滕錫川，李洪鵬

【醫(yī)藥與衛(wèi)生】

移植細(xì)胞抑制四型膠原表達(dá)誘導(dǎo)大鼠黑質(zhì)-多巴胺神經(jīng)纖維再生

滕錫川1，李洪鵬2

（1.遼東學(xué)院醫(yī)學(xué)院，遼寧丹東，118003；2.中國醫(yī)科大學(xué) 解剖教研室，沈陽110001）

為探索抑制中樞神經(jīng)再生的分子機(jī)制和尋求誘導(dǎo)中樞神經(jīng)損傷后再生的方法，將大鼠的黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)切斷、局部移植嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞及腦膜纖維芽細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)再生的神經(jīng)纖維越過損傷部位伸向紋狀體，移植細(xì)胞后損傷局部四型膠原的表達(dá)被抑制，而膠質(zhì)性瘢痕以及硫酸軟骨素的表達(dá)無明顯變化。結(jié)果表明：纖維性瘢痕在阻礙神經(jīng)再生的諸多因素中起到重要的作用；與腦膜纖維芽細(xì)胞相比，移植嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞對中樞神經(jīng)損傷后的再生具有一定的誘導(dǎo)作用，為誘導(dǎo)神經(jīng)再生提供了新的手段和方式。

中樞神經(jīng)損傷；嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞；再生

成熟哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)完全損傷后，很少出現(xiàn)神經(jīng)軸突的再生。損傷局部影響神經(jīng)軸突再生的主要因素是細(xì)胞外基質(zhì)，包括不同類型的硫酸軟骨素、tenascin和semaphorin3A等。這些因素中，局部形成以四型膠原（Col IV）為主的纖維性瘢痕，也是影響神經(jīng)軸突再生的重要角色。如果在損傷局部投入四型膠原蛋白抗體或者DPG（一種四型膠原蛋合成抑制劑）可以減少局部纖維性瘢痕的生成，誘導(dǎo)大鼠前交叉神經(jīng)的再生。筆者曾在生后1w的小鼠大腦實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，損傷后神經(jīng)再生的同時(shí)不伴有局部四型膠原蛋的產(chǎn)生［1］。

很多研究者嘗試用細(xì)胞移植來誘導(dǎo)軸突的再生和功能的恢復(fù)，包括纖維芽細(xì)胞、雪旺細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和骨髓干細(xì)胞等基質(zhì)細(xì)胞。近十年來，嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞（OEC）對神經(jīng)再生的誘導(dǎo)作用受到廣泛地關(guān)注。嗅神經(jīng)具有損傷后軸突再生以及和嗅球構(gòu)成新的神經(jīng)突觸的能力，此功能與包繞著嗅神經(jīng)的神經(jīng)鞘細(xì)胞作用密不可分［2］。有研究報(bào)道，移植嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞可以改變損傷部位的內(nèi)環(huán)境，減少某些抑制神經(jīng)軸突延伸的因素，誘導(dǎo)小鼠脊髓損傷后的神經(jīng)再生。但其中的分子機(jī)制尚不明確［3］。

本研究將大鼠的黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)切斷后局部移植嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞，觀察其對局部神經(jīng)纖維再生的誘導(dǎo)作用以及對纖維性瘢痕形成的影響，同時(shí)與移植腦膜纖維芽細(xì)胞（Fb）比較，觀察兩者對神經(jīng)再生誘導(dǎo)作用的優(yōu)劣。

1 材料和方法

1.1 黑質(zhì)-多巴胺神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型制作及分組

雄性SD大鼠8 w齡，體重250～300 g，用于本實(shí)驗(yàn)。大鼠以腹腔內(nèi)注射戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉后，固定于立體支架的腦固定裝置，切開頭皮標(biāo)記前囪，于距前囪1.5 mm后方、距正中1.0 mm右側(cè)處用齒科鉆去除顱骨、暴露大腦表面，用寬幅為2.0 mm的自制刀片橫向垂直入腦7.0 mm，保留1 min后緩慢拔出。

對側(cè)黑質(zhì)-多巴胺神經(jīng)作為無損傷組。

1.2 嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞和腦膜纖維芽細(xì)胞的取材和培養(yǎng)

用4 w齡雄性SD大鼠，從嗅神經(jīng)細(xì)胞及嗅球?qū)蛹?xì)胞分離出嗅球組織并剪成碎片，置入DMEM/F并加有10%胎牛血清培養(yǎng)液中，培養(yǎng)4～6 d，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿后進(jìn)行傳代。12～18 d后以Hoeenst33342熒光標(biāo)記細(xì)胞1 h，標(biāo)記后的細(xì)胞用胰蛋白酶收集，用DMEM/F培養(yǎng)液清洗兩遍，配成（5～8） ×107/mL細(xì)胞懸浮液備用；大鼠腦膜纖維芽細(xì)胞取材于大鼠的小腦腦膜，方法同前。嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞和纖維芽細(xì)胞分別以抗p75神經(jīng)生長因子單克隆抗體和抗纖維連接蛋白多克隆抗體進(jìn)行免疫組化鑒定確認(rèn)。

此方法培養(yǎng)的嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞中，嗅神經(jīng)纖維芽細(xì)胞（ONF） 約占30%。

1.3 移植嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞和腦膜纖維芽細(xì)胞

大鼠黑質(zhì)-多巴胺神經(jīng)切斷后，迅速抽取2 μL OEC/ONF或Fb懸浮液（約1×105細(xì)胞），緩慢注射到損傷部位，對照組注射等量生理鹽水。

1.4 制備組織切片

大鼠于術(shù)后2 w麻醉。組織取材后浸泡于固定液中24 h后行冰凍切片，厚度30μm，置于載玻片上，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 免疫組化實(shí)驗(yàn)

將切片置于3%H2O2和0.1%Triton X-100混合液中，室溫15 min，以20 mmol/L（PBS） 緩沖液輕柔沖洗，切片上滴注下述抗體溶液，4℃過夜后加入生物素標(biāo)記的二抗IgG（1∶100） 37℃、30 min，再分別加入二抗試劑，0.01%DAB顯色。抗體來源、名稱和體積分?jǐn)?shù)見表1。

表1 抗體來源、名稱及體積分?jǐn)?shù)

1.6 神經(jīng)纖維的量化分析

應(yīng)用Carl Zeiss的KS400 3.0軟件對神經(jīng)纖維進(jìn)行量化分析。每6張連續(xù)切片為一組（厚度為150μm），測定范圍為距離損傷中心200μm。

2 結(jié)果

36只大鼠行黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)的單側(cè)切斷，其中7只損傷后注入生理鹽水（對照組），19只于切斷神經(jīng)后移植嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞，另有10只大鼠神經(jīng)切斷后植入腦膜纖維芽細(xì)胞。各組大鼠均于術(shù)后2 w灌流取腦，所有大腦切片均行免疫組化染色，2 w后的腦切片作為神經(jīng)纖維束的量化分析的樣本。

2.1 損傷后局部纖維性和膠質(zhì)性瘢痕的組織學(xué)變化

損傷后局部纖維性瘢痕的形成是阻礙神經(jīng)再生的原因之一，而構(gòu)成纖維性瘢痕的主要成分為四型膠原。有學(xué)者嘗試抑制損傷部位膠原蛋白的形成，可誘導(dǎo)部分神經(jīng)軸突的再生。本研究顯示，對照組的大鼠，損傷2 w后局部形成空洞，同時(shí)可見四型膠原免疫陽性反應(yīng)，框線部分放大后顯示，四型膠原集中表達(dá)于損傷部位的中心，構(gòu)成纖維性瘢痕的主要成分，同一切片未見Hoeches陽性細(xì)胞，提示無細(xì)胞移植。損傷后移植Fb或OECs/ONFs 2 w的大鼠切片上，四型膠原免疫陽性反應(yīng)減弱，尤其移植嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞后明顯抑制四型膠原的表達(dá)，且僅限于損傷部位血管的基底膜，中心部位未見四型膠原免疫陽性反應(yīng)物聚集，同一切片中可見移植的細(xì)胞。（圖1A-1I）

構(gòu)成損傷后局部膠質(zhì)性瘢痕的成分主要為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的GFAP。對照組大鼠2w后見損傷部位外周出現(xiàn)明顯的GFAP免疫陽性的表達(dá)，提示損傷后反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生；但在移植Fb或嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞OECs/ONFs的大鼠切片上，GFAP的表達(dá)無明顯改變，反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞位于移植細(xì)胞周圍，與對照組比較無明顯差異。（圖 1J-1L）

圖1 損傷2 w后Col IV在損傷局部的表達(dá)

2.2 移植細(xì)胞對上行的黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)軸突再生的影響

黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)針對TH抗體進(jìn)行免疫組化檢測，對照組大鼠損傷后2 w切片可見損傷局部空洞形成，且上行的黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)軸突染色致密，而損傷部位遠(yuǎn)端未見黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)纖維，提示損傷后無黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)纖維的再生。腦膜纖維細(xì)胞移植組可見損傷局部空洞消失，部分黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)軸突伸入移植細(xì)胞的部位，并有少數(shù)神經(jīng)纖維越過損傷部位伸向遠(yuǎn)端的紋狀體，同時(shí)呈現(xiàn)藍(lán)色熒光的移植細(xì)胞位于損傷部位。嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞移植組術(shù)后2w同樣可見局部空洞消失，與纖維細(xì)胞移植組比較，可見較多的TH陽性神經(jīng)纖維上行跨過損傷部位并延伸至紋狀體，同時(shí)于損傷部位呈現(xiàn)藍(lán)色熒光的嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞移植（圖2A-2F）。

圖2 損傷2 w后TH陽性神經(jīng)纖維的再生情況

2.3 再生TH陽性神經(jīng)纖維的定量分析

應(yīng)用Carl Zeiss的KS400軟件，對TH陽性神經(jīng)纖維進(jìn)行定量分析，各組2 w后切片分別測定。在無損傷組的切片中，上行的黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)數(shù)量為1 387±170（n=6），黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)切斷且未移植細(xì)胞（對照組）的切片中，TH陽性神經(jīng)纖維顯著下降至98±15（n=6），移植纖維細(xì)胞組顯示黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)數(shù)量部分恢復(fù)至230±25（n=6），但與未移植細(xì)胞的大鼠相比無顯著性差異；移植嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞組大鼠TH陽性神經(jīng)纖維的數(shù)量顯著增加598±135（n=6），對照組大鼠相比有顯著性差異（P＜0.01）（圖 3）。

2.4 損傷局部硫酸軟骨素蛋白聚糖的表達(dá)分析

圖3 單位面積TH陽性神經(jīng)纖維的分析

有文獻(xiàn)報(bào)道，損傷后局部CS-D的增加，可影響神經(jīng)纖維的再生。運(yùn)用2.3量化分析的方法，觀察到各組切片中CS-D的表達(dá)無顯著性差異（圖4），提示移植細(xì)胞后對CS-D的表達(dá)無明顯影響。

圖4 損傷局部CS-D的表達(dá)

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷局部由于組織液化壞死，導(dǎo)致空洞樣病理結(jié)構(gòu)形成，阻礙神經(jīng)軸突再生。本研究發(fā)現(xiàn)，移植嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞和腦膜神經(jīng)芽細(xì)胞可抑制損傷局部空洞樣結(jié)構(gòu)的形成，并在一定程度上誘導(dǎo)黑質(zhì)-紋狀體多巴胺神經(jīng)部分再生。在移植嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞的切片上觀察到再生的神經(jīng)纖維延伸至紋狀體結(jié)構(gòu)，說明移植細(xì)胞不僅從形態(tài)學(xué)上消除了空洞的形成，還為神經(jīng)軸突的再生搭建了一個(gè)橋梁，為神經(jīng)再生創(chuàng)造了有利的內(nèi)環(huán)境。

損傷后局部纖維性瘢痕的形成是阻礙神經(jīng)再生的另一個(gè)重要原因，瘢痕中的主要成分為四型膠原蛋白。很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嘗試抑制損傷部位四型膠原蛋白可以誘導(dǎo)部分神經(jīng)軸突的再生。筆者曾觀察到大鼠胎兒中樞神經(jīng)損傷后，局部無纖維性瘢痕形成，且伴有神經(jīng)軸突的再生。本研究顯示，與對照組相比，移植嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞可明顯抑制損傷局部四型膠原的表達(dá)（局限于再生的血管基底膜），且移植嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞組在誘導(dǎo)神經(jīng)再生方面明顯優(yōu)于移植腦膜纖維芽細(xì)胞組，證實(shí)四型膠原的是抑制神經(jīng)再生的細(xì)胞外基質(zhì)之一。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞為中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供重要的營養(yǎng)支持，常在損傷局部有明顯的增生。本研究顯示，各組切片均有不同程度的GFAP免疫陽性細(xì)胞增生，但與對照組相比，未呈現(xiàn)顯著表達(dá)的跡象，顯示移植細(xì)胞后未改變局部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生情況，說明神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)再生無明顯阻礙作用。有報(bào)道稱CS-D可阻礙神經(jīng)纖維的再生，而本研究顯示，損傷后是否移植細(xì)胞無明顯的CS-D表達(dá)的變化。

移植嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞可在損傷局部提供良好的細(xì)胞外環(huán)境，以利于神經(jīng)再生。據(jù)報(bào)道，嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞具有多種抗原性和形態(tài)學(xué)特性，與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、雪旺細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等有相似之處，同時(shí)可分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)，包括各種神經(jīng)營養(yǎng)因子如BDNF和NT-3等［4］。本研究提示，移植嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞可通過抑制四型膠原的表達(dá)誘導(dǎo)神經(jīng)再生，但其分子機(jī)制尚不明確。因此，嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞對細(xì)胞間信號的傳導(dǎo)，以及在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中對四型膠原表達(dá)的影響，尚需進(jìn)一步研究。

［1］ TENG X C，NAGATA I，LI H P，et al.Regeneration of nigrostriatal dopaminergic axons after transplantation of olfactory ensheathing cells and fibroblasts prevents fibrotic scar formation at the lesion site ［J］.JNeurosci Res.2008.86:3140-3150.

［2］ KAWANO H，LI H P，SANGO K.Inhibition of collagen synthesis overrides the age-related failure of regeneration of nigrostriatal dopaminergic axons ［J］.JNeurosci Res，2005， 80：191-202.

［3］ LI H P，HOMMA A，SANGO K，et al.Regeneration of nigrostriataldopaminergic axonsbydegradationofchondroitin sulfate is accompanied by elimination of the fibrotic scar and glialimitansin thelesionsite ［J］.JNeurosciRes，2007，85:536-547.

［4］ BARNETTSC，RIDDELL JS.Olfactory ensheathing cells（OECs） and the treatment of CNSinjury:advantages and possible caveats ［J］.JAnat，2004，204 （1）：57-67.

Regeneration of nigrostriatal dopaminergic axons by transplantating cells to suppress type IV collagen expression

TENG Xi-chuan1，LI Hong-peng2
（1.College of Medicine，Eastern Liaoning University，Dandong 118003；China；2.Department of Anatomy，China Medical University，Shengyang 110001， China）

The present study was designed to examine whether cell transplantation into a damaged central nervous system could promote axonal regeneration.Nigrostriatal dopaminergic axons were unilaterally transected in rats and cultures of olfactory-ensheathing cells（OEC） were transplanted into the lesion site.After 2 weeks,dopaminergic axons were shown regenerated across the transplanted tissues compared with the absence of transplants.Reactive astrocytes and chondroitin sulfate immunoreactivity increased around the transplants,whereasthedeposition of type IV collagen and fibrotic scar formation were completely prevented at the lesion site.The present resultssuggest that elimination of the inhibitory fibrotic scar isimportant for neural regeneration.

central nervous system；olfactory ensheathing cell；regeneration

R364.3

A

1673-4939（2017）04-0246-06

10.14168/j.issn.1673-4939.2017.04.04

2017-06-28

遼東學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（8804901）

滕錫川（1967—)，男(回族)，遼寧丹東人，博士，副教授，研究方向：中樞神經(jīng)的再生機(jī)制。

（責(zé)任編輯：鞠衍清）