楊維維，馬健，馬士新，魏鈞伯，方寧遠

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院老年科，上海 200127；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院心內(nèi)科)

·基礎(chǔ)研究·

Apelin通過抑制高糖介導(dǎo)的氧化應(yīng)激保護血管內(nèi)皮功能

楊維維1，馬健2，馬士新2，魏鈞伯2，方寧遠1

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院老年科，上海 200127；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院心內(nèi)科)

目的探討Apelin對高糖誘導(dǎo)的原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)中活性氧(ROS)生成和糖尿病(DM)小鼠內(nèi)皮依賴性血管功能障礙的影響。方法①體外實驗采用高濃度葡萄糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)HUVECs細胞損傷，Apelin-13預(yù)處理1h后測定細胞內(nèi)Apelin-13、ROS水平和Caspase-3的活性(ELISA法測定)。②構(gòu)建1型糖尿病小鼠模型，予Apelin-13干預(yù)后，血管張力儀測定主動脈環(huán)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能和非內(nèi)皮依賴性血管舒張功能。結(jié)果與對照組相比，高糖誘導(dǎo)后的HUVECs內(nèi)Apelin-13的含量明顯下降(P=0.01)；高糖誘導(dǎo)后HUVECs中ROS生成和Caspase-3的活性增加，而Apelin干預(yù)可顯著降低高糖誘導(dǎo)的ROS生成和Caspase-3的活性(P=0.03，P=0.04)。此外，與對照組相比，DM小鼠主動脈環(huán)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能顯著下降(P=0.02)，而Apelin干預(yù)可有效地減輕DM小鼠血管內(nèi)皮功能障礙。結(jié)論Apelin抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞活性氧生成和細胞凋亡，減輕DM小鼠血管內(nèi)皮功能障礙。

糖尿病并發(fā)癥；內(nèi)皮,血管；氧化性應(yīng)激；模型,動物

糖尿病(DM)是當前全世界致死和致殘的主要原因之一，血管異常是DM及其相關(guān)并發(fā)癥進展的主要原因[1]，而高糖導(dǎo)致的血管內(nèi)皮功能障礙已被證實是DM血管病發(fā)癥的重要原因和始動因素[2]。近年來的研究表明，活性氧(ROS)誘導(dǎo)的氧化損傷在DM內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用[3-5]，內(nèi)皮細胞中ROS產(chǎn)物的增加可以與一氧化氮(NO)直接反應(yīng)，形成更有害的過氧亞硝酸鹽(ONOO-)，從而降低NO生物利用度[6]，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細胞凋亡及血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生。

Apelin作為一種有益的脂肪分子，是血管緊張肽受體樣蛋白質(zhì)J(APJ)的內(nèi)源性配體。Apelin可以通過不同的信號通路調(diào)控糖脂代謝，在DM的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用[7-9]。然而，Apelin能否改善DM引起的血管內(nèi)皮功能障礙及其可能機制仍尚未明確。因此，本研究通過利用高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞模型和DM小鼠模型，觀察Apelin對氧化應(yīng)激和血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響，探討Apelin在DM血管并發(fā)癥防治中的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 40只雄性小鼠，由上海西普爾-必凱實驗動物公司實驗動物中心提供(動物編號：SCXK(滬)2013-0016)。原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)購于Allcells公司；Apelin-13多肽購于GL Biochem公司；鏈脲佐菌素(STZ)購于Sigma公司；胎牛血清購于Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)基及抗生素購于Gibco 公司；45%葡萄糖液購于Sigma公司；去氧腎上腺素(PE)、乙酰膽堿(Ach)、硝普鈉(SNP)均購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 DM小鼠模型的建立及實驗分組 40只雄性小鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，其中20只麻醉后，腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)50 mg·kg-1·d-1，連續(xù)5 d，最后一次注射STZ 72 h后測血糖，如血糖gt;15.0 mmol/L則確認為1型DM，并采用隨機數(shù)字表法分為DM組(Con-STZ組，n=10)和Apelin+DM組(Apelin-STZ組，n=10)。另20只小鼠用檸檬酸鹽緩沖液進行處理后作為對照組(血糖lt;12 mmol/L)，并隨機分為健康對照組(Con組，n=10)和Apelin+對照組(Apelin組，n=10)。Apelin-13通過滲透性微泵持續(xù)腹腔給藥，3 nmol·kg-1·h-1。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及分組 HUVECs株培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%抗生素)中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育。分組處理如下：①對照組(Control組，干預(yù)時給予同體積的DMSO)；②Apelin+對照組(Apelin-13多肽預(yù)處理1 h后再予DMSO)；③高糖組(HG組，含35 mmol /L的D-葡萄糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng))；④Apelin+高糖組(Apelin-13多肽預(yù)處理1 h后再予高糖培養(yǎng)基培養(yǎng))。干預(yù)時間為24 h，Apelin-13濃度為200 nmol/L。細胞種于六孔板中，每組至少重復(fù)3 次。

1.2.3 主動脈環(huán)檢測內(nèi)皮依賴性和內(nèi)皮非依賴性血管舒張功能 在預(yù)冷并通入95% O2+5% CO2混合氣體的Krebs液中剝離出糖尿病小鼠胸主動脈，漂洗后剪成3～4 mm的血管環(huán)，連接多個張力傳感器；加入PE(10-6mol/L)預(yù)收縮動脈環(huán)10 min，達峰值后依次加入5 μL 10-9～10-4mol/L的Ach累加計量舒張動脈環(huán)，檢測內(nèi)皮依賴性血管舒張功能；再用Krebs液沖洗3次，每次10 min，加入PE(10-6mol/L)預(yù)收縮動脈環(huán)達峰值后，依次加入5 μL 10-9～10-4mol/L的SNP，累加計量舒張動脈環(huán)，檢測內(nèi)皮非依賴性血管舒張功能。

1.2.4 Apelin-13、ROS和Caspase-3的檢測 采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定Apelin-13的含量，試劑盒購于美國Phoenix pharmaceutical Inc。用熒光探針DCFH-DA檢測ROS水平。使用熒光測定試劑盒(購于BIOMOL Research Laboratories)測定細胞內(nèi)Caspase-3的活性。

2 結(jié)果

2.1 高糖對Apelin-13含量的影響 與Con組相比，HG誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞中Apelin-13的含量明顯降低(P=0.01)，見圖1。

與Con組比較，aPlt;0.05

2.2 Apelin-13對高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞ROS產(chǎn)生的影響 與Con組相比，HG組的ROS生成明顯增加(P=0.03)，Apelin-13干預(yù)后能細胞內(nèi)ROS的生成得到顯著抑制(P=0.03)，見圖2。

與Con組比較，aPlt;0.05；與HG組比較，bPlt;0.05

圖2Apelin-13對高糖誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

2.3 Apelin-13對高糖誘導(dǎo)引起的血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響 與Con組相比，HG組的Caspase-3活性明顯增加(P=0.03)，Apelin-13干預(yù)后Caspase-3的活性得到顯著抑制(P=0.04)，見圖3。

與Con組比較，aPlt;0.05；與HG組比較，bPlt;0.05

圖3Apelin-13對高糖誘導(dǎo)引起的HUVECs凋亡的影響

2.4 Apelin-13對DM小鼠主動脈血管舒張功能的保護 主動脈環(huán)內(nèi)皮依賴性血管舒張功能在Con-STZ組明顯受損，經(jīng)Apelin預(yù)處理后明顯改善(Ach濃度≥10-7mol/L起，P=0.02)；而各組非內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)，見圖4。

3 討論

本研究顯示：高糖干預(yù)后內(nèi)皮細胞中Apelin-13的含量顯著下降，提示Apelin變化可能參與DM血管損傷過程。近年研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞內(nèi)ROS生成是DM血管損傷的重要機制[10-12]，本研究同樣發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)后細胞內(nèi)ROS生成和Caspase-3的活性增加，而外源性Apelin-13干預(yù)后內(nèi)皮細胞中ROS生成和細胞凋亡得到顯著逆轉(zhuǎn)，證實 Apelin-13可能通過抑制內(nèi)皮細胞中ROS生成、減少細胞凋亡進而發(fā)揮血管內(nèi)皮保護作用。

與Con組比較，aPlt;0.05；n=6

圖4Apelin-13對糖尿病小鼠主動脈血管舒張功能的影響

血管內(nèi)皮是襯于血管壁內(nèi)的超薄結(jié)構(gòu)，高糖環(huán)境下由于ROS生成增加造成內(nèi)皮細胞損傷、促進炎性反應(yīng)和血管舒張功能障礙[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，1型DM小鼠存在內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙，而Apelin-13可保護DM小鼠的血管舒張功能，改善DM所致的內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙。

綜上所述，本研究證實了Apelin-13干預(yù)對DM小鼠的血管內(nèi)皮功能障礙有保護作用，機制與抑制氧化應(yīng)激和細胞凋亡有關(guān)。研究結(jié)果將為進一步探索DM血管功能障礙的防治提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

[1] CREAGER MA,LUSCHER TF,COSENTINO F,et al.Diabetes and vascular disease:pathophysiology,clinical consequences,and medical therapy:Part I[J].Circulation,2003,108(12):1527-1532.

[2] TABIT CE,CHUNG WB,HAMBURG NM,et al.Endothelial dysfunction in diabetes mellitus:molecular mechanisms and clinical implications[J].Rev Endocr Metab Disord,2010,11(1):61-74.

[3] PENNATHUR S,HEINECKE JW.Oxidative stress and endothelial dysfunction in vascular disease[J].Curr Diab Rep,2007,7(4):257-264.

[4] LAU YS,TIAN XY,HUANG Y,et al.Boldine protects endothelial function in hyperglycemia-induced oxidative stress through an antioxidant mechanism[J].Biochem Pharmacol,2013,85(3):367-375.

[5] CIFARELLI V,GENG X,STYCHE A,et al.C-peptide reduces high-glucose-induced apoptosis of endothelial cells and decreases NAD(P)H-oxidase reactive oxygen species generation in human aortic endothelial cells[J].Diabetologia,2011,54(10):2702-2712.

[6] XU J,ZOU MH.Molecular insights and therapeutic targets for diabetic endothelial dysfunction[J].Circulation,2009,120(13):1266-1286.

[7] CEYLAN-ISIK AF,KANDADI MR,XU X,et al.Apelin administration ameliorates high fat diet-induced cardiac hypertrophy and contractile dysfunction[J].J Mol Cell Cardiol,2013,63(1):4-13.

[8] DAY RT,CAVAGLIERI RC,FELIERS D.Apelin retards the progression of diabetic nephropathy[J].Am J Physiol Renal Physiol,2013,304(6):F788-800.

[9] KASAI A,ISHIMARU Y,KINJO T,et al.Apelin is a crucial factor for hypoxia-induced retinal angiogenesis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2010,30(11):2182-2187.

[10] 李忠堂,閻智力.有氧運動對Ⅱ型糖尿病大鼠腹主動脈Apelin和一氧化氮合酶/一氧化氮系統(tǒng)的影響[J].西安體育學(xué)院學(xué)報，2015，32 (6)：733-738.

[11] WEST SG,HECKER KD,MUSTAD VA,et al.Acute effects of monounsaturated fatty acids with and without omega-3 fatty acids on vascular reactivity in individuals with type 2 diabetes[J].Diabetologia,2005,48(1):113-122.

[12] 史亦男,張楠,崔圓,等.氧化應(yīng)激與糖尿病及其血管并發(fā)癥研究進展[J].中國老年學(xué)雜志，2016，36 (9)：4664-4666.

Apelinprotectsendothelialfunctionviainhibitinghighglucose-inducedoxidativestress

YangWeiwei*,MaJian,MaShixin,WeiJunbo,FangNingyuan

(*DepartmentofGeriatrics,RenjiHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

FangNingyuan,Email：fangny@sh163.com

ObjectiveTo investigate the role of Apelin in reactive oxygen species (ROS) production in primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and endothelium-dependent vascular dysfunction in diabetic mice.Methods①HUVECs were cultured by medium of high concentration of glucose to induce damage.After pretreatment of Apelin-13 for 1h,the ROS production and Caspase-3 activity(ELISA) were detected respectively.②40 experimental type 1 diabetic mice were randomized equally into control group and diabetic group.Apelin-13 production,endothelium-dependent relaxation and endothelium-independent relaxation in aortic ring were determined respectively.ResultsSignificant decreased Apelin-13 production was observed in HUVECs by high glucose compared with the control group (P=0.01)).Exposure to high glucose increased ROS production and Caspase-3 activity by HUVECs,which were significantly preserved by pretreatment of Apelin-13 (P=0.03，P=0.04).Furthermore,in mouse models of STZ-induced type 1 diabetes,the endothelium-dependent relaxation in aortic ring reduced significantly (P=0.02),which was reversed by pretreatment with Apelin-13.ConclusionsApelin could inhibit vascular endothelial cell ROS generation and apoptosis induced by high glucose,and ameliorate the endothelial dysfunction in diabetic mice.

Diabetes complications；Endothelium,vascular；Oxidative stress；Models,animal

國家自然科學(xué)基金(81400354，81300177)；上海交通大學(xué)醫(yī)工交叉項目 (YG2013MS52)；上海市自然科學(xué)基金(13ZR1459200)

楊維維，醫(yī)師，Email：yangweiwei2005136@126.com

方寧遠，教授，博士生導(dǎo)師，Email：fangny@sh163.com

R587.2

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.06.028

2017-06-16)