管冠+何天養(yǎng)+朱婧+姚鋒先+袁水秀

摘要：通過(guò)平板計(jì)數(shù)法、比色法、Biolog Eco微平板分析法測(cè)定柑橘黃龍病（citrus huanglongbing，HLB）不同染病級(jí)別臍橙的土壤微生物種群數(shù)量、土壤酶活性及土壤微生物功能多樣性。結(jié)果表明，與健康的晚棱臍橙相比，在感染黃龍病前期其土壤生物學(xué)性質(zhì)的變化不大；在感染的中后期，由于根系在營(yíng)養(yǎng)缺乏和病害的雙重影響下逐漸壞死，根系生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞，晚棱臍橙土壤的微生物數(shù)量、土壤酶活性及土壤微生物功能多樣性均明顯下降。

關(guān)鍵詞：柑橘黃龍?。悔M南臍橙；土壤；酶活性；微生物數(shù)量；微生物功能多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)： S436.661.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）20-0162-03

柑橘黃龍病是柑橘生產(chǎn)具有毀滅性的一種病害，堪稱(chēng)柑橘的癌癥，一旦發(fā)病大多采用根除果樹(shù)的辦法防治，對(duì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展發(fā)展危害極大[1]。由于黃龍病病原（韌皮部桿菌）的不可培養(yǎng)性，目前對(duì)于柑橘黃龍病的防治尚無(wú)特效藥劑，也沒(méi)有抗（耐）病品種可供應(yīng)用[2]。黃龍病由木虱傳播侵染，病樹(shù)主要表現(xiàn)為葉片斑駁型黃化、均勻型黃化、缺素型黃化和“紅鼻子”果等癥狀[3-4]。一般認(rèn)為，黃龍病病害癥狀的產(chǎn)生往往是其細(xì)胞、組織或器官受到某種破壞而變質(zhì)所致，同時(shí)也是葉片內(nèi)部礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素供給失衡的外顯[5]。有研究表明，在黃龍病的典型癥狀——葉片斑駁黃化之前，根系就已經(jīng)被病菌入侵，從而導(dǎo)致根系養(yǎng)分吸收與輸送功能受損并逐步喪失正常功能，使得根際土壤微生物的生存環(huán)境發(fā)生變化，威脅柑橘植株根系土壤的生態(tài)穩(wěn)定，不利于土壤微生物的活動(dòng)與土壤生物活性的維持[6-7]。

土壤生物學(xué)的研究表明，作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，土壤微生物直接參與土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的礦化過(guò)程，在維持整個(gè)土壤生態(tài)系統(tǒng)能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8]。而土壤微生物多樣性則是指土壤微生物及其與環(huán)境形成的生態(tài)復(fù)合體以及與此相關(guān)的各種生態(tài)過(guò)程的總和，是果園土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，它代表著土壤微生物群落的穩(wěn)定性[9]。與土壤理化性質(zhì)相比，土壤微生物對(duì)于果樹(shù)根系環(huán)境的變化更為敏感，同時(shí)在其利用碳源的代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物與果樹(shù)根系分泌物一起參與果樹(shù)對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收利用[10]?；钴S的土壤微生物活動(dòng)是自然狀態(tài)下培肥土壤的重要途徑，并對(duì)土壤酶活性的增加具有積極影響，有助于維持果園土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定以及果樹(shù)對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)元素的吸收利用，同時(shí)也可以評(píng)估植物根系病害的狀況。

本研究以感染柑橘黃龍病的晚熟臍橙品種晚棱為研究對(duì)象，以健康植株為對(duì)照，研究黃龍病侵染對(duì)晚熟臍橙果園土壤微生物數(shù)量、土壤酶活性及土壤微生物功能多樣性的影響，以探究贛南臍橙果園土壤生物學(xué)性質(zhì)對(duì)黃龍病的響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為5年生晚棱臍橙葉片及果園土壤，試驗(yàn)地位于江西省贛州市信豐縣嘉定鎮(zhèn)，地理坐標(biāo)為25°22′26 N，115°2′48 E，屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候，日照充足，降雨較多，年均日氣溫19.2 ℃，年均降水量1 500 mm。于2016年12月，在果園中隨機(jī)選取各病情級(jí)別的病樹(shù)3株，從不同方向采集有癥狀的葉片帶回實(shí)驗(yàn)室待測(cè)。土壤帶回實(shí)驗(yàn)室后在自然狀況下風(fēng)干，過(guò)2 mm篩保存待測(cè)。

1.2 黃龍病的分級(jí)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及經(jīng)驗(yàn)將存活的黃龍病侵染的病樹(shù)依病情分為5級(jí)[11-12]。0級(jí)：全樹(shù)無(wú)??；1級(jí)：樹(shù)上有1～2個(gè)梢有斑駁黃化葉出現(xiàn)；2級(jí)：樹(shù)上部分側(cè)枝或主枝有斑駁黃化癥狀，癥狀枝占全樹(shù)的1/3及以下；3級(jí)：癥狀側(cè)枝或主枝占全樹(shù)的1/3以上和2/3以下；4級(jí)：癥狀枝在2/3及以上。

1.3 分析方法

黃龍病的檢測(cè)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）進(jìn)行[3]；土壤微生物數(shù)量測(cè)定：細(xì)菌數(shù)量采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板混菌法培養(yǎng)測(cè)定；真菌數(shù)量采用孟加拉紅培養(yǎng)基平板混菌法培養(yǎng)測(cè)定；放線菌數(shù)量采用高氏l號(hào)培養(yǎng)基平板混菌法培養(yǎng)測(cè)定[13]。土壤酶活性的測(cè)定：磷酸酶活性采用PNPP法測(cè)定[14]，脲酶活性采用苯酚鈉比色法測(cè)定[14]，蔗糖酶活性采用水楊酸比色法測(cè)定[15-16]。

土壤微生物群落功能多樣性采用Biolog Eco微平板分析法測(cè)定，取10 g新鮮土壤加入100 mL滅菌的0.9% NaCl水溶液中，200 r/min振蕩10 min，將其稀釋至1 000倍后接種（150 μL），25 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d，每隔24 h用多功能酶標(biāo)儀在590 nm波長(zhǎng)下讀數(shù)，計(jì)算獲得平均顏色變化率（average well colourdevelopment，AWCD）[17]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)測(cè)定數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行整理，SigmaPlot 100作圖，采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃龍病的分子檢測(cè)

從晚棱臍橙葉片黃龍病病原菌PCR檢測(cè)結(jié)果可以看出，未染病的0級(jí)健康樹(shù)體葉片上沒(méi)有擴(kuò)增到目的條帶，而1～4級(jí)存活的黃龍病晚棱臍橙樹(shù)上所采集的斑駁黃化葉片均擴(kuò)增得到 1 167 bp 的目的條帶（圖1）。結(jié)果表明，在試驗(yàn)果園中，所采的黃龍病樹(shù)體從分子水平上可判定為已感染黃龍病病原菌，而所采無(wú)癥狀果樹(shù)則尚未感染黃龍病病原菌。

2.2 黃龍病對(duì)晚棱臍橙果園土壤微生物種群數(shù)量的影響

在本試驗(yàn)中，與健康的晚棱臍橙土壤的細(xì)菌數(shù)量相比，黃龍病侵染中后期的晚棱臍橙土壤細(xì)菌數(shù)量均出現(xiàn)不同程度的減少（表1）。如3級(jí)和4級(jí)病害的晚棱臍橙土壤的細(xì)菌數(shù)量與健康植株（0級(jí)病害）土壤相比，均顯著減少；而1級(jí)病害的晚棱臍橙土壤細(xì)菌數(shù)量與健康植株則沒(méi)有顯著差別。晚棱臍橙果園土壤中的真菌數(shù)量在黃龍病感染后期下降明顯，即在3級(jí)和4級(jí)染病果樹(shù)土壤中真菌數(shù)量下降幅度明顯；而在黃龍病感染前期（1級(jí)，2級(jí)），與健康植株土壤相比，其土壤真菌數(shù)量變化不大。土壤放線菌數(shù)量在黃龍病感染的整個(gè)過(guò)程中雖然有小幅減少，但從統(tǒng)計(jì)分析上看差異未達(dá)到顯著水平。endprint

2.3 黃龍病對(duì)晚棱臍橙果園土壤酶活性的影響

在本試驗(yàn)中所采土壤為掛果期果園果樹(shù)樹(shù)冠滴水線內(nèi) 0～20 cm表層土樣。黃龍病對(duì)晚棱臍橙果園土壤酶活性的影響如圖2所示。在本試驗(yàn)中，與健康晚棱臍橙（0級(jí)病害）相比，在黃龍病感染的后期，3級(jí)和4級(jí)染病果樹(shù)的土壤蔗糖酶活性下降顯著，而在黃龍病感染果樹(shù)的前中期（1級(jí)、2級(jí)病害），土壤蔗糖酶活性并未發(fā)生顯著變化（圖2-a）。與土壤蔗糖酶活性類(lèi)似，晚棱臍橙在黃龍病感染后，與健康植株相比，其土壤脲酶活性均發(fā)生了不同程度的下降。特別是在黃龍病感染后期，4級(jí)染病果樹(shù)的土壤脲酶活性相比健康植株（0級(jí)病害）土壤顯著下降（圖2-b）。在黃龍病侵染晚棱臍橙后，土壤酸性磷酸酶活性發(fā)生了不同程度的下降，表現(xiàn)出與前2種酶類(lèi)似的變化趨勢(shì)（圖2-c）。在黃龍病感染前期（1級(jí)病害）土壤酸性磷酸酶活性沒(méi)有發(fā)生顯著下降，而在黃龍病感染中后期，土壤酸性磷酸酶活性的下降幅度明顯，其中4級(jí)病害晚棱臍橙的土壤酸性磷酸酶活性相比健康植株（0級(jí)病害）顯著下降。

2.4 黃龍病對(duì)晚棱臍橙果園土壤微生物功能多樣性的影響

平均顏色變化率（AWCD）反映了土壤微生物群落利用碳源的整體能力，能夠表征土壤微生物群落的整體代謝活性[18]。黃龍病對(duì)晚棱臍橙果園土壤微生物功能多樣性的影響如圖3所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，各處理的AWCD值均呈“S”形逐漸增加，符合微生物的生長(zhǎng)規(guī)律。在培養(yǎng)的0～24 h，不同染病級(jí)別的土壤AWCD值較低，土壤微生物對(duì)于碳源的利用較少，代謝活性低。在培養(yǎng)24 h之后，不同染病級(jí)別的土壤AWCD值呈指數(shù)增長(zhǎng)，一方面反映了微生物數(shù)量的增加，另外一方面表明土壤微生物在24 h后的代謝活性顯著提高。在培養(yǎng)后期（144～168 h），不同染病級(jí)別的土壤AWCD不再增加，表明土壤微生物活性趨于穩(wěn)定。AWCD與土壤酶活性的表現(xiàn)類(lèi)似，在本試驗(yàn)中，與健康晚棱臍橙（0級(jí)病害）相比，在黃龍病感染的后期（3級(jí)、4級(jí)染病果樹(shù)）土壤的AWCD值下降明顯，其中4級(jí)病害果樹(shù)土壤的AWCD值最低。而黃龍病感染前期（1級(jí)、2級(jí)病害）的晚棱臍橙土壤的AWCD值則沒(méi)有明顯差異。

3 討論

土壤微生物的生長(zhǎng)需要利用土壤碳源，其代謝過(guò)程中釋放的多種次生代謝產(chǎn)物與臍橙根系分泌物互作，會(huì)在土壤根系附近形成復(fù)雜且穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，而土壤生物學(xué)性質(zhì)能夠有效地反映根系土壤生態(tài)環(huán)境的變化[19]。雖然黃龍病病原菌本身并不會(huì)直接污染臍橙土壤，但由于黃龍病危害，臍橙植株?duì)I養(yǎng)元素的離子流會(huì)發(fā)生變化，以致植株根系營(yíng)養(yǎng)的供給失衡[20]。大量報(bào)道表明，在黃龍病侵染臍橙后，葉片和莖中會(huì)出現(xiàn)淀粉累積，根部淀粉被耗盡，以致根系表皮逐漸脫落、腐爛，繼而喪失其正常的生理功能[21-22]。同時(shí)，黃龍病病原菌的入侵導(dǎo)致根系功能逐步減弱，使得植物-土壤-微生物原有健康的根際生態(tài)遭到破壞。

有研究表明，黃龍病病原菌在根部的定殖早于葉、莖，但在染病前期葉、莖部分可檢出的病原菌相對(duì)含量遠(yuǎn)大于根[23-24]。在本試驗(yàn)中，與健康臍橙相比，黃龍病感染初期土壤微生物數(shù)量沒(méi)有顯著變化，土壤細(xì)菌、真菌數(shù)量的顯著下降表現(xiàn)在黃龍病感染后期，而土壤酶活性及土壤微生物功能多樣性也呈現(xiàn)類(lèi)似的特征。研究結(jié)果表明，在黃龍病感染臍橙初期，根系土壤生態(tài)環(huán)境并未立即遭到破壞。這可能是因?yàn)辄S龍病病原菌主要寄生在韌皮部，早期被侵染的植物會(huì)自主地激活相應(yīng)的防御體系如營(yíng)養(yǎng)免疫等多種方式以抵抗病原菌的入侵，以保證根對(duì)土壤礦質(zhì)離子的吸收過(guò)程照常進(jìn)行[25]。而在黃龍病感染后期，胼胝質(zhì)的積累堵塞了篩管運(yùn)輸系統(tǒng)導(dǎo)致礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素不能有效地運(yùn)輸?shù)礁担瑫r(shí)根系黃龍病病原菌的含量增加，導(dǎo)致根系在營(yíng)養(yǎng)缺乏和病害的雙重影響下逐漸壞死，破壞原有的根系土壤生態(tài)環(huán)境。由于賴(lài)以生存的基礎(chǔ)環(huán)境發(fā)生變化和破壞，原有生存在根系土壤周?chē)奈⑸飻?shù)量開(kāi)始減少，土壤微生物功能多樣性也隨之下降[26]。而幾種參與營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)的土壤酶（蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶）本身與土壤微生物代謝關(guān)系密切[27]，在本試驗(yàn)中呈現(xiàn)出與土壤微生物類(lèi)似的變化特征也符合理論預(yù)期。

4 結(jié)論

晚棱臍橙感染黃龍病前期的土壤生物學(xué)性質(zhì)未發(fā)生顯著變化，而在感染的中后期，由于根系在營(yíng)養(yǎng)缺乏和病害的雙重影響下逐漸壞死，根系生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞，土壤的微生物數(shù)量、土壤酶活性及土壤微生物功能多樣性均明顯下降。研究結(jié)果表明，當(dāng)晚棱臍橙黃龍病癥狀側(cè)枝或主枝占全樹(shù)的1/3以上時(shí)，其土壤生物學(xué)性質(zhì)顯著下降。

參考文獻(xiàn)：

[1]胡文召. 中國(guó)柑橘黃龍病病原及分化研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2010.

[2]Tyler H L，Roesch L F，Gowda S，et al. Confirmation of the sequence of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus and assessment of microbial diversity in Huanglongbing-infected citrus phloem using a metagenomic approach[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2009，22（12）：1624-1634.

[3]蘇華楠. 中國(guó)柑橘黃龍病病原調(diào)查、種群遺傳分化及其原噬菌體溶菌酶蛋白原核表達(dá)[D]. 重慶：西南大學(xué)，2013.

[4]許美容，陳燕玲，鄧曉玲. 柑橘黃龍病癥狀與“Candidatus Liberibacter asiaticus”P(pán)CR檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2016，46（3）：367-373.

[5]曹繼容. 柑橘葉片離子組及其對(duì)黃龍病病原菌侵染的響應(yīng)[D]. 重慶：西南大學(xué)，2014.

[6]Johnson E G，Wu J，Bright D B，et al. Association of‘Candidatus Liberibacter asiaticusroot infection，but not phloem plugging with root loss on huanglongbing-affected trees prior to appearance of foliar symptoms[J]. Plant Pathology，2014，63（2）：290-298.endprint

[7]馬曉芳. 柑橘木虱轉(zhuǎn)錄組分析及與柑橘黃龍病病原菌互作的初步研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2014.

[8]賀紀(jì)正，王軍濤. 土壤微生物群落構(gòu)建理論與時(shí)空演變特征[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2015，35（20）：6575-6583.

[9]林先貴，胡君利. 土壤微生物多樣性的科學(xué)內(nèi)涵及其生態(tài)服務(wù)功能[J]. 土壤學(xué)報(bào)，2008，45（5）：892-900.

[10]管 冠，姚鋒先，劉桂東，等. 不同施肥年限對(duì)贛南臍橙果園土壤酶活性及微生物種群的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：382-385.

[11]胡文召. 中國(guó)柑橘黃龍病病原及分化研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2010.

[12]袁亦文，戈麗清，王德善，等. 柑橘黃龍病對(duì)柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（1）：87-88.

[13]Xu G H，Zheng H Y. Analytical handbook of Soil microbes[M]. Beijing：China Agriculture Press，1986.

[14]邱現(xiàn)奎，董元杰，萬(wàn)勇善，等. 不同施肥處理對(duì)土壤養(yǎng)分含量及土壤酶活性的影響[J]. 土壤，2010，42（2）：249-255.

[15]Tabatabai M A. Soil enzymes[M]//Wearer R W，Augle J S，Bottomley P S. Methods of soil analysis. Part2. Microbiological and biochemical properties properties. Madison，Wis.：SSSA，1994：775-883.

[16]關(guān)松蔭. 土壤酶及其研究方法[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1986.

[17]Xue D，Yao H Y，Ge D Y，et al. Soil microbial community structure in diverse land use systems：a comparative study using biolog，DGGE，and PLFA analyses[J]. PEDOSPHERE，2008，18（5）：653-663.

[18]夏 昕，石 坤，黃欠如，等. 長(zhǎng)期不同施肥條件下紅壤性水稻土微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[J]. 土壤學(xué)報(bào)，2015（3）：697-705.

[19]Guan G，Tu S X，Li H L，et al. Phosphorus fertilization modes affect crop yield，nutrient uptake，and soil biological properties in the rice-wheat cropping system[J]. Soil Science Society of America Journal，2013，77（1）：166-172.

[20]高玉霞，盧占軍，劉志芳，等. 柑橘黃龍病診斷方法的研究進(jìn)展[J]. 贛南師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34（3）：37-40.

[21]郭 恒. 基于碘-淀粉反應(yīng)的柑橘黃龍病鑒定技術(shù)的研究[D]. 廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[22]陳國(guó)慶，鹿連明，杜丹超，等. 柑橘黃龍病防控技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 浙江柑桔，2012（3）：20-27.

[23]黃愛(ài)軍. 韌皮部桿菌亞洲種簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）多態(tài)性及其侵染甜橙后轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2014.

[24]孫麗琴. 攜帶黃龍病菌的柑桔木虱內(nèi)生細(xì)菌菌群多樣性分析及功能驗(yàn)證[D]. 重慶：重慶大學(xué)，2014.

[25]樊 晶. 柑橘宿主對(duì)黃龍病病原菌侵染的應(yīng)答機(jī)制[D]. 重慶：重慶大學(xué)，2010.

[26]戴澤翰，許美容，鄧曉玲. 感染黃龍病菌的柑橘葉片解剖學(xué)研究[C]//中國(guó)植物病理學(xué)會(huì). 中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2015年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集.北京：中囯農(nóng)業(yè)出版社，2015.

[27]李南潔，曾清蘋(píng)，何丙輝，等. 縉云山柑橘林土壤微生物磷脂脂肪酸（PLFAs）及酶活性的季節(jié)變化特征[J]. 環(huán)境科學(xué)，2017（1）：309-317.endprint