管冠+何天養(yǎng)+朱婧+姚鋒先+袁水秀

摘要：通過平板計數(shù)法、比色法、Biolog Eco微平板分析法測定柑橘黃龍病（citrus huanglongbing，HLB）不同染病級別臍橙的土壤微生物種群數(shù)量、土壤酶活性及土壤微生物功能多樣性。結果表明，與健康的晚棱臍橙相比，在感染黃龍病前期其土壤生物學性質(zhì)的變化不大；在感染的中后期，由于根系在營養(yǎng)缺乏和病害的雙重影響下逐漸壞死，根系生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞，晚棱臍橙土壤的微生物數(shù)量、土壤酶活性及土壤微生物功能多樣性均明顯下降。

關鍵詞：柑橘黃龍病；贛南臍橙；土壤；酶活性；微生物數(shù)量；微生物功能多樣性

中圖分類號： S436.661.1+9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0162-03

柑橘黃龍病是柑橘生產(chǎn)具有毀滅性的一種病害，堪稱柑橘的癌癥，一旦發(fā)病大多采用根除果樹的辦法防治，對產(chǎn)業(yè)發(fā)展發(fā)展危害極大[1]。由于黃龍病病原（韌皮部桿菌）的不可培養(yǎng)性，目前對于柑橘黃龍病的防治尚無特效藥劑，也沒有抗（耐）病品種可供應用[2]。黃龍病由木虱傳播侵染，病樹主要表現(xiàn)為葉片斑駁型黃化、均勻型黃化、缺素型黃化和“紅鼻子”果等癥狀[3-4]。一般認為，黃龍病病害癥狀的產(chǎn)生往往是其細胞、組織或器官受到某種破壞而變質(zhì)所致，同時也是葉片內(nèi)部礦質(zhì)營養(yǎng)元素供給失衡的外顯[5]。有研究表明，在黃龍病的典型癥狀——葉片斑駁黃化之前，根系就已經(jīng)被病菌入侵，從而導致根系養(yǎng)分吸收與輸送功能受損并逐步喪失正常功能，使得根際土壤微生物的生存環(huán)境發(fā)生變化，威脅柑橘植株根系土壤的生態(tài)穩(wěn)定，不利于土壤微生物的活動與土壤生物活性的維持[6-7]。

土壤生物學的研究表明，作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，土壤微生物直接參與土壤營養(yǎng)物質(zhì)的礦化過程，在維持整個土壤生態(tài)系統(tǒng)能量流動和物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮著關鍵作用[8]。而土壤微生物多樣性則是指土壤微生物及其與環(huán)境形成的生態(tài)復合體以及與此相關的各種生態(tài)過程的總和，是果園土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，它代表著土壤微生物群落的穩(wěn)定性[9]。與土壤理化性質(zhì)相比，土壤微生物對于果樹根系環(huán)境的變化更為敏感，同時在其利用碳源的代謝過程中所產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物與果樹根系分泌物一起參與果樹對土壤養(yǎng)分的吸收利用[10]?；钴S的土壤微生物活動是自然狀態(tài)下培肥土壤的重要途徑，并對土壤酶活性的增加具有積極影響，有助于維持果園土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定以及果樹對土壤營養(yǎng)元素的吸收利用，同時也可以評估植物根系病害的狀況。

本研究以感染柑橘黃龍病的晚熟臍橙品種晚棱為研究對象，以健康植株為對照，研究黃龍病侵染對晚熟臍橙果園土壤微生物數(shù)量、土壤酶活性及土壤微生物功能多樣性的影響，以探究贛南臍橙果園土壤生物學性質(zhì)對黃龍病的響應。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為5年生晚棱臍橙葉片及果園土壤，試驗地位于江西省贛州市信豐縣嘉定鎮(zhèn)，地理坐標為25°22′26 N，115°2′48 E，屬中亞熱帶季風濕潤氣候，日照充足，降雨較多，年均日氣溫19.2 ℃，年均降水量1 500 mm。于2016年12月，在果園中隨機選取各病情級別的病樹3株，從不同方向采集有癥狀的葉片帶回實驗室待測。土壤帶回實驗室后在自然狀況下風干，過2 mm篩保存待測。

1.2 黃龍病的分級

根據(jù)文獻報道及經(jīng)驗將存活的黃龍病侵染的病樹依病情分為5級[11-12]。0級：全樹無??；1級：樹上有1～2個梢有斑駁黃化葉出現(xiàn)；2級：樹上部分側枝或主枝有斑駁黃化癥狀，癥狀枝占全樹的1/3及以下；3級：癥狀側枝或主枝占全樹的1/3以上和2/3以下；4級：癥狀枝在2/3及以上。

1.3 分析方法

黃龍病的檢測通過聚合酶鏈式反應（PCR）進行[3]；土壤微生物數(shù)量測定：細菌數(shù)量采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板混菌法培養(yǎng)測定；真菌數(shù)量采用孟加拉紅培養(yǎng)基平板混菌法培養(yǎng)測定；放線菌數(shù)量采用高氏l號培養(yǎng)基平板混菌法培養(yǎng)測定[13]。土壤酶活性的測定：磷酸酶活性采用PNPP法測定[14]，脲酶活性采用苯酚鈉比色法測定[14]，蔗糖酶活性采用水楊酸比色法測定[15-16]。

土壤微生物群落功能多樣性采用Biolog Eco微平板分析法測定，取10 g新鮮土壤加入100 mL滅菌的0.9% NaCl水溶液中，200 r/min振蕩10 min，將其稀釋至1 000倍后接種（150 μL），25 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d，每隔24 h用多功能酶標儀在590 nm波長下讀數(shù)，計算獲得平均顏色變化率（average well colourdevelopment，AWCD）[17]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗測定數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行整理，SigmaPlot 100作圖，采用SAS 8.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 黃龍病的分子檢測

從晚棱臍橙葉片黃龍病病原菌PCR檢測結果可以看出，未染病的0級健康樹體葉片上沒有擴增到目的條帶，而1～4級存活的黃龍病晚棱臍橙樹上所采集的斑駁黃化葉片均擴增得到 1 167 bp 的目的條帶（圖1）。結果表明，在試驗果園中，所采的黃龍病樹體從分子水平上可判定為已感染黃龍病病原菌，而所采無癥狀果樹則尚未感染黃龍病病原菌。

2.2 黃龍病對晚棱臍橙果園土壤微生物種群數(shù)量的影響

在本試驗中，與健康的晚棱臍橙土壤的細菌數(shù)量相比，黃龍病侵染中后期的晚棱臍橙土壤細菌數(shù)量均出現(xiàn)不同程度的減少（表1）。如3級和4級病害的晚棱臍橙土壤的細菌數(shù)量與健康植株（0級病害）土壤相比，均顯著減少；而1級病害的晚棱臍橙土壤細菌數(shù)量與健康植株則沒有顯著差別。晚棱臍橙果園土壤中的真菌數(shù)量在黃龍病感染后期下降明顯，即在3級和4級染病果樹土壤中真菌數(shù)量下降幅度明顯；而在黃龍病感染前期（1級，2級），與健康植株土壤相比，其土壤真菌數(shù)量變化不大。土壤放線菌數(shù)量在黃龍病感染的整個過程中雖然有小幅減少，但從統(tǒng)計分析上看差異未達到顯著水平。endprint

2.3 黃龍病對晚棱臍橙果園土壤酶活性的影響

在本試驗中所采土壤為掛果期果園果樹樹冠滴水線內(nèi) 0～20 cm表層土樣。黃龍病對晚棱臍橙果園土壤酶活性的影響如圖2所示。在本試驗中，與健康晚棱臍橙（0級病害）相比，在黃龍病感染的后期，3級和4級染病果樹的土壤蔗糖酶活性下降顯著，而在黃龍病感染果樹的前中期（1級、2級病害），土壤蔗糖酶活性并未發(fā)生顯著變化（圖2-a）。與土壤蔗糖酶活性類似，晚棱臍橙在黃龍病感染后，與健康植株相比，其土壤脲酶活性均發(fā)生了不同程度的下降。特別是在黃龍病感染后期，4級染病果樹的土壤脲酶活性相比健康植株（0級病害）土壤顯著下降（圖2-b）。在黃龍病侵染晚棱臍橙后，土壤酸性磷酸酶活性發(fā)生了不同程度的下降，表現(xiàn)出與前2種酶類似的變化趨勢（圖2-c）。在黃龍病感染前期（1級病害）土壤酸性磷酸酶活性沒有發(fā)生顯著下降，而在黃龍病感染中后期，土壤酸性磷酸酶活性的下降幅度明顯，其中4級病害晚棱臍橙的土壤酸性磷酸酶活性相比健康植株（0級病害）顯著下降。

2.4 黃龍病對晚棱臍橙果園土壤微生物功能多樣性的影響

平均顏色變化率（AWCD）反映了土壤微生物群落利用碳源的整體能力，能夠表征土壤微生物群落的整體代謝活性[18]。黃龍病對晚棱臍橙果園土壤微生物功能多樣性的影響如圖3所示，隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，各處理的AWCD值均呈“S”形逐漸增加，符合微生物的生長規(guī)律。在培養(yǎng)的0～24 h，不同染病級別的土壤AWCD值較低，土壤微生物對于碳源的利用較少，代謝活性低。在培養(yǎng)24 h之后，不同染病級別的土壤AWCD值呈指數(shù)增長，一方面反映了微生物數(shù)量的增加，另外一方面表明土壤微生物在24 h后的代謝活性顯著提高。在培養(yǎng)后期（144～168 h），不同染病級別的土壤AWCD不再增加，表明土壤微生物活性趨于穩(wěn)定。AWCD與土壤酶活性的表現(xiàn)類似，在本試驗中，與健康晚棱臍橙（0級病害）相比，在黃龍病感染的后期（3級、4級染病果樹）土壤的AWCD值下降明顯，其中4級病害果樹土壤的AWCD值最低。而黃龍病感染前期（1級、2級病害）的晚棱臍橙土壤的AWCD值則沒有明顯差異。

3 討論

土壤微生物的生長需要利用土壤碳源，其代謝過程中釋放的多種次生代謝產(chǎn)物與臍橙根系分泌物互作，會在土壤根系附近形成復雜且穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，而土壤生物學性質(zhì)能夠有效地反映根系土壤生態(tài)環(huán)境的變化[19]。雖然黃龍病病原菌本身并不會直接污染臍橙土壤，但由于黃龍病危害，臍橙植株營養(yǎng)元素的離子流會發(fā)生變化，以致植株根系營養(yǎng)的供給失衡[20]。大量報道表明，在黃龍病侵染臍橙后，葉片和莖中會出現(xiàn)淀粉累積，根部淀粉被耗盡，以致根系表皮逐漸脫落、腐爛，繼而喪失其正常的生理功能[21-22]。同時，黃龍病病原菌的入侵導致根系功能逐步減弱，使得植物-土壤-微生物原有健康的根際生態(tài)遭到破壞。

有研究表明，黃龍病病原菌在根部的定殖早于葉、莖，但在染病前期葉、莖部分可檢出的病原菌相對含量遠大于根[23-24]。在本試驗中，與健康臍橙相比，黃龍病感染初期土壤微生物數(shù)量沒有顯著變化，土壤細菌、真菌數(shù)量的顯著下降表現(xiàn)在黃龍病感染后期，而土壤酶活性及土壤微生物功能多樣性也呈現(xiàn)類似的特征。研究結果表明，在黃龍病感染臍橙初期，根系土壤生態(tài)環(huán)境并未立即遭到破壞。這可能是因為黃龍病病原菌主要寄生在韌皮部，早期被侵染的植物會自主地激活相應的防御體系如營養(yǎng)免疫等多種方式以抵抗病原菌的入侵，以保證根對土壤礦質(zhì)離子的吸收過程照常進行[25]。而在黃龍病感染后期，胼胝質(zhì)的積累堵塞了篩管運輸系統(tǒng)導致礦質(zhì)營養(yǎng)元素不能有效地運輸?shù)礁?，同時根系黃龍病病原菌的含量增加，導致根系在營養(yǎng)缺乏和病害的雙重影響下逐漸壞死，破壞原有的根系土壤生態(tài)環(huán)境。由于賴以生存的基礎環(huán)境發(fā)生變化和破壞，原有生存在根系土壤周圍的微生物數(shù)量開始減少，土壤微生物功能多樣性也隨之下降[26]。而幾種參與營養(yǎng)元素循環(huán)的土壤酶（蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶）本身與土壤微生物代謝關系密切[27]，在本試驗中呈現(xiàn)出與土壤微生物類似的變化特征也符合理論預期。

4 結論

晚棱臍橙感染黃龍病前期的土壤生物學性質(zhì)未發(fā)生顯著變化，而在感染的中后期，由于根系在營養(yǎng)缺乏和病害的雙重影響下逐漸壞死，根系生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞，土壤的微生物數(shù)量、土壤酶活性及土壤微生物功能多樣性均明顯下降。研究結果表明，當晚棱臍橙黃龍病癥狀側枝或主枝占全樹的1/3以上時，其土壤生物學性質(zhì)顯著下降。

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