張 迪， 蘇維恒， 趙 元， 龔 倩， 曲桂娟， 裴志花， 劉樹明， 馬紅霞

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 ， 吉林 長春 130118 ； 2.吉林大學生命科學學院 ， 吉林 長春 130012)

水通道蛋白AQP3缺失對小鼠坐骨神經(jīng)損傷修復的影響

張 迪1， 蘇維恒2， 趙 元1， 龔 倩1， 曲桂娟1， 裴志花1， 劉樹明1， 馬紅霞1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 ， 吉林 長春 130118 ； 2.吉林大學生命科學學院 ， 吉林 長春 130012)

為探明水通道蛋白AQP3缺失對小鼠坐骨神經(jīng)損傷修復能力的影響，本文通過建立小鼠坐骨神經(jīng)損傷修復模型，分別比較了野生型(AQP3+/+)和基因敲除(AQP3-/-)小鼠的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)、神經(jīng)傳導速率及雪旺細胞的遷移能力。結(jié)果顯示，同野生型小鼠相比，AQP3基因敲除小鼠的SFI在損傷后7 d和14 d時呈現(xiàn)顯示性差異，神經(jīng)傳導速率顯著降低。細胞穿孔試驗表明，AQP3基因敲除小鼠同野生型小鼠相比雪旺細胞遷移能力也顯著降低。研究結(jié)果表明，AQP3的缺失可導致小鼠雪旺細胞的遷移能力降低，從而影響了小鼠坐骨神經(jīng)損傷后的修復能力。

水通道蛋白 ； 坐骨神經(jīng)損傷修復 ； 小鼠 ； 雪旺細胞

外周神經(jīng)的損傷修復是一個漫長而又復雜的生物學過程，是創(chuàng)傷外科和整形外科至今未能解決的難題之一。雪旺細胞作為外周神經(jīng)系統(tǒng)的主要膠質(zhì)細胞，是構(gòu)成坐骨神經(jīng)髓鞘的主要細胞，并且雪旺細胞的遷移可促進神經(jīng)纖維的再生，在神經(jīng)損傷修復過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。研究表明，小鼠坐骨神經(jīng)髓鞘及雪旺細胞上存在AQP3基因和蛋白表達[2]。AQP3基因缺失可導致小鼠的角化細胞遷移率降低，體外的傷口愈合抓痕試驗也表明AQP3敲除后傷口愈合變慢，傷口周圍的隆起也減小，這些結(jié)果都提示AQP3與細胞的遷移有關(guān)[3]。因此我們推測，表達在小鼠雪旺細胞中AQP3缺失可能會影響雪旺細胞的遷移，從而影響坐骨神經(jīng)損傷后的修復過程。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 本試驗所用野生型(AQP3+/+)小鼠和AQP3基因敲除(AQP3-/-)小鼠，平均體重20g±3g，均由大連醫(yī)科大學麻彤輝教授饋贈，由本實驗室SPF級動物室飼養(yǎng)。DMEM和IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)； 青霉素和鏈霉素(華北制藥廠產(chǎn)品)、胎牛血清 (GIBCO公司)； 膠原酶及Dispase (Sigma公司)； 其余為實驗室常規(guī)試劑，購自哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 坐骨神經(jīng)損傷修復模型的建立 本試驗采用鉗夾法建立小鼠坐骨神經(jīng)損傷修復模型[4]。具體操作方法為，小鼠于術(shù)前8 h禁食禁水，1.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg體重)腹腔注射麻醉，取俯臥、后腿伸直位固定于手術(shù)臺上，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。于右大腿后部正中切口，分離股二頭肌和半腱肌、半膜肌之間的肌間隙，顯露坐骨神經(jīng)。在梨狀肌下緣15 mm處(定位)，用同一把新的18 cm彎全齒血管鉗的同一部位鉗夾坐骨神經(jīng)，壓滿3扣(定量)，維持5 s后放開血管鉗，間隔10 s后再夾閉5 s，再放松10 s，第3次鉗夾5 s(定時)。神經(jīng)干擠壓傷寬度3 mm，可見神經(jīng)干變菲薄，但未斷裂。損傷部位遠端用4-0無創(chuàng)尼龍線標記。徹底止血，創(chuàng)口處滴入慶大霉素注射液0.4 mL預防感染。關(guān)閉肌間隙，縫合皮膚，術(shù)畢。完全清醒6 h后，隨機抽取試驗動物12只，每組6只。本試驗所有手術(shù)均由試驗者一人在同一助手協(xié)助下完成。

1.2.2 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI，sciatic functional index)測定 根據(jù)Lukas F等人介紹的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)的計算方法，分別取損傷前，損傷后2，4，7，14，21 d和28 d的AQP3+/+和AQP3-/-小鼠各6只，做足跡試驗，評估坐骨神經(jīng)功能恢復情況[5]。小鼠雙側(cè)后足蘸黑色墨水在白紙上行走，每側(cè)足留5個足印。 SFI計算公式如下：

SFI=0為完全正常，SFI=-100為神經(jīng)完全斷離。

EPL：損傷腳足印長度 NPL：正常腳足印長度

ETS：損傷腳足趾長度(1st-5th腳趾) NTS：正常腳足趾長度(1st-5th腳趾)

EIT：損傷腳足趾長度(2nd-4th腳趾) NIT：正常腳足趾長度(2nd-4th腳趾)

SFI=0為完全正常，SFI=100為神經(jīng)完全離斷

1.2.3 坐骨神經(jīng)傳導速率測定 本試驗采用自制坐骨神經(jīng)傳導速率測定裝置。6個電極依次為一對刺激電極，一對接收電極Ⅰ，另一對接收電極Ⅱ。接收電極Ⅰ和接收電極Ⅱ之間的距離恒定為s(2 cm)。通過BL-420S生理記錄儀(成都泰盟公司)刺激電極發(fā)出電刺激信號，沿著坐骨神經(jīng)向下傳導，分別記錄電信號到達接收電極Ⅰ和接收電極Ⅱ的時間為t1和t2。神經(jīng)傳導速率v= s /(t2-t1)[6]。

1.2.4 小鼠雪旺細胞的分離及純化 參照Patel等人介紹的方法分離及純化小鼠雪旺細胞[7-9]。取6-8周齡小鼠斷頸處死，用75%乙醇浸泡5 min消毒，至超凈臺無菌操作。分離其雙側(cè)后腿的坐骨神經(jīng)，在解剖鏡下盡可能除去其表面的包膜。用無菌的剪刀盡可能剪碎坐骨神經(jīng)，將其放入消化液(DMEM +10%FCS+0.125%collagenase+1.25 UmL dispase)中消化24 h。消化后，加入10 mL DMEM培養(yǎng)基中，終止消化。800 r/min離心5 min，棄上清，重懸底層細胞接種在事先用gelatin包被的6孔板上，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后，把完全培養(yǎng)基換成基礎(chǔ)培養(yǎng)基，來抑制成纖維細胞的生長，3～4 d后便可得到較純凈的雪旺細胞。

1.2.5 細胞穿孔遷移試驗 將AQP3+/+和AQP3-/-小鼠的雪旺細胞分成二組，以每孔10 000 個鋪到Boyden Chanber插入式培養(yǎng)板(直徑6.5 mm,底部孔徑8 μm;預先用0.5 mg/mL纖連蛋白包被)上室小槽中，上室細胞用含1%FBS的IMDM培養(yǎng)液，下室用含10%FBS的IMDM培養(yǎng)液。5% CO2條件下培養(yǎng)6 h后，PBS輕洗細胞1次，經(jīng)考馬斯亮藍染色10 min，顯微鏡下照相(遷移+未遷移細胞)。然后用棉簽小心檫去小槽上室細胞，再照相(穿孔遷移至小槽下層的細胞).對于每組細胞，顯微鏡下隨機選取8～10個(40 mm×40 mm)視野，進行細胞計數(shù)，并計算12 h內(nèi)細胞遷移率[10-12]。細胞遷移率=下層細胞數(shù)/(上層細胞數(shù)+下層細胞數(shù))×100%。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 所有試驗數(shù)據(jù)采用SPSS3.0軟件進行統(tǒng)計分析。試驗結(jié)果以x±s表示，兩組數(shù)據(jù)間差異比較采用t檢驗，檢驗顯著性水平定于Plt;0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 試驗結(jié)果

2.1 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)測定 為評價小鼠坐骨神經(jīng)損傷修復能力，我們分別對比了損傷前和損傷后7、14 d和21 d小鼠后肢的足印情況。結(jié)果如圖1A所示，AQP3+/+小鼠坐骨神經(jīng)損傷14 d時，其腳趾功能已基本恢復，5指可正常展開；而AQP3-/-小鼠的5個腳趾不能正常展開。通過計算SFI，可以看出在小鼠坐骨神經(jīng)損傷后7 d和14 d時，AQP3-/-小鼠同AQP3+/+小鼠相比SFI呈現(xiàn)顯著性差異，說明AQP3-/-小鼠的損傷修復能力比AQP3+/+小鼠明顯減弱，見圖1B。

2.2 坐骨神經(jīng)傳導速率測定 為進一步比較坐骨神經(jīng)損傷修復能力，我們分別測量了AQP3+/+小鼠和AQP3-/-小鼠損傷前和損傷后7 d、14 d和21 d的坐骨神經(jīng)傳導速率。AQP3+/+小鼠坐骨神經(jīng)傳導速率分別為24.64±1.29、14.64±1.02、18.05±1.44、22.44±1.25 m/s；AQP3-/-小鼠坐骨神經(jīng)傳導速率分別為23.40±1.52、11.35±1.39、14.13 m±1.85、21.45±2.12 m/s。統(tǒng)計學分析表明，在損傷后7 d和14 d時，AQP3-/-小鼠坐骨神經(jīng)傳導速率同AQP3+/+小鼠相比顯著降低,見圖2。

圖1小鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)測定

A：損傷不同時期小鼠腳??； B：損傷不同時期小鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(n=6，x±s)，**：Plt;0.01

圖2坐骨神經(jīng)傳導速度測定

(n=6，x±s)，*：Plt;0.05；**：Plt;0.01

2.3 AQP3缺失對雪旺細胞遷移的影響 為了驗證AQP3缺失后對雪旺細胞的遷移能力的影響，我們采用細胞穿孔遷移(Transwell)的方法測定了AQP3+/+小鼠和AQP3-/-小鼠雪旺細胞遷移能力。結(jié)果如圖3所示，AQP3-/-小鼠的雪旺細胞遷移率僅為AQP3+/+小鼠的39%左右。表明AQP3敲除后，雪旺細胞的遷移能力明顯降低。

3 討論

雪旺細胞對再生軸突具有趨化作用，在坐骨神經(jīng)損傷、再生及修復過程中起著至關(guān)重要的作用，它不但分裂增殖，為再生軸突提供機械性生長管道，而且提供具有引導力的活性表面，促進軸索細胞的貼壁生長[13]。坐骨神經(jīng)損傷后，雪旺細胞分化增殖、遷移，形成Bunger帶。雪旺細胞及其基底膜管一起為軸突提供生長通道。雪旺細胞可以表達分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)、細胞外基質(zhì)(ECM)、神經(jīng)細胞粘附因子(NCAM)，有利于神經(jīng)元存活，且能促進軸突生長[14]。雪旺細胞膜能包繞再生軸突，形成髓鞘，促進軸突的成熟。因此，雪旺細胞的遷移能力對于神經(jīng)損傷后的修復，起著至關(guān)重要的作用。

水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是廣泛存在于原核和真核細胞膜上快速轉(zhuǎn)運水分子的特異性蛋白孔道，迄今為止哺乳動物中已經(jīng)克隆的水通道蛋白家族有13個成員(AQP0～AQP12)[15]。其中AQP3除了可以轉(zhuǎn)運水分子外，還可以轉(zhuǎn)運甘油和尿素等中性小分子，因此也被命名為水-甘油通道(Aquaglyceroporin)[16]。很多試驗已經(jīng)證實，AQP3能夠影響細胞的遷移和增殖。2008年，Hara等人通過transwell試驗證明培養(yǎng)的AQP3敲除鼠的角化細胞遷移率明顯下降，體外的傷口愈合抓痕試驗也表明AQP3敲除的角化細胞，傷口愈合變慢，傷口周圍的隆起也減小[17]。這些結(jié)果都提示AQP3與角化細胞的遷移有關(guān)。2006年，Levin等人發(fā)現(xiàn)，AQP3敲除后的角膜上皮細胞遷移和增殖發(fā)生了障礙，從而導致了角膜傷口愈合的減慢[18]。2007年，Thiagarajah等人報道說AQP3敲除小鼠的結(jié)腸炎模型中，由于AQP3缺乏影響了結(jié)腸細胞的遷移和增殖，從而導致了嚴重的結(jié)腸炎[19]。2016年，Zhu等人也報道了AQP3的缺失可以導致人支氣管上皮細胞(human bronchial epithelial cells)遷移降低，導致上皮細胞損傷修復能力降低[20]。由此可見，AQP3的缺失可以導致細胞遷移能力降低，影響細胞的修復功能。

圖3 雪旺細胞遷移功能測定

總之，AQP3的缺失可導致雪旺細胞遷移能力降低，從而影響坐骨神經(jīng)的損傷修復能力。

[1] Zheng M, Duan J, He Z,etal. Transplantation of bone marrow stromal stem cells overexpressing tropomyosin receptor kinase A for peripheral nerve repai[J]. Cytotherapy， 2017, 19(8): 916-926.

[2] Zhang D, Guo L, Zhu N,etal. Aquaporin-3 Deletion Reduces Glycerol and ATP Content in Mouse Sciatic Nerve [J]. CHEM RES CHINESE UNIVERSITIES， 2010, 26(6), 955-957.

[3] Hara M ， Verkman A S. Glycerol replacement corrects defective skin hydration, elasticity and barrier function in aquaporin-3-deficient mice [J].Proc Natl Acad. Sci USA， 2003， 100(12): 7 360-7 365.

[4] Sumiyuki M, Fuminari U, Shuya Y,etal. Nestin- Expressing Stem Cells Promote Nerve Growth in Long-Term 3-Dimensional Gelfoam-Supported Histoculture [J]. PLoS One, 2013, 8(6):e67153.

[5] Lukas F, Vincenzo P, Florian L,etal. A self-made, low-cost infrared system for evaluating the sciatic functional index in mice[J]. Neural Regen Res, 2016, 11(5): 829-834.

[6] Barry D M, Carpenter C, Yager C,etal. Variation of the neurofilament medium KSP repeat sub-domain across mammalian species: implications for altering axonal structure [J].J Exp Biol, 2010, 213(1):128-136.

[7] Patel J R, McCandless E E, Dorsey D,etal. CXCR4 promotes differentiation of oligodendrocyte progenitors and remyelination[J]. Proc Natl Acad Sci, 2010, 107(24):11 062-11 067.

[8] De Guzman R C, Loeb J A, Vande P J. Electrospinning of matrigel to deposit a basal lamina-like nanofiber surface [J]. J Biomater Sci Polym Ed, 2010, 21(8): 1 081-1 091.

[9] Coulpier F, Decker L, Funalot B,etal. CNS/PNS boundary transgression by central glia in the absence of Schwann cells or Krox20/Egr2 function [J].J Neurosci, 2010, 30(17):5 958-5 967.

[10] Mantuano E, Jo M, Gonias S L,etal. Low density lipoprotein receptor-related protein (LRP1) regulates Rac1 and RhoA reciprocally to control Schwann cell adhesion and migration[J].J Biol Chem, 2010, 285(19): 14 259-14 266.

[11] Afshari F T, Kwok J C, White L,etal. Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced aggrecan [J]. Glia, 2010, 58(7): 857-869.

[12] Zujovic V, Thibaud J, Bachelin C,etal. Boundary cap cells are highly competitive for CNS remyelination: fast migration and efficient differentiation in PNS and CNS myelin-forming cells[J].Stem Cells, 2010, 28(3):470-479.

[13] Inoue S, Cho B H, Song C H,etal. Migration and distribution of neural crest-derived cells in the human adrenal cortex at 9-16 weeks of gestation: an immunohistochemical study [J].Okajimas Folia Anat Jpn, 2010, 87(1):11-16.

[14] Krinke G J, Vidotto N, Weber E. Teased-fiber technique for peripheral myelinated erves: methodology and interpretation[J].Toxicol Pathol, 2000, 28(1):113-121.

[15] Reddy M, Dony E. Role of aquaporins in oral cancer [J]. J Cancer Res Ther, 2017, 13(1): 137-138.

[16] Jay R T, Jeffrey C, Jeremy A G ,eta1．Aquaporin-3 mediates hydrogen peroxide-dependent responses to environmental stress in colonic epithelia [J]．Proc Natl Acad Sci, 2017 J, 114(3): 568-573.

[17] Hara-Chikuma M, Verkman A S. Prevention of skin tumorigenesis and impairment of epidermal cell proliferation by targeted aquaporin-3 gene disruption [J]. Mol Cell Biol, 2008, 28(1): 326-332.

[18] Levin M H, Verkman A S.Aquaporin-3-dependent cell migration and proliferation during corneal re-epithelialization. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2006, 47(10):4 365-4 372.

[19] Thiagarajah J R, Zhao D, Verkman A S. Impaired enterocyte proliferation in aquaporin-3 deficiency in mouse models of colitis [J].Gut, 2007, 56(11): 1 K529-1 535.

[20] Zhu H X, Zhou J B, Zhu X D,etal. Impaired self-healing capacity in airway epithelia lacking aquaporin-3[J]. Respir Physiol Neurobiol, 2016, 233 (11):66-72.

EffectofAquaporin3deficiencyonfunctionalrecoveryofinjuredsciaticnervesinmice

ZHANG Di1, SU Wei-heng2, ZHAO Yuan1, GONG Qian1, QU Gui-juan1, PEI Zhi-hua1, LIU Shu-ming1, MA Hong-xia1

(1.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China ； 2.School of Life Science, Jilin University, Changchun 130012,China)

To investigate the effects of Aquaporin 3 deficiency on the functional recovery of injured sciatic nerves in mice, we detected the sciatic functional index (SFI), nerve conduction velocity (NCV) and Schwann cell migration between AQP3+/+ and AQP3-/- mice. The results showed that the SFI and NCV of AQP3-/- mice were significantly different when compared with AQP3+/+ mice. Migration of AQP3-/- Schwann cell also significantly decreased in transwell assay compared with AQP3+/+. These results suggest that AQP3 plays an important role in the functional recovery of injured sciatic nerves in mice.

Aquaporin 3 ； sciatic nerve injury and repair ； Mice ； Schwann cell

MA Hong-xia

S852

A

0529-6005(2017)10-0098-04

2017-05-25

國家自然科學基金青年科學基金項目(31402205)

張迪 (1980- )，男，講師，博士，從事細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能方面的研究，E-mail：zhangdi@jlau.edu.cn

馬紅霞，E-mail:hongxia0731001@163.com