張燕萍+賀剛+王生+吳斌+周輝明+傅培峰+方春林

摘要：以線粒體DNA D-loop 全序列為分子標記，研究4個刀鱭群體（長江口刀鱭、鄱陽湖湖口刀鱭、鄱陽湖湖區(qū)刀鱭、鄱陽湖湖口刀鱭幼魚）及鄱陽湖短頜鱭群體的遺傳多樣性。結果顯示：刀鱭的D-loop 序列長1 212～1 293 bp，短頜鱭的序列長 1 210～1 252 bp；在5個群體的 55尾個體中，共檢測到變異位點72 個，其中單一多態(tài)位點50個，簡約信息位點22個；共檢測到 45 個不同的單倍型，單倍型多態(tài)性為 0.989，核苷酸多樣性為 0.009 1，平均核苷酸差異數（K）為10.079。5個群體的遺傳多樣性豐富程度排序為鄱陽湖刀鱭幼魚>鄱陽湖湖口刀鱭>鄱陽湖短頜鱭>鄱陽湖刀鱭>長江口刀鱭；不同單倍型間的遺傳距離為 0.014～0.728，平均遺傳距離為0.188。此外，系統(tǒng)發(fā)育樹也表明，刀鱭、短頜鱭共同構成1個單系群，為2種生態(tài)型種群，尚未達到種或亞種的分化。

關鍵詞：刀鱭；短頜鱭；線粒體DNA；D-loop 序列；遺傳多樣性；遺傳結構差異

中圖分類號： S917 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0059-05

鱭屬（Coilia）隸屬于鯡形目（Cluperiformes）鳀科（Engraulidae），是分布于印度洋-太平洋地區(qū)、具有極高經濟價值的中小型魚類。世界上的鱭屬魚類有13種，其中中國分布有4種：七絲鱭（Coiiia.grayi）、鳳鱭（Coiiia.mystus）、刀鱭（Coiiia. nasus）和短頜鱭（Coiiia.brachynathus），它們主要分布于中國沿海及長江中下游地區(qū)。刀鱭肉質細嫩鮮美，被列為“長江三鮮”之一，深受廣大群眾的喜愛，具有重要的經濟價值，也是主要的捕撈對象之一[1]。短頜鱭屬華中區(qū)特有種，是德國人Kreyenberg、Pappenheim于1908年依據洞庭湖的標本確立的一個物種。長期以來，由于其上頜骨較短與長江中下游及其附屬大型湖泊等淡水性分布的特征，短頜鱭一直被視為有別于刀鱭的有效物種。但是隨著人們在巢湖、太湖等通江湖泊發(fā)現刀鱭淡水定居性種群，短頜鱭與刀鱭在生態(tài)學上的差異變得模糊，兩者的鑒別主要依據上頜骨長度等界限不甚清晰的形態(tài)特征，從而引發(fā)對短頜鱭物種有效性問題的討論。鱭屬魚類外形十分相似，該屬刀鱭和短頜鱭的分類問題一直存在較大爭議。

短頜鱭在20世紀70年代也是鄱陽湖的主要捕撈對象。近些年來，由于過度捕撈和生態(tài)環(huán)境破壞等因素，自20世紀90年代起，其種群數量逐年下降。鄱陽湖鱭屬魚類在1983年產量約為1 100 t，1995年產量為1 385 t，1998年下降至550 t[2]。從鄱陽湖漁獲物種群（組成）分析看，1974年鱭屬魚類占鄱陽湖漁獲物質量的10%～15%[3]，1984年占09%，2001年占1.5%。江西省水產科學研究所近10年對鄱陽湖調查表明，鱭屬魚類占鄱陽湖漁獲物質量分數不足10%。目前在鄱陽湖鱭屬魚類魚汛比20世紀70年代晚1～2個月，汛期也由20 d左右縮減為3～5 d，其資源狀況不容樂觀。由于每年鄱陽湖野生鱭屬魚類的資源量都有明顯下降，其種群結構是否也在發(fā)生變化有待研究，因此對鱭屬幼體的遺傳多樣性和物種判別研究十分必要。

線粒體DNA具有母系遺傳、分子結構穩(wěn)定、較快的進化速率等特點[4]，成為研究物種起源、系統(tǒng)進化等的有效分子標記。線粒體DNA控制區(qū)序列，由于不編碼蛋白質，比線粒體其他部分的基因具有更快的進化速率，因此廣泛應用于親緣關系近的物種或種群間的遺傳結構多樣性及種群歷史等方面的研究。本研究通過對線粒體DNA控制區(qū)全序列進行分析，研究長江口、鄱陽湖刀鱭群體和短頜鱭群體在遺傳結構方面的差異，以期為長江流域刀鱭和短頜鱭合理的保護、管理、利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的刀鱭樣本于2014年4—11月采集于上海長江口（13個樣本）、鄱陽湖湖口（10個樣本）及鄱陽湖湖區(qū)（14個樣本）3個不同的采樣點的4個群體；鄱陽湖刀鱭幼魚9尾采自全湖；短頜鱭樣本來自鄱陽湖湖區(qū)。每尾魚剪取少許肌肉分別放入Eppendorf管內，于95%乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取100 mg乙醇保存肌肉樣品剪碎，分別放入1.5 mL Eppendorf管內，加入400 L SET緩沖液，再依次加入40 μL 10%十二烷基硫酸鈉（SDS）、10 μL（ 20 mg/mL）蛋白酶K，混合后在55℃水浴中消化過夜，再分別用平衡酚、三氯甲烷/異戊醇抽提除蛋白，最后用預冷的無水乙醇沉淀DNA，烘干后用TE溶解。所得基因組DNA樣品用紫外分光光度計測量DNA樣品的濃度、純度，同時用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性并估測分子量，將DNA原樣稀釋至 50 ng/μL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增及測序 使用2個通用引物DF1、DR2擴增D-loop區(qū)段基因，引物序列DF1： 5′-CTAACTCCCAAA GCTAGAATTCT-3′，DR2： 5′-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3′[5]。擴增反應混合物總體積 50 μL，包括2.0 μL DNA模板、5 μL 10×reaction buffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTP、各2 μL引物（濃度 10 mmol/L）、0.25μL Taq酶（5 U），用無菌ddH2O補至50 μL。PCR擴增程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并拍照記錄。目標擴增產物用試劑盒回收純化后，由上海博尚生物有限公司進行雙向測序，在本研究中，除用引物 DF1、DR2由2端向中部測序外，還根據所得序列再設計1對引物（F： 5′-GCGGATTCTCCGTAGACAAC-3′，R： 5′-GTAAAATTGTCTGGGTCTCC-3′）由序列中部向2端進行測序，以提高測序的準確性。endprint

1.3 數據分析

序列用Clustal W1.83軟件[6]分析比對；利用DnaSP（version 4.0）軟件[7]統(tǒng)計單倍型及變異位點（S），計算單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（π）及平均核苷酸差異數（K）。采用MEGA（version 4.0）軟件[8]中的Kimura 雙參數法計算各單倍型間的遺傳距離；采用鄰接（Neighbor-Joining，簡稱NJ）法，Bootstrap置信值估算重復1 000次，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

利用Ariequin3.11軟件[9]計算兩兩群體間的分化指數（Fst），進行分子變異分析（analysis of molecular variance，簡稱AMOVA）。利用DnaSP5.10軟件[10]、Arlequin3.11軟件分別進行核甘酸不配對分析和Fus Fs中性檢驗，來推斷4個刀鱭群體、1個短頜鱭群體在進化過程中是否經歷過種群擴張。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果及序列特征分析

所有刀鱭、短頜鱭的D-loop片段均能被清晰穩(wěn)定地擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示為1條清晰明亮的條帶，大小為1 300 bp左右。雙向測序后的序列經過拼接，獲得1 210～1 293 bp的控制區(qū)全序列，其中長度為1 252 bp的序列最多，有41條，占74.505%。刀鱭的D-loop序列長 1 212～1 293 bp，短頜鱭的序列長1 210～1 252 bp，在刀鱭和短頜鱭控制區(qū)序列中發(fā)現了3～7個拷貝不等的38 bp的重復片段，此外還存在1～3 bp小片段的插入或缺失。

序列分析結果（表1）表明，在4個刀鱭群體、1個短頜鱭群體 D-loop區(qū)段基因片段中，A、T、G、C堿基占比分別為332%、33.2%、19.3%、14.3%。其中，A+T堿基組成比例為664%，大于C+G的組成比例33.6%。從表1可以看出，D-loop表現出很強的堿基組成偏向性，即在 A、C、G、T這4種堿基中，C的組成比例明顯低于其他3種堿基。

2.2 群體遺傳多樣性和遺傳差異性的分析

通過序列比對，在5個群體 55尾個體中，共檢測到變異位點（S）72個（圖1），其中單一多態(tài)位點50個，簡約信息位點22個。本研究中共檢測到45種不同的單倍型，每種單倍型對應的樣本數為1～5個不等，長江口刀鱭、鄱陽湖湖口刀鱭、鄱陽湖刀鱭、鄱陽湖刀鱭幼魚、鄱陽湖短頜鱭群體中單倍型的分布數量分別為13、9、13、9、7種。

由表2可以看出，在所有45種單倍型中，僅有Hap9、Hap14、Hap22、Hap35、Hap37、Hap43在2個及2個以上的個體中存在，其他39種單倍型僅在1個個體中存在，Hap9含有最多的5個個體。Hap9在長江口刀鱭、鄱陽湖湖口刀鱭、鄱陽湖刀鱭群體中同時出現，Hap14同時出現在長江口刀鱭、鄱陽湖刀鱭幼魚群體中，Hap22同時出現在鄱陽湖湖口刀鱭和鄱陽湖刀鱭群體中，Hap35同時出現在長江口刀鱭和鄱陽湖湖口刀鱭群體中，Hap37同時出現在鄱陽湖刀鱭和鄱陽湖刀鱭幼魚群體中。在45種單倍型中，長江口刀鱭群體獨有單倍型有10個（Hap1、Hap3、Hap10、Hap20、Hap21、Hap23、Hap26、Hap27、Hap28、Hap30），鄱陽湖湖口刀鱭群體獨有的有6個（Hap5、Hap6、Hap15、Hap16、Hap19、Hap 24），鄱陽湖刀鱭群體獨有的有8個（Hap2、Hap4、Hap17、Hap18、Hap25、Hap29、Hap31、Hap33、Hap34），鄱陽湖刀鱭幼魚獨有單倍型7個（Hap7、Hap8、Hap11、Hap12、Hap13、Hap32、Hap36），鄱陽湖短頜鱭群體的單倍型均為獨有的（Hap38～Hap45）。由此看出，各群體間擁有非常少的共享單倍型，獨有的單倍型在群體內占有量非常豐富，而豐富的獨有單倍型的存在說明長江口刀鱭、鄱陽湖湖口刀鱭、鄱陽湖刀鱭、鄱陽湖刀鱭幼魚及鄱陽湖短頜鱭群體間存在一定程度的分化。

群體內的遺傳多樣性可以通過單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數等數據來體現。由表3可見，55個個體的單倍型多態(tài)性（H）為 0.989±0.007；核苷酸多樣性（π）為0.009 1，平均核苷酸差異數（K）為10.079。根據單倍型多樣性、核苷酸多樣性和平均核苷酸差異數等數據的大小可以看出，在4個刀鱭群體和1個短頜鱭群體中，遺傳多樣性豐富程度排序為鄱陽湖刀鱭幼魚>鄱陽湖湖口刀鱭>鄱陽湖短頜鱭>鄱陽湖刀鱭>長江口刀鱭。

經計算，各單倍型間的遺傳距離在 0.014～0728，平均遺傳距離為0.188。

2.3 群體間遺傳分化與分子系統(tǒng)樹

根據鄰接法構建的單倍型間系統(tǒng)進化樹顯示：來源于鄱陽湖湖區(qū)短頜鱭樣本的7種單倍型明顯單獨成為1系。與其他群體單倍型具有顯著的分化（圖2）。另外，采集自長江口刀鱭、鄱陽湖湖口刀鱭、鄱陽湖湖區(qū)刀鱭及鄱陽湖湖區(qū)刀鱭幼魚樣本的38種單倍型聚為1支。

從表4可看出，刀鱭群體之間的遺傳分化指數較低，而短頜鱭群體（DH）與刀鱭群體之間存在相對較高的分化指數（0.039 9～0.052 34）。

對刀鱭、短頜鱭群體的AMOVA分析結果顯示，將4個刀鱭群體分為1組（group 1：CD、HD、RD、DY），短頜鱭群體分為1組（group 2：DH）。在組間變異、組內群體間變異、群體內變異3個水平上進行分子變異方差分析，表5顯示，6561%變異發(fā)生在群體內部。對不同種類分組上的AMOVA分析表明，群體間、組內變異分別占總變異的6071%、39.53%（P<0.001）。

2.4 種群歷史動態(tài)

利用Ailequin 3.11軟件對刀鱭、短頜鱭群體進行Tajimas D、Fu and Lis中性檢驗。表3結果表明：所有群體Tajimas D均為負值（-1.541 59～-0.317 70），但未達到顯著水平。Fu and Lis在所有種群中均為負值（-1.654 44～-0.021 03），未達到顯著水平。Tajimas D、Fu and Lis檢驗結果均表明，歷史上刀鱭、短頜鱭未經歷種群擴張。endprint

對刀鱭4個群體D-loop序列的錯配分析發(fā)現，堿基歧點分布的期望值呈典型的多峰分布，說明長江流域刀鱭種群歷史上未經歷種群擴張（圖3）。4個群體的Raggedness統(tǒng)計量（Rg）為0.45～0.80，均未達到顯著水平，進一步支持刀鱭和短頜鱭種群未經歷過種群擴張，觀測分布和期望分布之間的偏離總方差（SSD）在4個刀鱭群體和1個短頜鱭群體中均未達到顯著水平（表6），提示刀鱭和短頜鱭種群未經歷過擴張時期。

3 討論

3.1 刀鱭和短頜鱭種群控制區(qū)序列的堿基組成

所測定的46尾刀鱭mtDNA D-loop區(qū)序列中，堿基A、T、G、C的平均含量分別為 33.2%、33.2%、19.3%、14.3%；9尾短頜鱭mtDNA D-loop區(qū)序列的堿基A、T、G、C的平均含量分別為33.1%、33.1%、19.5%、14.2%；從刀鱭、短頜鱭堿基組成可以看出，D-loop區(qū)段表現出很強的堿基組成偏向性，即在A、T、G、C4種堿基中，C的含量明顯低于其他3 種堿基的含量；此外，刀鱭和短頜鱭mtDNA D-loop區(qū)中A+T堿基的含量（66.4%、66.2%）高于G+C堿基含量（33.6%、338%），符合脊椎動物mtDNA D-loop區(qū)堿基組成的特點[11]。

線粒體控制區(qū)（D-loop）為非編碼區(qū)，受進化壓力較小，在D-loop處可見較高的突變積累而形成多態(tài)性[12]。核苷酸替換和長度變異在該處很常見[13-15]。在本研究中，發(fā)現刀鱭和短頜鱭控制區(qū)序列中存在38 bp的重復片段，拷貝數從 3～7個不等，此外還存在1～3 bp小片段的插入或缺失。

3.2 遺傳變異及遺傳多樣性

本試驗中測定的刀鱭、短頜鱭5個群體的D-loop序列中共檢測出72個變異位點，占全部序列的5.75%，共定義了45個單倍型，顯示出較為豐富的遺傳多樣性，與程起群等的研究結果一致[16-18]。從D-loop區(qū)序列變異得到的NJ系統(tǒng)進化樹可以看出，來源于鄱陽湖的短頜鱭形成1個單系，顯示與其他群體單倍型具有一定的分化，另外，采自長江口，鄱陽湖湖口和鄱陽湖湖區(qū)樣本的38個單倍型聚為1支，刀鱭群體沒有明顯的地理分化格局。

群體間的遺傳分化指數用來表示群體間的遺傳分化程度，Fst值越大，表明2個群體間的分化程度越高；反之，分化程度越低[19]。群體間的遺傳分化指數、K2-P遺傳距離以及AMOVA分子變異分析均表明，長江流域4個刀鱭群體間存在著廣泛的基因交流，沒有形成明顯的遺傳分化，仍是個隨機交配的群體。鄱陽湖為通江湖泊，每年4—6月，長江流域刀鱭洄游至鄱陽湖產卵，由于不同地理種群的刀鱭可能會進入同一地點或相對較近的區(qū)域產卵和受精，因此增加了群體外

交配的可能性，同時，這種繁殖方式增加了長江流域刀鱭各群體之間的基因交流機會， 由此導致長江流域刀鱭群體之間的遺傳分化程度相對較低，而群體內個體之間的遺傳變異較大。短頜鱭與刀鱭存在一定的遺傳分化，唐文喬等過對mtDNA的D-loop區(qū)進行分析指出，短頜鱭和湖鱭是刀鱭的淡水生態(tài)型種群，并非有效種[5]。許志強等綜合分析刀鱭和短頜鱭的頜骨長度和線粒體Cytb序列，得出短頜鱭屬于刀鱭的1個淡水生態(tài)型種群而并非獨立物種的結論[20]。本研究通過對長江口刀鱭、鄱陽湖湖口刀鱭、鄱陽湖刀鱭、鄱陽湖刀鱭幼魚以及鄱陽湖短頜鱭5個群體的遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育樹研究也表明，鄱陽湖的刀鱭和短頜鱭共同構成1個單系群，為2種生態(tài)型種群，尚未達到種或亞種的分化。

參考文獻：

[1]袁傳宓，秦安黔，劉仁華，等. 關于長江中下游及東南沿海各省的鱭屬魚類種下分類的探討[J]. 南京大學學報（自然科學版），1980（3）：67-82.

[2]江西省農業(yè)局水產資源調查隊，江西省水產科學研究所.鄱陽湖水產資源調查報告[R]. 1974.

[3]長江流域刀鱭資源調查協(xié)作組.長江流域刀鱭資源調查報告[R]. 1977.

[4]張敏瑩，徐東坡，劉 凱，等. 長江下游刀鱭生物學及最大持續(xù)產量研究[J]. 長江流域資源與環(huán)境，2005，14（6）：694-698.

[5]唐文喬，胡雪蓮，楊金權. 從線粒體控制區(qū)全序列變異看短頜鱭和湖鱭的物種有效性[J]. 生物多樣性，2007，15（3）：224-231.

[6]Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al. The CLUSTAL_X Windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research，1997，25（24）：4876-4882.

[7]Rozas J，Sánchez-Delbarrio J C，Messeguer X，et al. DnaSP，DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods[J]. Bioinformatics，2003，19（18）：2496-2497.

[8]Tamura K，Dudley J，Nei M and Kumar S. MEGA4：Molecular Evolutionary Genetics Analysis （MEGA） software version 4.0[J]. Mol Biol Evol，2007，24（8）：1596-1599.

[9]Excoffier L，Laval G，Schneider S. Arlequin （version 3.0）：an integrated software package for population genetics data analysis[J]. Evolutionary Bioinformatics Online，2005，1（4A）：47-50.endprint

[10]Librado P，Rozas J. DnaSP v5：a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics，2009，25（11）：1451-1452.

[11]Broughton R E，Milam J E，Roe B A. The complete sequence of the zebrafish （Danio rerio） mitochondrial genome and evolutionary patterns in vertebrate mitochondrial DNA[J]. Genome Research，2001，11（11）：1958-1967.

[12]謝振宇，杜繼曾，陳學群，等. 線粒體控制區(qū)在魚類種內遺傳分化中的意義[J]. 遺傳，2006，28（3）：362-368.

[13]Harrison R G. Animal mitochondrial DNA as a genetic marker in population and evolutionary biology[J]. Trends in Ecology & Evolution，1989，4（1）：6-11.

[14]Billington N，Hebert P D N. Mitochondrail DNA diversity in fishes and its implications for introduetions[J]. Can J Fish Aquat Sci，1991，48（S1）：80-94.

[15]Rand D M. Endotherms，ectotherms，and mitochondrial genome-size variation[J]. Journal of Molecular Evolution，1993，37（3）：281-295.

[16]程起群，溫俊娥，王云龍，等. 刀鱭與湖鱭線粒體細胞色素b基因片段多態(tài)性及遺傳關系[J]. 湖泊科學，2006，18（4）：425-430.

[17]葛家春，曹 廷，陳嬋娟，等. 利用擴增片斷長度多態(tài)性技術分析長江刀鱭的遺傳多樣性[J]. 南京大學學報（自然科學），2008，14（3）：332-338.

[18]馬春艷，劉 敏，馬凌波，等. 長江口刀鱭遺傳多樣性的隨機擴增多態(tài)DNA（RAPD）分析[J]. 海洋水產研究，2004，25（5）：19-24.

[19]楊金權，胡雪蓮，唐文喬. 長江及其南部鄰近水域刀鱭的種群遺傳結構及種群歷史[J]. 上海水產大學學報，2008，17（5）：513-519.

[20]許志強，葛家春，黃 成，等. 基于頜骨長度和線粒體Cytb序列變異探討短頜鱭的分類地位[J]. 大連水產學院學報，2009，24（3）：242-246.endprint