蓋江濤+黃建峰+黨志國(guó)+朱敏+陳華蕊+王鵬+陳業(yè)淵

摘要：花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS，EC：1.14.11.19）是花青素合成中的一個(gè)關(guān)鍵酶。為了鑒定和分析芒果ANS基因，以芒果ANS基因作為研究目標(biāo)，以擬南芥的ANS基因?yàn)閰⒖?，通過(guò)BLAST方法獲得了番木瓜、金錢(qián)橘、甜橙、蘋(píng)果、小果野蕉、桃子、葡萄、龍眼、甜櫻桃、棗、石榴、西洋梨、中華獼猴桃、荔枝、無(wú)油樟的ANS基因序列，對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析、理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)分析等。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，雙子葉植物與單子葉植物的ANS基因進(jìn)化樹(shù)沒(méi)有單獨(dú)形成分支，推測(cè)在進(jìn)化過(guò)程中ANS基因的分化在雙子葉植物和單子葉植物形成之后；理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，酸性蛋白占97.2%、穩(wěn)定性蛋白占13.9%，有導(dǎo)肽的蛋白占8.3%，所有蛋白均為無(wú)信號(hào)肽的親水性蛋白；蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲是主要結(jié)構(gòu)元件。說(shuō)明芒果ANS基因具有穩(wěn)定的花青素合成酶結(jié)構(gòu)，并與本試驗(yàn)中的絕大多數(shù)植物ANS基因具有相似的性質(zhì)。這為進(jìn)一步研究芒果ANS基因在花青素合成途徑中的作用提供了理論支持。

關(guān)鍵詞：芒果；花青素；花青素合成酶；系統(tǒng)進(jìn)化；同源性；蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

中圖分類(lèi)號(hào)： S667.701 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）20-0043-07

芒果（Mangifera indica Linnaeus）俗稱(chēng)芒果，是漆樹(shù)科（Anacardiaceae）芒果屬（Mangifera Linnaeus）的著名熱帶果樹(shù)，因其果肉細(xì)膩、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，且具有理氣、健脾、益胃、降低膽固醇、防治心血管疾病、預(yù)防乳腺癌等多種功效，深受人們歡迎[1]。芒果果實(shí)色澤作為人們挑選芒果的一個(gè)重要參考指標(biāo)，它的形成是一個(gè)非常復(fù)雜的代謝過(guò)程，主要與類(lèi)胡蘿卜素和花青素代謝途徑有關(guān)?；ㄇ嗨兀╝nthocyanin）又稱(chēng)花色素，是一類(lèi)決定顏色的重要的天然水溶性色素，屬于黃酮類(lèi)化合物，廣泛分布于多種植物組織中，是形成植物花、果實(shí)等組織顏色的主要色素[2]?；ㄇ嗨氐暮吭跊Q定植物的花色、葉色、果色和其他經(jīng)濟(jì)器官的色澤及其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)方面起著重要作用，還可以起到吸引昆蟲(chóng)和植食性動(dòng)物以達(dá)到傳播花粉和種子的目的[3-4]。

花青素合成酶（無(wú)色花色素雙加氧酶，anthocyanidin synthase，ANS/leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX，EC：114.11.19）是花青素合成途徑末端的一個(gè)關(guān)鍵酶，通過(guò)Fe2+和 2-酮戊二酸離子將無(wú)色花青素氧化生成花青素，屬于雙加氧酶家族[5]。因此，可通過(guò)上調(diào)或抑制ANS基因的表達(dá)來(lái)改變花青素的含量或成分，從而引起植物花色的變化。ANS （LDOX）最初是從玉米的A2突變體中克隆得到[6]。目前，ANS基因已在擬南芥[7]、荔枝[8]、芒果[9]、龍眼[10]、葡萄[11]、蘋(píng)果[12]、越橘[13]、茶樹(shù)[14]、棕色棉[15]等多種植物中克隆。

ANS基因的表達(dá)水平與花青素累積之間的關(guān)系也在多種植物中被研究。游向榮等研究結(jié)果表明，龍眼芽軸顏色和ANS基因的表達(dá)差異有關(guān)[10]。龍眼正常成花的頂芽芽軸萌動(dòng)時(shí)，芽軸顏色變紅，ANS基因正常表達(dá)；而發(fā)生成花逆轉(zhuǎn)時(shí)，芽軸顏色保持淺黃色，ANS基因下調(diào)表達(dá)。Honda等在蘋(píng)果中發(fā)現(xiàn)，5個(gè)花青素合成相關(guān)基因在果皮著色過(guò)程中協(xié)同表達(dá)，并且其表達(dá)水平和花青素含量呈正相關(guān)[16]。Salvatierra等研究表明，在草莓果實(shí)成熟過(guò)程中，花青素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯增加，并且其在紅色果實(shí)中的表達(dá)水平明顯高于白色果實(shí)[17]。Li等研究發(fā)現(xiàn)，ANS基因表達(dá)活性上調(diào)，使得桑樹(shù)的果實(shí)變?yōu)榧t色[18]。李曉艷等研究發(fā)現(xiàn)，越橘?gòu)拈_(kāi)花到果實(shí)成熟的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中都能檢測(cè)到ANS基因的表達(dá)，在成熟果的果皮中，ANS基因的表達(dá)量最高；而花色素苷的含量隨著果實(shí)的成熟而增高，在越橘成熟果的果皮中，花色素苷的含量最高，與ANS基因表達(dá)量的變化一致[13]。研究說(shuō)明，ANS基因在越橘果實(shí)花色素苷形成過(guò)程中可能起到調(diào)控作用，并具有一定的組織特異性。

本試驗(yàn)以芒果ANS基因作為研究目標(biāo)，以已知ANS基因功能的雙子葉植物綱（Dicotyledoneae）十字花科（Brassicaceae）擬南芥[Arabidopsis thaliana （Linnaeus） Heynhold]的ANS基因?yàn)閰⒖迹劳腥蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)BLAST的方法獲得了雙子葉植物（Dicotyledons）番木瓜科（Caricaceae）番木瓜（Carica papaya Linnaeus），蕓香科（Rutaceae）金錢(qián)橘（Citrus clementina Hortulanorum ex Tanaka）、甜橙[Citrus sinensis = C. ×sinensis （Linnaeus） Osbeck]，薔薇科（Rosaceae）蘋(píng)果（Malus domestica Borkhausen=Malus pumila Miller）、桃子[Prunus persica （Linnaeus） Batsch= Amygdalus persica Linnaeus]、甜櫻桃[Prunus avium （Linnaeus） Linnaeus = Cerasus avium （Linnaeus） Moench]、西洋梨（Pyrus communis Linnaeus），葡萄科（Vitaceae）葡萄（Vitis vinifera Linnaeus），鼠李科（Rhamnaceae）棗（Ziziphus jujuba Miller），石榴科（Punicaceae）石榴（Punica granatum Linnaeus），獼猴桃科（Actinidiaceae）中華獼猴桃（Actinidia chinensis Planchon），漆樹(shù)科芒果，無(wú)患子科（Sapindaceae）龍眼（Dimocarpus longan Loureiro）、荔枝（Litchi chinensis Sonnerat），無(wú)油樟科（Amborellaceae）無(wú)油樟（Amborella trichopoda Baillon），單子葉植物（Monocotyledons）芭蕉科（Musaceae）小果野蕉（Musa acuminata Colla）的ANS基因序列，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析、理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)分析等分析這17種植物ANS基因序列，比較果樹(shù)中ANS基因的特性，為分析ANS基因在芒果中的表達(dá)特性及其在花青素合成途徑中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為推動(dòng)芒果ANS基因功能研究提供理論支持。endprint

1 材料與方法

1.1 同源性搜索和數(shù)據(jù)提取

從NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和phytozome V9.1[19]（http：//www.phytozome.net）中搜索得到擬南芥含有花青素合成酶結(jié)構(gòu)域（pfam：cl21496、pfam：cl21672）的序列；從趙志常等文章中獲得芒果ANS蛋白序列[9]。將得到的序列合并，刪除重復(fù)序列。以得到的無(wú)重復(fù)序列集作為探針，通過(guò)BLASTP進(jìn)行同源性搜索，為了防止錯(cuò)誤丟失與探針相似度低但含有花青素合成酶結(jié)構(gòu)域的序列，搜索的E值設(shè)為10，對(duì)應(yīng)的檢索閾值為Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)提供的“cut-off ”值。從Kiwifruit Genome Database[20] （http：//bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/download.cgi）中搜索得到中華獼猴桃ANS基因序列，從趙志常等文章中獲得荔枝ANS蛋白序列[8]。合并檢索得到的所有序列，刪除冗余序列和結(jié)構(gòu)域較短的序列，得到芒果、擬南芥、番木瓜、金錢(qián)橘、甜橙、蘋(píng)果、桃子、甜櫻桃、西洋梨、葡萄、棗、石榴、中華獼猴桃、龍眼、荔枝、小果野蕉、無(wú)油樟的ANS蛋白序列，共36條序列，均含有完整的花青素合成酶結(jié)構(gòu)域。

1.2 多序列比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育分析及物種進(jìn)化分析

通過(guò)MEGA 6.0[21]軟件中的MUSCLE[22]工具進(jìn)行蛋白質(zhì)的多序列比對(duì)，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。將比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入Gblocks[23-24]在線(xiàn)服務(wù)器中，選擇保守區(qū)域進(jìn)行后續(xù)研究，為了獲得更多保守區(qū)域位點(diǎn)，選中3個(gè)較為寬松的選項(xiàng)（option for a less stringent selection）。調(diào)整后的序列使用MrBayes 322[25]進(jìn)行基于貝葉斯法的系統(tǒng)發(fā)育分析，共進(jìn)行2次獨(dú)立運(yùn)算，每次運(yùn)行設(shè)置2 000 000代，且每次運(yùn)算使用4條蒙特卡洛-馬爾科夫鏈（Markov chain Monte Carlo，MCMC）進(jìn)行隨機(jī)取樣，冷鏈溫度設(shè)置為0.1，在取樣中每1 000代保存1棵樹(shù)，共保存2 000棵樹(shù)。前20的樹(shù)作為burn-in舍棄，其余80的樹(shù)用來(lái)構(gòu)建貝葉斯一致樹(shù)和后驗(yàn)概率。生成的貝葉斯一致樹(shù)保存為nexus格式，并在Figtree v1.4.0軟件中進(jìn)行編輯。物種系統(tǒng)進(jìn)化分析通過(guò)在線(xiàn)工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/CommonTree/wwwcmt.cgi）完成。

1.3 蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

利用CD search （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）[26]進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，采用ProtParam tool （http：//web.expasy.org/protparam/）[27]在線(xiàn)工具預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，應(yīng)用TMpred程序（http：//www.ch.embnet.org/software/TMpred-form.html）[28]在線(xiàn)分析來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向。用TargetP 1.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）[29]在線(xiàn)預(yù)測(cè)氨基酸序列導(dǎo)肽，應(yīng)用signalP 4.1 server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）[30]中完成蛋白質(zhì)信號(hào)肽的預(yù)測(cè)。亞細(xì)胞定位應(yīng)用Cell-PLoc 2.0 package軟件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）[31]進(jìn)行在線(xiàn)分析。二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析用SOPMA （http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）[32]完成。利用NetPhos 2.0 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）[33]分析編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)。

1.4 擬南芥ANS基因生育期芯片數(shù)據(jù)表達(dá)模式的分析

從Plant Expression Database （http：//www.plexdb.org/）[34]的數(shù)據(jù)庫(kù)中下載擬南芥的RMA文件，提取擬南芥的5條ANS基因AT4G22880.1、AT4G16330.2、AT5G05600.1、AT2G38240.1、AT3G11180.2分別在各生育期組織[下胚軸（7 d）、子葉（7 d）、幼葉（10 d）、成熟葉（17 d）、老葉（35 d）、葉柄（17 d）、種子（8周）、根（7 d）、根（15 d）、根（21 d）、芽（7 d）、莖尖（14 d）、花萼（>21 d）、花瓣（>21 d）、雄蕊（>21 d）、雌蕊（>21 d）、花粉（6周）、花梗（>21 d）]的表達(dá)情況，結(jié)果用gplots軟件包中的heatmap.2軟件繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果與其他16種植物ANS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

利用CD search對(duì)36條ANS氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示所有的ANS蛋白序列包含1個(gè)DIOX-N[35]（non-haem dioxygenase in morphine synthesis N-terminal，嗎啡合成N-端的非血紅素加氧酶）亞家族結(jié)構(gòu)域和1個(gè)2OG-FeII_Oxy[36]（2-oxoglutarate Fe（II） oxygenase，2-酮戊二酸-Fe2+氧化酶）亞家族結(jié)構(gòu)域，具有花色素合成酶家族特征多肽序列，ANS酶通過(guò)Fe2+和（2-oxoglutarate）離子將無(wú)色花青素氧化生成花青素，屬于雙加氧酶家族。芒果ANS蛋白序列的結(jié)構(gòu)域如圖1，與其他16種植物ANS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域一致。endprint

2.2 芒果與其他16種植物ANS蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析及ANS蛋白質(zhì)氨基酸基序分析

本試驗(yàn)得到的36條氨基酸序列中，包含擬南芥5條、番木瓜1條、金錢(qián)橘4條、甜橙4條、蘋(píng)果3條、小果野蕉4條、桃子3條、葡萄2條、龍眼1條、甜櫻桃1條、棗2條、石榴1條、西洋梨1條、中華獼猴桃1條、芒果1條、荔枝1條、無(wú)油樟1條。對(duì)36條氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，選自成一目、一科、一屬的孑遺植物無(wú)油樟為外類(lèi)群，結(jié)果（圖2-A）顯示，進(jìn)化樹(shù)分為3支，其中被選為外類(lèi)群的無(wú)油樟科無(wú)油樟的ANS基因?yàn)閱为?dú)一支，其余16種植物的ANS基因分為2支，雙子葉植物與單子葉植物的ANS基因進(jìn)化樹(shù)沒(méi)有單獨(dú)形成分支，而是互相摻雜在一起，推測(cè)在進(jìn)化過(guò)程中ANS基因的分化在雙子葉植物和單子葉植物形成之后。

通過(guò)MEME程序在ANS蛋白中識(shí)別出10個(gè)潛在的保守基序（圖2-B），不同的基序用不同顏色的方框表示。根據(jù)這10個(gè)基序的分布，可以將36條ANS蛋白分為與進(jìn)化結(jié)果相似的3個(gè)亞家族。由圖2-B可以看出，除Prupe|Prupe.3G183300.1外，都有Motif1基序；除Arath|AT4g16330.2與Ambtr|XP_006828895外，都有Motif10。在3個(gè)亞家族中，基序的排列順序都高度保守。第Ⅰ亞家族中基序的分布情況：（1）都有Motif6基序；（2）除Musac|GSMUA_Achr11T23830_001外，都有Motif7；（3）除Maldo|MDP0000156478外，都有Motif9；（4）除Arath|AT4G16330.2外，都有Motif8；（5）除Arath|AT4G16330.2、Prupe|Prupe.3G183300.1、Citcl|Ciclev10012063m、Citsi|orange1.1g018466m外，都有Motif3。第Ⅱ亞家族中分布情況：（1）除Musac|GSMUA_Achr5T04080_001外，都有Motif4；（2）除Zizju|XP_015896715、Arath|AT4G22880.1外，都有Motif2；（3）除Manin|ANS外，都有Motif5。在第Ⅲ亞家族中，Ambtr|XP_006828895基序的特征：（1）有絕大多數(shù)氨基酸都有的Motif1基序，卻沒(méi)有絕大多數(shù)氨基酸都有的Motif10；（2）有第Ⅰ亞家族的保守基序Motif8，有第Ⅱ亞家族的保守基序Motif2、Motif4。

2.3 芒果與其他16種植物ANS基因的物種進(jìn)化分析

將本試驗(yàn)中選定的17種植物做物種進(jìn)化分析，結(jié)果（圖3）顯示，雙子葉植物綱的植物聚為一大分支，單子葉植物綱的植物為一支，外類(lèi)群植物為一支。在本研究選取的15種果樹(shù)中，同是薔薇科的蘋(píng)果、西洋梨、桃子、甜櫻桃聚為一支，同是蕓香科金錢(qián)橘和甜橙聚為一支，同是無(wú)患子科的龍眼、荔枝聚為一支，說(shuō)明在物種進(jìn)化過(guò)程中，同綱植物親緣關(guān)系更近，不同綱的植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。同時(shí)，芒果處于金錢(qián)橘、甜橙與荔枝、龍眼之間，說(shuō)明在物種進(jìn)化過(guò)程中，芒果與金錢(qián)橘、甜橙、荔枝、龍眼的親緣關(guān)系更近，其次是番木瓜，而與蘋(píng)果、西洋梨、桃子、甜櫻桃、棗、葡萄、中華獼猴桃親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，與小果野蕉的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.4 芒果與其他16種植物ANS蛋白的理化性質(zhì)分析

對(duì)36條ANS氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果（表1）顯示，除Arath|AT2G38240.1為堿性蛋白（理論pI>7）外，其余蛋白均為酸性蛋白質(zhì)（理論pI<7），酸性蛋白質(zhì)占972%；根據(jù)Guruprasad方法[37]，除Arath|AT5G05600.1、Citcl|Ciclev10031811m、Maldo|MDP0000156478、Musac|GSMUA_Achr10T00230_001、Ambtr|XP_006828895為穩(wěn)定性蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)<40）外，其余蛋白均為不穩(wěn)定性蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)>40），穩(wěn)定性蛋白占13.9%；相對(duì)分子量除Maldo|MDP0000621569為52841.2外，其余位于36.21～46.16 ku；僅金錢(qián)橘Citcl|Ciclev10012063m與甜橙Citsi|NP_001275784、Citsi|orange1.1g018466m基因具有線(xiàn)粒體靶向肽M （mitochondrial targeting peptide，mTP），其余氨基酸序列均沒(méi)有導(dǎo)肽，有導(dǎo)肽的蛋白占8.3%；所有蛋白均為親水性蛋白（GRAVY<0）、無(wú)信號(hào)肽；所有基因亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中。說(shuō)明芒果與其他絕大多數(shù)植物ANS蛋白具有相似的性質(zhì)，為非分泌性蛋白，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行代謝活動(dòng)。

2.5 芒果ANS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈中有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象，限于主鏈原子的局部空間排列，不包括與肽鏈其他區(qū)段的相互關(guān)系及側(cè)鏈構(gòu)象。常見(jiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲4種形式，α-螺旋是蛋白質(zhì)中最常見(jiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。α-螺旋靠氫鍵維持穩(wěn)定，在DNA結(jié)合基序中有非常重要的作用；β-折疊是由伸展的肽鏈組成，通過(guò)位于同一個(gè)肽鏈或相鄰肽鏈的另一個(gè)酰胺氫和一個(gè)肽鍵的羰基氧之間的氫鍵維持；β-轉(zhuǎn)角連接蛋白質(zhì)分子中的二級(jí)結(jié)構(gòu)（α-螺旋和β-折疊），是肽鏈走向改變的一種非重復(fù)多肽區(qū)，蛋白質(zhì)的抗體識(shí)別、磷酸化、糖基化和羥基化位點(diǎn)經(jīng)常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)角；無(wú)規(guī)則卷曲主要指那些不能被歸入明確的二級(jí)結(jié)構(gòu)如折疊片或螺旋的多肽區(qū)段，也是明確而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，它們受側(cè)鏈相互作用的影響很大，經(jīng)常構(gòu)成酶活性部位和其他蛋白質(zhì)特異的功能部位。

應(yīng)用在線(xiàn)工具SOPMA預(yù)測(cè)17種植物的ANS氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)（表1），除Arath|AT5G05600.1、Arath|AT3G11180.2、Maldo|MDP0000621569、Maldo|MDP0000156478的主要結(jié)構(gòu)元件是無(wú)規(guī)則卷曲、β-折疊外，其余蛋白均以α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)元件。芒果ANS氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖4）顯示，α-螺旋是芒果ANS最大量的結(jié)構(gòu)元件，占43.3%；其余由31.91%的無(wú)規(guī)則卷曲、15.38%的β-折疊、9.4%的β-轉(zhuǎn)角組成。說(shuō)明芒果ANS與本試驗(yàn)中的絕大多數(shù)植物ANS蛋白一樣，具有穩(wěn)定的花青素合成酶結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步推斷芒果ANS基因可能在花青素代謝途徑中具有重要作用。endprint

2.6 芒果ANS蛋白的磷酸化位點(diǎn)分析

蛋白磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的基本機(jī)制，一般發(fā)生在翻譯后修飾；由于氨基酸側(cè)鏈加入了1個(gè)帶強(qiáng)負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，發(fā)生酯化作用，從而改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象、活性。因此，蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)是判斷其功能的特征之一。蛋白質(zhì)磷酸化作為普遍存在于生物體內(nèi)的調(diào)節(jié)方式，其主要發(fā)生在絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）殘基側(cè)鏈的羥基上。磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果表明，芒果ANS基因所編碼的蛋白質(zhì)含有15個(gè)磷酸化位點(diǎn)（圖5），其中Ser 11個(gè)、Thr 1個(gè)和Tyr 3個(gè)。推測(cè)芒果ANS蛋白的磷酸化可能與膜融合蛋白通過(guò)改變自身構(gòu)象來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子并轉(zhuǎn)運(yùn)至外模蛋白有關(guān)，也可能與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。

2.7 擬南芥ANS基因生育期芯片中的表達(dá)模式

由于芒果ANS基因的研究目前只限于克隆，在進(jìn)一步的試驗(yàn)研究過(guò)程中，以期在模式植物的研究成果中得到借鑒作用?，F(xiàn)以擬南芥ANS基因生育芯片的表達(dá)模式為例，繪制出擬南芥ANS基因家族的表達(dá)模式圖，如圖6所示。擬南芥5條ANS基因的表達(dá)均表現(xiàn)出明顯的組織特異性：AT4G16330.2基因除在花粉（6周）表達(dá)較弱外，其余組織均表達(dá)較強(qiáng)；AT5G05600.1基因在成熟葉（17 d）、花萼（>21 d）中表達(dá)最強(qiáng)，在花粉（6周）、莖尖（14 d）、幼葉（10 d）、芽（7 d）、下胚軸（7 d）、花梗（>21 d）表達(dá)較弱，其余組織均表達(dá)較強(qiáng)；AT2G38240.1基因在雄蕊（>21 d）表達(dá)較強(qiáng)，在花瓣（>21 d）、成熟葉 （17 d）、葉柄（17 d）表達(dá)較弱，其余組織均無(wú)表達(dá)；AT4G22880.1在老葉（35 d）中表達(dá)最強(qiáng)，在種子（8周）、老葉（35 d）、芽（7 d）、下胚軸（7 d）、子葉（7 d）、成熟葉（17 d）中表達(dá)較弱，其余組織均無(wú)表達(dá)；AT3G11180.2除在花粉（6周）、種子（8周）中有較強(qiáng)表達(dá)外，其余組織均無(wú)表達(dá)。

3 討論

ANS基因作為花青素合成途徑中的關(guān)鍵基因，廣泛用于植物基因工程研究。本試驗(yàn)以芒果ANS基因作為研究目標(biāo)，以擬南芥ANS基因?yàn)閰⒖?，?duì)芒果、擬南芥、番木瓜、金錢(qián)橘、甜橙、蘋(píng)果、桃子、甜櫻桃、西洋梨、葡萄、棗、石榴、中華獼猴桃、龍眼、荔枝、小果野蕉和無(wú)油樟17種植物共36條ANS基因編碼蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析、理化性質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)分析等。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中被選為外類(lèi)群的雙子葉植物綱無(wú)油樟科無(wú)油樟為單獨(dú)一支，雙子葉植物與單子葉植物的ANS基因互相摻雜在一起，ANS基因進(jìn)化樹(shù)沒(méi)有將雙子葉植物與單子葉植物分開(kāi)，與植物物種之間的親緣關(guān)系及進(jìn)化關(guān)系不一致，推測(cè)在進(jìn)化過(guò)程中ANS基因的分化在雙子葉植物和單子葉植物形成之后。

理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，所有蛋白中，酸性蛋白占972%、穩(wěn)定性蛋白占13.9%，有導(dǎo)肽的蛋白占8.3%，所有蛋白均為無(wú)信號(hào)肽的親水性蛋白。通過(guò)蛋白質(zhì)導(dǎo)肽分析可知，僅金錢(qián)橘基因Citcl|Ciclev10012063m與甜橙基因 Citsi|NP_001275784、Citsi|orange1.1g018466m具有線(xiàn)粒體靶向肽M （mTP）外，其余氨基酸序列均沒(méi)有導(dǎo)肽。芒果ANS蛋白與其他植物ANS蛋白表現(xiàn)出相似的性質(zhì)，為酸性、無(wú)信號(hào)肽、無(wú)導(dǎo)肽的不穩(wěn)定親水性蛋白，是一種非分泌性蛋白，由游離核糖體合成，參與細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)，在細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。這與亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)果一致，也與花色素苷的合成主要在細(xì)胞質(zhì)中完成一致。

結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，芒果ANS蛋白與其他蛋白序列都包含1個(gè)DIOX-N亞家族結(jié)構(gòu)域和1個(gè)2OG-FeII_Oxy亞家族結(jié)構(gòu)域，具有花色素合成酶家族特征多肽序列，屬于雙加氧酶家族，具有ANS基因家族的特征結(jié)構(gòu)；芒果蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與大多數(shù)蛋白一樣，以α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)元件，具有穩(wěn)定的花青素合成酶結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步推斷芒果ANS基因可能在花青素代謝途徑中具有重要作用。

蛋白磷酸化位點(diǎn)分析表明，芒果ANS蛋白存在15個(gè)磷酸化位點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，多肽鏈中的氨基酸潛在的磷酸化位點(diǎn)越多，發(fā)揮更多功能的可能性就越大。芒果ANS蛋白的磷酸化可能與膜融合蛋白通過(guò)改變自身構(gòu)象來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子并轉(zhuǎn)運(yùn)至外模蛋白有關(guān)，也可能與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，磷酸化在該蛋白上的具體功能還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

模式植物擬南芥ANS基因生育期芯片表達(dá)模式分析結(jié)果表明，5條基因的表達(dá)差異較大，表現(xiàn)出明顯的組織特異性。以擬南芥的ANS基因?yàn)閰⒖?，以期?duì)研究芒果ANS基因的表達(dá)、功能具有借鑒作用。

目前，雖有關(guān)于芒果中ANS基因的研究，但主要是對(duì)單個(gè)基因的克隆及生化特性的研究[9]。本研究以不同植物ANS基因具有較高的同源性為依據(jù)，選取17個(gè)物種（包括15種果樹(shù)、1種模式植物、1種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)選為外類(lèi)群的植物），比較了芒果與其他植物中ANS基因的特性，具有更強(qiáng)的針對(duì)性和借鑒性。研究結(jié)果得出，芒果ANS蛋白性質(zhì)與其他植物ANS蛋白表現(xiàn)出高度相似性，芒果ANS基因具有ANS基因家族特征，推測(cè)芒果ANS基因與其他植物起著相同或相似的生物學(xué)功能，但還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本試驗(yàn)對(duì)進(jìn)一步研究芒果ANS基因的時(shí)空表達(dá)特性及在花青素合成途徑中的作用機(jī)制提供理論支持。

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