周欣欣+黃兆峰+張佳+張靜+張朝賢

摘要：根據(jù)田旋花（Convolvulus arvensis L.）EPSPS基因（GenBank 登錄號：EU698030）cDNA 序列，設(shè)計含有酶切位點的特異性引物，以田旋花cDNA為模板，合成EPSPS基因并連接到含有35S啟動子和GUS基因的pBI121載體上，成功構(gòu)建植物超表達(dá)載體pBI-EPSPS。采用氯化鈣凍融法將其轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）中，然后用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥（Arabidopsis thaliana），共獲得15株卡那霉素抗性擬南芥苗。對其中的5株進(jìn)行PCR和RT-PCR檢測，結(jié)果表明EPSPS基因已整合到擬南芥的基因組中并可以表達(dá)。

關(guān)鍵詞：田旋花；EPSPS；擬南芥；表達(dá)載體

中圖分類號：S451 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1003-935X（2017）02-035-05

Construction of Expression Vector of Convolvulus arvensis EPSPSand Transformation of Arabidopsis thaliana

ZHOU Xin-xin1， HUANG Zhao-feng2， ZHANG Jia1， ZHANG Jing1， ZHANG Chao-xian2（1.Institute for the Control of Agrochemicals，Ministry of Agriculture，Beijing 100125，China；2.Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

Abstract：Based on the EPSPS gene cDNA （GenBank accession number： EU698030） from field bindweed （Convolvulus arvensis L.），specific primers containing enzyme digestion sites were designed. With the template of cDNA from field bindweed，an EPSPS gene was obtained and inserted into plasmid pBI121 that contains promoter 35S and GUS gene. A plant super expressed vector of pBI-EPSPS was constructed successfully and transferred to Arabidopsis thaliana by the Agrobacterium tumefaciens mediated transformation system. Fifteen transgenic plants were finally obtained，and five of them were analyzed by PCR and RT-PCR. The EPSPS gene was integrated into the genome of Arabidopsis thaliana and could be expressed.

Key words：Convolvulus arvensisL；EPSPS；Arabidopsis thaliana；expression vector

自1996年全球第1例抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆商品化種植以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在全球得到了迅猛發(fā)展。轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)入的性狀主要有耐除草劑、抗蟲、抗病、抗逆境等，耐除草劑性狀一直都占首要地位，其中，尤以耐草甘膦轉(zhuǎn)基因性狀居首[1]。草甘膦抑制植物體內(nèi)5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）的活性[2]，具有廣譜、高效、低毒、低殘留等特性，是使用范圍最廣、用量最大的除草劑[3-6]。目前，全球耐草甘膦作物主要有大豆、玉米、油菜、棉花和苜蓿，此外還有耐草甘膦轉(zhuǎn)基因馬鈴薯、小麥、甜菜[1]。

田旋花（Convolvulus arvensis L.）屬旋花科旋花屬植物，是世界重要的多年生惡性雜草之一。該雜草地下根系發(fā)達(dá)，以地下根芽及種子進(jìn)行繁殖，生命力極強[7]，對草甘膦具有天然耐藥性[8]，防除困難。近年來，田旋花在我國發(fā)生和危害日趨嚴(yán)重，在華北小麥田、新疆棉田等已成為優(yōu)勢雜草。

關(guān)于田旋花耐草甘膦機制的研究主要集中在非靶標(biāo)耐藥性，認(rèn)為對草甘膦吸收和傳導(dǎo)的差異并不是田旋花耐藥性的原因[7-9]。在草甘膦靶標(biāo)耐藥性方面，劉延等克隆了田旋花EPSPS基因（Genbank登錄號：EU698030），但在已證實導(dǎo)致抗性的氨基酸位點（如102位和106位）未發(fā)現(xiàn)突變[10]。張猛比較了不同田旋花種群耐藥性水平，并測定了草甘膦處理前后EPSPS基因表達(dá)的差異[11]。本試驗克隆了田旋花EPSPS基因的編碼區(qū)，構(gòu)建了植物超表達(dá)載體35S：：EPSPS并轉(zhuǎn)化擬南芥，最終獲得轉(zhuǎn)EPSPS基因擬南芥，為探討田旋花靶標(biāo)耐藥性機制提供了試材，并為培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因作物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

田旋花種子采自北京海淀區(qū)上莊鎮(zhèn)。擬南芥種子為筆者所在研究室保存。

根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101及pBI121載體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所晁躍輝博士惠贈。

克隆載體pMD19-T simple vector、限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶等購自TaKaRa公司，大腸桿菌菌株DH5α購自北京全式金生物科技有限公司，質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒為博邁德公司產(chǎn)品。endprint

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)田旋花EPSPS基因cDNA（GenBank登錄號：EU698030）序列，設(shè)計2對特異性引物，在5′端分別加上Xba Ⅰ和Sma Ⅰ限制酶酶切位點，引物序列為EPSPS-F：5′-TCTAGAATGGCGCAAGTGAACAACA-3′，EPSPS-R：5′-CCCGGGTCAATGCTTGGAGAACTTG-3′，由北京六合華大基因公司合成。

1.2.2 田旋花EPSPS基因的克隆 提取田旋花葉片總RNA，然后進(jìn)行RT-PCR將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，擴增 EPSPS基因的全長CDS。PCR擴增反應(yīng)體系為20 μL，包括10×PCR buffer 2 μL，dNTP 1 μL，ddH2O 13.5 μL，EPSPS-F 0.5 μL，EPSPS-R 0.5 μL，模板2 μL，Taq酶 0.5 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠檢測，回收預(yù)期大小的DNA片段。

1.2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收和純化后與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)氨芐青霉素篩選后挑選陽性克隆，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，送北京華大基因公司測序。測序正確的質(zhì)粒用Xba Ⅰ和Sma Ⅰ雙酶切，得到兩端含有酶切位點的目的基因片段；同時將pBI121載體用Xba Ⅰ和Sma Ⅰ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分別檢測酶切結(jié)果并回收酶切片段，最后將2個片段用T4連接酶連接起來，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，在含有卡那霉素的培養(yǎng)基平板上挑取陽性克隆，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，最終得到植物超表達(dá)載體35S：：EPSPS。

采用CaCl2凍融法將植物表達(dá)載體35S：：EPSPS轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂布于含有利福平（Rif）的LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.4 遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥 采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[12]，在轉(zhuǎn)擬南芥前1 d，將制備好的根癌農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)入含100 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃、280 r/min條件下過夜培養(yǎng)，當(dāng)菌液D600 nm在1.5～2.5之間時取出。4 ℃ 5 000 r/min離心10 min，棄上清，加入相應(yīng)體積的滲透培養(yǎng)基（蔗糖5%，Silwet L-77 005%）懸浮沉淀。將擬南芥花序浸沒于含有菌液的滲透培養(yǎng)基中，浸染2 min后將擬南芥放在恒溫室暗培養(yǎng)1 d，然后在正常光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)至開花結(jié)實。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選與檢測 將收集的種子于4 ℃低溫春化2 d，依次經(jīng)0.1% HgCl2消毒10 min，75%乙醇消毒3 min，然后用無菌水沖洗2次，鋪于含卡那霉素（50 mg/L）的1/2MS培養(yǎng)基中進(jìn)行抗性苗的篩選。采用CTAB法提取抗性擬南芥葉片總DNA，進(jìn)行PCR檢測。對PCR檢測為陽性的植株提取RNA進(jìn)行RT-PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 田旋花EPSPS基因的克隆與載體構(gòu)建

通過PCR反應(yīng)擴增EPSPS基因，得到大小約為1 500 bp的特異性片段（圖1）。將該片段回收純化后連接到pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌后測序，測序結(jié)果經(jīng)序列比對后顯示無堿基突變或缺失，說明成功克隆到EPSPS基因的編碼區(qū)，并可以用于植物超表達(dá)載體的構(gòu)建。

2.2 植物表達(dá)載體構(gòu)建

提取pBI121和pMD-EPSPS質(zhì)粒，分別用Xba Ⅰ和Sma Ⅰ雙酶切PBI121和pMD-EPSPS，回收目的片段后用T4連接酶連接構(gòu)建35S：：EPSPS表達(dá)載體。利用PCR進(jìn)行鑒定，將經(jīng)鑒定的陽性菌液提取質(zhì)粒，用Xba Ⅰ和Sma Ⅰ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測到1條約1 500 bp的條帶，該條帶與圖1中的條帶大小相吻合（圖2），說明已成功構(gòu)建植物表達(dá)載體，可用于擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化。

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗性篩選及檢測

通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將含有重組質(zhì)粒35S：：EPSPS的根癌農(nóng)桿菌侵染擬南芥（野生型）花序，收集轉(zhuǎn)化的擬南芥種子后平鋪于1/2MS培養(yǎng)基（含50 mg/L卡那霉素）中進(jìn)行抗性苗的篩選。約2周后，野生型擬南芥和未轉(zhuǎn)化成功的植株葉片出現(xiàn)白化癥狀并逐漸死亡，而抗性擬南芥植株葉片呈綠色，能夠正常生長（圖3）。

通過卡那霉素篩選共獲得了15株抗性擬南芥幼苗，對其中的5株抗性苗和野生型幼苗分別提取基因組DNA，以EPSPS-F和EPSPS-R為引物進(jìn)行PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，5株抗性擬南芥均能夠檢測出大小約1 500 bp的條帶，而野生型擬南芥無條帶，說明擬南芥植株轉(zhuǎn)化成功（圖4）。

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的RT-PCR檢測

分別提取轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型 （WT） 擬南芥幼苗總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以EPSPS-F和EPSPS-R為引物進(jìn)行PCR擴增。1%瓊脂糖凝膠上電泳分析PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥可以擴增得到約1 500 bp的片段，與EPSPS基因編碼區(qū)大小一致，而WT未出現(xiàn)條帶（圖5），表明田旋花EPSPS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中可以正常表達(dá)。

3 討論

由于擬南芥具有植株小、生育期短、結(jié)實多、基因組小、自花受粉等優(yōu)點，常作為模式植物被廣泛應(yīng)用在植物轉(zhuǎn)基因工作中?；ㄒ嘶ㄈ~病毒（CaMV）35 S啟動子是一種組成型啟動子，它具有多種順式作用元件，轉(zhuǎn)錄活性高，并且能夠有效地控制轉(zhuǎn)化植株新性狀的產(chǎn)生[12]。本試驗將田旋花EPSPS基因插入帶有35S啟動子的pBI121高效表達(dá)載體，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功地將EPSPS基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，為探討田旋花靶標(biāo)耐藥性機制提供了試驗材料。endprint

研究表明，將EPSPS基因?qū)胫参锸翘岣咂鋵Σ莞熟⒖剐缘挠行Т胧┲籟13]。王蕾應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將以色列二葉短柄草中的EPSPS基因?qū)胨局?，通過葉面涂抹草甘膦證明了轉(zhuǎn) EPSPS 基因水稻植株具有草甘膦抗性[14]。Shah等培育并篩選出了具有草甘膦抗性的矮牽牛細(xì)胞系，克隆EPSPS基因后發(fā)現(xiàn)，它可以過量表達(dá) EPSPS，將該基因轉(zhuǎn)化到矮牽牛中，矮牽牛表現(xiàn)出較高的草甘膦抗性[15]。黃麗華等采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將薤白EPSPS基因在煙草中超表達(dá)，得到的轉(zhuǎn)基因煙草提高了對草甘膦的耐藥性[16]。浙江大學(xué)從假單胞桿菌中克隆了EPSPS-G6基因，通過花粉管通道技術(shù)將該基因?qū)朊藁?，獲得了抗性強而穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)[17]。本研究以對草甘膦具有天然耐藥性的田旋花為試材，克隆了EPSPS編碼區(qū)，以pBI121載體為基礎(chǔ)構(gòu)建了植物過表達(dá)載體。將載體轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)PCR和RT-PCR檢測證明得到了轉(zhuǎn)EPSPS基因植株。以往的研究表明，田旋花與其他植物的 EPSPS 基因相比存在差異位點，采用點突變的方法將差異位點修飾后合成EPSPS基因并轉(zhuǎn)化擬南芥，比較不同轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐藥性差異，是下一步研究的重點內(nèi)容。

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