朱秀云+徐鹿+王志強+陳耕+李進步+張亞楠

摘要：氣味結(jié)合蛋白（odorant binding protein，簡稱OBP）能結(jié)合進入到觸角內(nèi)的脂溶性氣味物質(zhì)進行并運送到感受神經(jīng)元受體部位，被認為是昆蟲嗅覺的第1個生化步驟，其中性信息素結(jié)合蛋白（pheromone binding protein，簡稱PBP）屬于OBP家族。利用cDNA末端快速擴增技術(shù)（rapid-amplification of cDNA ends，簡稱RACE）在已有報道桃蛀螟CpunPBP2片段的基礎(chǔ)上，設(shè)計特異性擴增引物獲得該基因的全長cDNA序列。序列分析表明，CpunPBP2基因具有昆蟲OBP典型特征，即6個保守的半胱氨酸位點和信號肽序列。同源比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CpunPBP2的氨基酸序列與其他鱗翅目昆蟲PBP2均具有較高的相似性。進一步進化分析結(jié)果表明，CpunPBP2能聚在鱗翅目昆蟲PBP/GOBP超家族內(nèi)。本研究結(jié)果為進一步分析桃蛀螟PBP2的生理功能奠定了分子基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：桃蛀螟；基因；氣味結(jié)合蛋白；性信息素結(jié)合蛋白；cDNA末端快速擴增技術(shù)；全長克隆；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號： S433.4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0050-04

昆蟲作為歷史上最長的動物類群之一，長期進化使它們形成了以觸角為主的發(fā)達的嗅覺感受系統(tǒng)，借此識別環(huán)境中大量的化學信息作出準確判斷，并產(chǎn)生一系列生理和行為反應(yīng)，如尋找棲息、產(chǎn)卵場所等[1]。自1981年Vogt等用標記性信息素方法發(fā)現(xiàn)了第1個昆蟲氣味結(jié)合蛋白（OBP）——多音大蠶蛾雄蛾（Antheraea polyphemus）觸角中的性信息素結(jié)合蛋白（pheromone binding protein，簡稱PBP）[2]以來，隨著基因組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)快速發(fā)展及成本大幅度降低，已在不同昆蟲中發(fā)現(xiàn)有超過400個OBP，它們分屬于不同的目和科[3]。

根據(jù)保守半胱氨酸的數(shù)量以及氨基酸序列，昆蟲OBP可分為4類：（1）經(jīng)典OBP（classic OBP），特征為6個保守的半胱氨酸結(jié)構(gòu)，鱗翅目昆蟲的性信息素結(jié)合蛋白、普通氣味結(jié)合蛋白（general odorant binding protein，簡稱GOBP）以及觸角結(jié)合蛋白（antennal binding protein，簡稱ABP）均屬于此類；（2）多C OBP（plus-C OBP），特征為超過6個以上的保守半胱氨酸結(jié)構(gòu)，還常會在保守位置具有一個脯氨酸；（3）少C OBP（minus-C OBP），特征為少于6個半胱氨酸結(jié)構(gòu)，僅在4個保守位置處有半胱氨酸；（4）典型OBP（atypical OBP），特征為擁有一段較長的C端序列[4-6]。在鱗翅目昆蟲中，OBP的保守性較高，分類清晰，可以明顯地分為3類：性信息素結(jié)合蛋白（PBP）、普通氣味結(jié)合蛋白、觸角特異性蛋白（antennal specific protein，簡稱ASP）或觸角結(jié)合蛋白。鱗翅目雄蛾的觸角高表達或?qū)Ｒ槐磉_PBP，且PBP可以結(jié)合由雌蟲釋放的性信息素[7-8]。但雌雄觸角感器均有表達的PBP并不一定是對性信息素特異結(jié)合的，也能結(jié)合其他非性信息素物質(zhì)[9-10]。

桃蛀螟[Conogethes punctiferalis（Guenée）]別稱桃斑螟、桃蛀心蟲、桃蛀野螟，隸屬于鱗翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyralidae）。桃蛀螟食性雜、分布廣，其幼蟲可危害板栗、桃、李、杏、玉米、蓖麻、向日葵等40多種果樹、油料和糧食作物。近年來，陸續(xù)有報道發(fā)現(xiàn)，桃蛀螟在我國的長江流域、中部和北部地區(qū)對梨、板栗、向日葵、高粱、玉米的產(chǎn)量造成了重大危害[11-12]。桃蛀螟在幼蟲期取食的部位以致于傳統(tǒng)的化學農(nóng)藥很難對它們產(chǎn)生直接有效的作用。桃蛀螟性引誘劑的開發(fā)已成功應(yīng)用于種群的預(yù)測預(yù)報，但直接用于害蟲防治，同該技術(shù)應(yīng)用于其他重要蛾類害蟲的情況相似，無論是用交配干擾法還是大量誘捕法，都存在成本偏高、效果不理想等問題。況且現(xiàn)在使用的化學農(nóng)藥不僅僅會使害蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性，而且還會大大加劇環(huán)境污染和對非靶標生物的殺傷作用[13]。因此，生產(chǎn)上亟須更為高效的行為調(diào)控技術(shù)來防治這類害蟲。桃蛀螟性信息素所含有的2種主要醛類組分（Z10-16：Ald、E10-16：Ald）在化學結(jié)構(gòu)上也與其他螟蛾科害蟲相同或相似。另外，桃蛀螟所危害的果樹和農(nóng)作物同樣也是鱗翅目其他科害蟲的取食對象，因此以桃蛀螟為研究材料的研究成果，也將對其他昆蟲的相關(guān)研究具有很好的借鑒意義和應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

于2014年7—9月利用燈誘的方式，在淮北師范大學相山校區(qū)校園內(nèi)采集試蟲。隨后將收取的成蟲（約60頭）觸角按照雌雄1 ∶ 1的比例放于-80 ℃冰箱備用。

1.2 總RNA提取及RACE-cDNA的合成

總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司，并按操作說明書進行提取。5′/3′ -RACE-ready cDNA模板合成使用SMARTTM RACE cDNA Amplication Kit（634925，TaKaRa & Clontech），并存放于-20 ℃冰箱中。

1.3 PCR引物設(shè)計、反應(yīng)體系及程序

1.3.1 PCR引物設(shè)計 按照SMARTerTM PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒使用說明中關(guān)于引物設(shè)計的要求，利用Premier 5.0軟件設(shè)計RACE引物（gene specific primer，簡稱GSP）（表1）。

1.3.2 PCR反應(yīng)體系及程序 利用特異引物（表1）和RACE分別擴增桃蛀螟PBP2基因的5′、3′序列，所采用的RACE-PCR條件按照操作試劑盒（SMART Kit，TaKaRa）說明書進行。

1.4 PCR產(chǎn)物純化、克隆、測序和序列分析endprint

PCR產(chǎn)物純化：采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（Axygen）對PCR產(chǎn)物進行回收純化，操作按照試劑盒說明書進行。

連接反應(yīng)：經(jīng)膠回收后的PCR擴增產(chǎn)物連接于pEASY-T3載體上（全式金生物，北京），操作按照試劑盒說明書進行。

轉(zhuǎn)化反應(yīng)：上步連接成功的載體和目的基因轉(zhuǎn)化至 Trans-T1感受態(tài)細胞（全式金生物，北京）中，操作按照試劑盒說明書進行。

1.5 序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過GeneDoc軟件進行序列比對分析，并利用NCBI-Blast（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）及與NCBI-GenBank已經(jīng)登錄的基因序列進行同源搜索比對，信號肽預(yù)測由網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器SignalP V4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）完成，蛋白分子量和等電點由http：//www.expasy.org/網(wǎng)站預(yù)測，雙螺旋結(jié)構(gòu)和3D同源建模由http：//espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi、http：//swissmodel.expasy.org預(yù)測分析。

利用ClustalW 2.0及Mega 6.0采用鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（抽樣分析為1 000次），對桃蛀螟等昆蟲的PBP基因進行系統(tǒng)分析，選用的其他昆蟲序列參考[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 全長克隆與分析

在原有CpunPBP2片段的基礎(chǔ)上[15]，設(shè)計特異引物并利用RACE-PCR擴增出300 bp左右的條帶（圖1），與預(yù)測大小相符。純化后的PCR產(chǎn)物克隆到pEASY-T3 easy載體中，隨后經(jīng)菌液PCR擴增出500 bp左右條帶（圖2），選取5個陽性克隆進行測序。通過分析5′、3′RACE的測序結(jié)果，得到開放閱讀框為513 bp，編碼170個氨基酸的CpunPBP2序列（圖3）。經(jīng)軟件預(yù)測，CpunPBP2的N-端最初25個氨基酸為信號肽（圖4），成熟蛋白的分子量為16.51 ku，等電點為4.93。

2.2 序列同源分析

利用NCBI-BLAST網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）及NCBI-GenBank序列庫中已登錄序列進行家族預(yù)測分析，結(jié)果（圖5）表明，CpunPBP2基因?qū)儆诶ハx PBP-GOBP超家族。

將CpunPBP2 cDNA所推導的氨基酸序列，與已知其他鱗翅目昆蟲PBP2進行同源比對分析（圖6），結(jié)果表明，CpunPBP2的氨基酸序列與其他昆蟲PBP2均（MsexPBP2、SinfPBP2、SexigPBP2、HvirPBP2）具有較高的相似性，分別為62%、69%、67%、62%。從圖6還可看出，CpunPBP2具有典型的昆蟲OBP結(jié)構(gòu)：6個保守的半光氨酸位點，且第2個和第3個半胱氨酸間隔3個氨基酸、 第5個和第 6 個半胱氨酸間隔8個氨基酸[16]。利用CpunPBP2同已有的家蠶BmorPBP晶體結(jié)構(gòu)的同源預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CpunPBP2同BmorPBP類似，即含有6個α-螺旋和1個額外α-螺旋（圖7），這些螺旋機構(gòu)可能會參與到桃蛀螟性信息素的識別過程中。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

選取已報道的鱗翅目蛾類昆蟲：家蠶（Bombyx mori）、大螟（Sesamia inferens）、海灰翅夜蛾（Spodoptera littoralis）和煙草天蛾（Manduca sexta）[17-18]與桃蛀螟的PBP2進行進化樹構(gòu)建，結(jié)果表明，CpunPBP2能聚在鱗翅目昆蟲PBP/GOBP超家族內(nèi)（圖8）。

3 結(jié)論與討論

本研究基于桃蛀螟CpunPBP2的片段信息，利用RACE技術(shù)成功克隆該基因的全長cDNA序列。通過序列分析比對發(fā)現(xiàn)，CpunPBP2具有OBP基因的典型序列特征，即分子量約15～17 ku、N末端具1條20個氨基酸左右的信號肽、序列中具有6個保守的半胱氨酸位點[19]，并且與其他昆蟲PBP表現(xiàn)出較高的相似性等。CpunPBP2基因全長序列的成功獲得，為進一步研究其生理功能以及篩選高效的桃蛀螟行為控制劑提供了基礎(chǔ)[20]。

另外，張亞楠對大螟所有鑒定到OBP的組織表達分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)OBP在觸角中高表達，并且半數(shù)左右的OBP在非觸角組織中（胸和腹部）也檢測到微弱的條帶，這其中就包括PBP和GOBP，這暗示昆蟲PBP和GOBP可能在大螟的嗅覺行為中起到重要的作用[21]。值得一提的是，該研究在大螟的幼蟲中也檢測到性信息素結(jié)合蛋白PBP1、PBP3的微弱表達信號，并且該結(jié)果與之前報道的?；页嵋苟辏⊿. littoralis）幼蟲類似，Poivet等的解釋是海灰翅夜蛾幼蟲中的PBP能感受吸附在或是雌蛾產(chǎn)卵時殘留在綠葉上的性信息素，所以可利用這種行為幫助幼蟲尋找食物[22]。這些研究表明，鱗翅目昆蟲PBP功能可能不僅僅只在成蟲感受性信息素途徑中起到作用，可能在幼蟲取食或其他的生理活動中擔當重要的角色。

結(jié)果表明，蛾類昆蟲PBP具有以下典型特征：（1）同科雄蛾觸角中具有多個PBP基因和雌蛾腺體中具有多種性信息素組分，且大部分物種性信息素的數(shù)量多于PBP的數(shù)量；（2）同一PBP在雌雄觸角間差異表達，不同PBP在雌蟲或雄蟲觸角中差異表達；（3）PBP在觸角感器分布具有多樣性，而對CpunPBP2同其他昆蟲PBP的進化分析結(jié)果表明，該基因?qū)儆诶ハxPBP超家族，因此CpunPBP2很有可能也具有以上特征。

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