添加物在生根和壯苗實(shí)驗(yàn)用也常利用。因此,本實(shí)驗(yàn)除驗(yàn)證了MS培養(yǎng)基外還驗(yàn)證了低鹽培養(yǎng)基下的生根狀況,并附加不同濃度的NAA和6-BA誘導(dǎo)根的形成,同時(shí)添加了不同的天然添加物。在本實(shí)驗(yàn)中,NAA對(duì)峨眉金線蓮的生根和壯苗影響顯著,而MS與1/2MS培養(yǎng)基之間在本實(shí)驗(yàn)中并未顯現(xiàn)出顯著差異,6-BA含量的變化也未對(duì)峨眉金線蓮的生根有顯著影響,這與陳永快等實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[25]。此外,活性炭在生根和壯苗環(huán)節(jié)具有吸附植物體分泌的酚類等有害物質(zhì),緩慢釋放激素,防止褐化的發(fā)生,為根系提供暗環(huán)境的作用。但在本試驗(yàn)中,活性炭含量變化對(duì)生根壯苗并未顯現(xiàn)出顯著影響。

[1]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志(第17卷)[M].北京:科學(xué)出版社,2000∶223.

[2]范子南,肖華山,范曉紅,等.金線蓮的組織培養(yǎng)研究[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1997,13(2)∶82-87.

[3]于雪梅,郭順星.金線蓮與內(nèi)生真菌共生培養(yǎng)體系的建立[J].中國(guó)中藥雜志,2000,25(2)∶81.

[4]顧慧芬,莊意麗,梅其春.野生與組培金線蓮有效成分的比較及RAPD分析[J].中成藥,2011,33(8)∶1364-1367.

[5]李鳴,鄒丹.3種不同來(lái)源金線蓮的藥理研究[J].海峽藥學(xué),1995,7(4)∶12-14.

[6]黃高凌,蔡慧農(nóng),林順長(zhǎng),等.金線蓮的大棚栽培及其重要成分分析[J].集美大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,17(2)∶96-100.

[7]劉潤(rùn)東,郭文杰,林忠寧,等.金線蓮組織培養(yǎng)及營(yíng)養(yǎng)成分的分析研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,37(5)∶506-509.

[8]唐健,鄧元榮,卓?jī)x榮.金線蓮的藥理活性研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué),2008,20(12)∶77-79.

[9]胡國(guó)海,李洪潮,解成駿.云南文山人工種植金線蓮中的微量元素含量測(cè)定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(14)∶7294-7295.

[10]張鐵,田雪琪,李彬.滇越金線蓮快速繁殖技術(shù)研究[J].文山師范高等專科學(xué)校學(xué)報(bào),2006,19(3)∶110-114.

[11]郭捷華.白馬山金線蓮組培快繁關(guān)鍵技術(shù)研究及其藥用成分比較[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文,2015.

[12]羅曉青,蒙秋伊,查蘭松,等.興仁金線蓮叢生芽誘導(dǎo)增殖研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,(22)∶11231-11232.

[13]宋麗莎,鄧偉,文治瑞,等.荔波野生金線蓮芽的誘導(dǎo)及增殖[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(10)∶43-46.

[14]劉丹.福建戴云山金線蓮工廠化育苗關(guān)鍵性技術(shù)研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院碩士學(xué)位論文,2013.

[15]李艷冬,葉紅霞,陳麗萍,等.金線蓮組培快繁技術(shù)體系的研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,254)∶52-54.

[16]闞世超,張明生,李花.金線蓮叢生芽誘導(dǎo)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(3)∶981-982.

[17]戴小英,朱恒,宋曉琛,等.金線蓮離體快繁及植株再生[J].江西林業(yè)科技,2012,(1)∶25-27.

[18]王雅英,林小華,洪璇.金線蓮?fù)庵搀w篩選及愈傷組織誘導(dǎo)研究[J].亞熱帶植物科學(xué),2011,40(3)∶41-43.

[19]羅安雄,孟志霞,陳曉梅,等.福建金線蓮種子萌發(fā)及幼苗培養(yǎng)研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué),2012,47(15)∶1199-1203.

[20]伍成厚,馮毅敏,賀漫媚,等.金線蓮種子培養(yǎng)的研究[J].中國(guó)野生植物資源,2008,27(1)∶47-50.

[21]楊柏云,高蔭榆,李春華,等.金線蓮原球莖的誘導(dǎo)與快速繁殖[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(10)∶3999-4001.

[22]魏翠華,謝宇,秦建彬,等.金線蓮高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)[J].福建農(nóng)業(yè)科技,2012,(6)∶31-33.

[23]歐陽(yáng)凡,董文賓,付瑜,等.鐵皮石斛莖段快繁技術(shù)的研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2016,6,32(3)∶63-67.

[24]周偉香,龔寧,李光.花葉開唇蘭種子非共生萌發(fā)的研究[J].中草藥,2007,38(4)∶610-613.

[25]陳永快,林一心,鄒暉.福建金線蓮和臺(tái)灣金線蓮的組培快繁技術(shù)[J].現(xiàn)代園藝,2008,(10)∶9-12.

[26]程云清,劉劍鋒,王占武,等.鞍雜楊組培快繁技術(shù)[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,39(2)∶11-12,20.

[27]鄧建軍,李芳東,喬杰,等.白花泡桐優(yōu)樹試管嫁接幼化及組培快繁技術(shù)研究[J].林業(yè)科學(xué)研究,2011,24(5)∶646-650.

ApplicationofOrthogonalDesigninTissueCultureofAnoectochilusemeiensisK.Y.Lang.

LU Song1,2，XIONG Tie-yi1,2
(1.Sichuan Academy of Natural Resource Sciences,Chengdu 610015,China; 2.Emei Mountain Biotic Resource Experimental Station,Emei 614201,China)

The genusAnoectochilus(Orchidaceae) was a perennial herb,which comprised more than 40 species that were widespread throughout tropical regions.Several species of this genus were used in Chinese folk medicines,such as A.roxburghii,A.formosanusand A.koshunensis.AnoectochilusemeiensisK.Y.Lang.was an endangered medicinal plant in Emei Mountain,also called “king medicine”,because of its diverse pharmacological effects such as the treatment of hypertension,fever,liver,and lung disease.With the exploitation and the deterioration of the natural conditions,its wild resources were on the brink of exhaustion.In this experiment,the wild plants ofAnoectochilusemeiensisfrom Emei Mountain in Sichuan,were used as the materials for the optimizing studies of industrial-scale micropropagation.Culture in Vitro and propagation were carried out with stems segments and axillary buds ofAnoectochilusemeiensis.The system was optimized by using orthogonal design with 4 levels of 5 factors (Medium,6-BA、NAA、AC(activated carbon)).The result showed that the best explants disinfection solution was to immerse 10s in 75% alcohol plus 0.1%HgCl210min,MS+10% banana+6-BA 3mg/L+NAA 0.5mg/L+AC 3g/L was the most suitable for bud induction and the optimum for rooting and seedling was 1/2MS+10% potato juice+NAA 2mg/L+6-BA 0.5mg/L+AC 3g/L.This system could provide theoretical help for the protection and utilization ofAnoectochilusemeiensis.

AnoectochilusemeiensisK.Y.Lang.;orthogonal design;tissue culture;stem segment with axillary buds;asexual propagation

10.3969/j.issn.1005-8141.2017.05.017

Q945.52；Q949.71+8.43

A

1005-8141(2017)05-0595-04

2017-03-21；

2017-04-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31470479);四川省基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目資助。

及通訊作者簡(jiǎn)介：魯松(1979-),男,山東省泰安人，副研究員,主要從事珍稀瀕危植物保護(hù)研究。