呂小林 聶益軍 林慧 肖婕

基于PCR-反向點(diǎn)雜交法對(duì)江西地區(qū)分枝桿菌感染狀況分析

呂小林 聶益軍 林慧 肖婕

目的了解江西地區(qū)分枝桿菌感染流行現(xiàn)狀，為臨床防治提供科學(xué)依據(jù)。方法運(yùn)用PCR-反向點(diǎn)雜交法對(duì)345例可疑分枝桿菌感染患者不同標(biāo)本進(jìn)行分枝桿菌核酸檢測(cè)。結(jié)果345份標(biāo)本中共檢出68例陽(yáng)性(陽(yáng)性率為19.7%)，其中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTC)59例(占86.76%)，非結(jié)核分枝桿菌(NTM)8例(占11.77%)，混合感染(MTC/MIN)1例(1.47%)；NTM感染中檢測(cè)出5種，分別為偶發(fā)/豬分枝桿菌(MFO)、戈登分枝桿菌(MGO)、胞內(nèi)分枝桿菌(MIN)、龜分枝桿菌膿腫亞腫(MAB)、蟾蜍分枝桿菌(MXE)，其中以MIN為主，占5.88%；不同標(biāo)本中分枝桿菌檢出率不同，痰液、灌洗液、分泌物、胸水中分枝桿菌檢出率分別為：31.5%、20.3%、16.0%、4.7%。結(jié)論江西地區(qū)分枝桿菌感染主要以MTC為主，且多為單一感染。

分枝桿菌；感染；PCR-反向點(diǎn)雜交

分枝桿菌感染引起的結(jié)核病和非結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，在全球范圍內(nèi)流行，是全球重點(diǎn)控制的傳染病之一。全球每年新發(fā)病例超過(guò)900萬(wàn)，約200萬(wàn)人死于結(jié)核病[1]。我國(guó)2009年的結(jié)核病年發(fā)病患者約為130萬(wàn)，僅次于印度，為世界第二大結(jié)核病高發(fā)國(guó)家[2]。近年來(lái)，非結(jié)核分枝桿菌(NTM)感染呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，并已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[3]。由于結(jié)核分枝桿菌感染及非結(jié)核分枝桿菌病在臨床特點(diǎn)上極其相似，但其治療方案存在明顯差異。2012年我國(guó)制訂的有關(guān)分枝桿菌感染的專家共識(shí)示，在診斷及治療分枝桿菌病前需進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定，以便對(duì)不同分枝桿菌感染進(jìn)行對(duì)癥治療[4]。因此菌種鑒定對(duì)分枝桿菌感染診治極其重要。本研究應(yīng)用PCR-反向點(diǎn)雜交法對(duì)我院345例疑似非分枝桿菌感染患者不同標(biāo)本進(jìn)行菌種鑒定，旨在報(bào)道江西地區(qū)非分桿菌流行狀況，為臨床診治及制訂相關(guān)防控措施提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

收集2015年7月至2016年5月期間于江西省南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的疑似分枝桿菌感染的門(mén)診及住院患者共345例，其中男性220例，女性125例，年齡1-88歲，平均年齡55.4歲。標(biāo)本類型有灌洗液、痰液、胸水、腹水等。

二、儀器與試劑

ABI2700定性PCR擴(kuò)增儀、水浴箱、分子雜交箱及分枝桿菌菌種鑒定基因檢測(cè)試劑(亞能生物技術(shù)有限公司原裝試劑)等。

三、方法

應(yīng)用PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)22個(gè)分枝桿菌，包括恥垢分枝桿菌(MSM)、胞內(nèi)分枝桿菌(MIN)、堪薩斯分枝桿菌(MKA)、龜分枝桿菌龜亞種(MCH)、海/潰瘍分枝桿菌(MMA)、偶發(fā)/豬分枝桿菌(MFO)、土分枝桿菌(MTE)、不產(chǎn)色分枝桿菌(MNO)、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTC)、鳥(niǎo)分枝桿菌(MAV)、瘰疬分枝桿菌(MSC)、龜分枝桿菌膿腫亞腫(MAB)、蟾蜍分枝桿菌(MXE)、淺黃分枝桿菌(MGI)、草分枝桿菌(MPH)、戈登分枝桿菌(MGO)、次要分枝桿菌(MTR)、胃分枝桿菌(MGA)、母牛分枝桿菌(MUA)、蘇爾加分枝桿菌(MDI)、迪氏分枝桿菌(MDI)、猿猴分枝桿菌(MSI)。

1 標(biāo)本處理：在各種標(biāo)本中加入適量4%NaOH 37 ℃液化30min或更長(zhǎng)時(shí)間，13000rmp離心5min，棄上清液，向沉淀中加入1mL MTB洗液，洗滌離心棄上清液，再向沉淀中50 μl MTB裂解液，沸水浴10min離心留上清液。

2 取出PCR反應(yīng)管，加入已提取好的待測(cè)樣品DNA 4μl按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增，50℃ 2min，95℃ 10min，95℃ 45s、68℃ 60s 30cycles，95℃ 30s、54℃ 30s、68℃ 60s 30cycles，68℃ 10min，另設(shè)陽(yáng)性、陰性質(zhì)控。

3 雜交：將所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(約25μl)加入到裝有雜交膜的雜交液管中，沸水水浴10min之后置于雜交箱中，59℃雜交1.5h。

4 洗膜：取出雜交膜，移至裝有預(yù)熱到59℃的洗液中，輕搖洗滌15min。

5 顯色：將洗滌好的雜交膜放入1：2000的POD溶液中，室溫輕搖浸泡30min，再用洗液清洗2遍，之后置于顯色液中避光顯色10min即可觀察結(jié)果。

6 結(jié)果判讀：根據(jù)雜交膜塊上不同位點(diǎn)是否顯判讀分枝桿菌陰、陽(yáng)性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件處理，分類計(jì)數(shù)資料用率來(lái)進(jìn)行描述。

結(jié) 果

一、分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果

345例患者中檢出68例(19.7%)陽(yáng)性共6種分枝桿菌，其中男性40例(18.2%)，女性28例(22.4%)；結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群59例(17.1%)，非結(jié)核分枝桿菌8例(2.3%)，另外1例為混合分枝桿菌感染(0.3%)；痰液、灌洗液、分泌物、胸水各種標(biāo)本中分枝桿菌檢出率分別為31.5%、20.3%、16%、4.7%。(見(jiàn)表1)。

二、分枝桿菌分布特點(diǎn)

68例分枝桿菌中共包括6種類型，分別為MTC 59例(86.76%)、MFO 1例(1.47%)、MGO 1例(1.47%)、MIN 4例(5.88%)、MAB 1例(1.47%)、MXE 1例(1.47%)、MTC/MIN 1例(1.47%)，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 345例患者分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果

表2 68株非分枝桿菌菌種分布情況

討 論

自1882年分枝桿菌被Koch發(fā)現(xiàn)以來(lái)，現(xiàn)已知有150多種， 分為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、非結(jié)核分枝桿菌及麻風(fēng)桿菌三大類，目前以結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及非結(jié)核分枝桿菌感染為主。分枝桿菌是引起人類慢性傳染性感染的最重要的病原微生物之一，無(wú)論在發(fā)展中國(guó)家還是在發(fā)達(dá)國(guó)家，分枝桿菌感染都是影響公共衛(wèi)生健康的棘手問(wèn)題。高發(fā)病率、高死亡率及易傳染性，迫使分枝桿菌感染倍受關(guān)注。2010年我國(guó)第五次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查示[5]，我國(guó)現(xiàn)有結(jié)核病患者700萬(wàn)，其中非結(jié)核分枝桿菌的感染率為22.9%，明顯高于2000年全國(guó)第四次結(jié)核病流行病調(diào)查的11.1%[6]。本研究分析了345例可疑分枝桿菌感染患者，結(jié)果示共68例陽(yáng)性(占19.7%)，其中MTC占86.76%，NTM占11.77%，混合感染占1.47%，NTM感染率低于第五次全國(guó)調(diào)查水平，與第四次全國(guó)感染率相仿。NTM與MTC同屬抗酸桿菌，有臨床特征相似，故極易誤診誤治[7]，而NTM對(duì)常規(guī)抗結(jié)核藥具有較高的耐藥性[8-9]，因此準(zhǔn)確快速檢測(cè)分枝桿菌菌種對(duì)于結(jié)核病防治意義重大。作者運(yùn)用PCR-斑點(diǎn)雜交方法分析了345例患者不同標(biāo)本中分枝桿菌感染狀況，結(jié)果示男性感染40例(占18.2%)，女性感染28例(占22.4%)；不同標(biāo)本中分枝桿菌檢出率不同，痰液、灌洗液、分泌物、胸水中分枝桿菌檢出率分別為：31.5%、20.3%、16.0%、4.7%；本次研究共發(fā)現(xiàn)6種分枝桿菌，其中以MTC感染為主，占86.76%，非結(jié)核分枝桿菌中以MIN為主，占5.88%，與北京[10]、上海[11]、廣州[12]等報(bào)道存在一定差異，由此可見(jiàn)NTM感染具有明顯地區(qū)差異；另外68例感染患者中只有1例混合感染，提示分枝桿菌感染以單一感染為主。

由于非結(jié)核分枝桿菌感染呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且存在明顯地域差異等特性，因此有必要建立準(zhǔn)確、快速檢測(cè)方法，分析分枝桿菌流行狀況，為當(dāng)?shù)匦l(wèi)生醫(yī)療機(jī)構(gòu)因地制宜地制訂相應(yīng)的防治措施提供依據(jù)。

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EpidemiologyofmycobacteriainfectionbyPCR-reversedothybridizationinJiangxiarea

LVXiao-lin,NIEYi-jun,LINHui,XIAOJie
theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China

ObjectiveTo understand the prevalence of mycobacteria infection in Jiangxi region and to provide a scientific basis for clinical prevention and treatment.MethodsThe different samples of 345 patients who suspected with mycobacteria infection were tested by PCR- reverse dot hybridization.Results68 cases were positive in 345 specimens, including 59 cases of mycobacteria tuberculous complex (MTC) (86.76%) and 8 cases of nontuberculous mycobacteria (NTM) (11.77%) and 1 case of mixed infection (MTC/MIN) (1.47%). There were 5 kinds of NTM infection detected, namely MFO, MGO, MIN, MAB and MXE respectively, and MIN was priority to others in NTM, accounted for 5.88%. The positive rate was various in different specimens, which sputum, lavage, secretions, pleural effusion positive rate was31.5%, 20.3%, 16.0%, and 4.7% respectively.ConclusionMTC and single infection are mainly types of mycobacterial infection in Jiangxi region.

mycobacteria; infection; PCR- reverse dot hybridization

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.12.032

330006 江西 南昌，南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

2016-12-30]