*

1.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500；2.江西省余干縣人民醫(yī)院，江西 余干 335100；3.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004

實(shí)驗(yàn)研究

迷迭香提取物對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

張?zhí)m春1程先睿2于浩飛1胡煒彥1高秀麗3張榮平1*

1.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500；2.江西省余干縣人民醫(yī)院，江西 余干 335100；3.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004

目的研究迷迭香提取物(MDX 60)對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法將50只健康SD大鼠，隨機(jī)分為5組，模型組，迷迭香提取物(MDX 60)和燈盞花素提取物(EBHM)的高(680mg/kg·d)、低(170mg/kg·d)劑量組，每組10只，其中EBHM為陽性對照組。分別對各組大鼠冠狀動脈左前降支(LAD)進(jìn)行結(jié)扎，以心尖處變?yōu)樯n白色為缺血成功的標(biāo)志，40min后剪掉結(jié)扎線，再灌注120min，進(jìn)而制備心肌缺血再灌注損傷模型。造模成功后，采用1%紅四氮唑(TTC)染色測量大鼠心肌梗死面積，用Image-Pro Plus圖像處理軟件測定大鼠心肌缺血面積的改變。結(jié)果與模型組比較，MDX 60(17mg/kg、68mg/kg)和EBHM(170mg/kg、680mg/kg)的缺血面積百分比明顯縮小(Plt;0.01)；MDX 60低劑量組與EBHM低劑量組的缺血面積百分比相近，MDX 60高劑量組和EBHM高劑量組相比缺血面積有所增大。結(jié)論MDX60可以通過減小心肌梗死面積，發(fā)揮對大鼠心肌缺血再灌注損傷的護(hù)作用，低劑量MDX 60比EBHM對大鼠心肌梗死面積發(fā)揮更好的保護(hù)效果。

迷迭香提取物；心肌缺血再灌注；梗死面積；保護(hù)

隨著科技、經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活節(jié)奏的加快和生活水平的不斷提高，心腦血管疾病的發(fā)病率也隨之不斷上升、其致死率已超過惡性腫瘤，成為全世界范圍內(nèi)危害人類健康生命的頭號殺手。心肌缺血再灌注損傷(Myocardial Ischemia Reperfusion Injury，MIRI)是缺血的心肌在恢復(fù)血流后損傷反而加重的現(xiàn)象，與氧化應(yīng)激、鈣離子超載、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞水腫、再灌注性心律失常、心肌抑頓、微血管的損傷、心肌細(xì)胞的死亡[1]。近年來，探索中醫(yī)藥在保護(hù)缺血心肌再灌注損傷中發(fā)揮的作用已成為研究的熱點(diǎn)。唇形科迷迭香屬植物迷迭香(RosmarinusofficinalisL.) 是一種具有豐富使用價(jià)值的植物，其化學(xué)成分鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酚、熊果酸、迷迭香酸等，具有延緩衰老、防腐、抗菌、抗氧化等功效[2]。研究表明，迷迭香中的鼠尾草酸作為小分子親電性化合物，抗氧化的作用機(jī)制主要表現(xiàn)在清除自由基，切斷類脂氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，影響內(nèi)源性氧化系統(tǒng)等方面[3]，迷迭香酸通過提高氧化酶活性、增強(qiáng)清除自由基能力以及抑制心肌缺血后心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生進(jìn)而對大鼠冠脈結(jié)扎后引起的心肌缺血損傷的起保護(hù)作用[4]。本研究擬在大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的基礎(chǔ)上，觀察迷迭香提取物對心肌梗死范圍的影響，探討迷迭香提取物對大鼠心肌缺血再灌住損傷的保護(hù)作用，為下一步開展研究提供基礎(chǔ)與依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑 迷迭香提取物(批號：SP141101)為黃色，粉末狀，主要成分是鼠尾草酸(60%)；陽性對照藥燈盞花素(EBHM，批號：S141201-2)為淡黃色，粉末狀，主要成分是燈盞花素(20.24%)；2個(gè)樣品均由昆明醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)教研室提供。氯化三苯基四氮唑(TTC，批號：101060270，美國Sigma公司)；生理鹽水(浙江國鏡藥業(yè)，批號：c150927)；10%烏拉坦注射液(自配)；4%甲醛溶液(重慶茂業(yè)，批號：20161016)。

1.2 動物 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，雌雄各半，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供，SPF級，動物合格證號: SCXK(滇)2015-0002。

1.3 儀器 ALC-V9動物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)；SHA-B水浴恒溫振蕩器(上海比朗儀器有限公司)；WZ-50C6微量注射泵(浙江史密斯醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；ES-1000E電子天平(湘儀天平儀器設(shè)備有限公司)；手術(shù)器械若干。

2 方法

2.1 分組及給藥 將60只健康SD大鼠隨機(jī)分為6組，正常組，模型組，燈盞花素提取物(EBHM)和 MDX 60 2種藥物的低(170mg/kg·d)、高(680mg/kg·d)劑量組，每組10只，雌雄各半，其中EBHM為陽性對照組。對各組動物分別進(jìn)行標(biāo)記，術(shù)前3d灌胃給藥(2mL/100g)，正常組和模型組給予生理鹽水，其余各組按相應(yīng)的劑量分別給以灌胃，每天給藥1次，第4天給藥之后立即手術(shù)。

2.2 動物模型 參照徐叔云等[5]報(bào)道的方法復(fù)制大鼠心肌缺血再灌注損傷模型：腹腔注射10%烏拉坦(1mL/100g)對大鼠實(shí)施麻醉，后仰臥位固定，四肢皮下插入針形電極，采用18g、38mm筆筒型動靜脈留置針經(jīng)口插入大鼠氣管中，行氣管插管，連接小動物呼吸機(jī)進(jìn)行人工呼吸(呼吸頻率73次/min，呼吸比1∶1，潮氣量11cc)。待呼吸穩(wěn)定后，去除胸部的毛，沿胸骨左緣剪開皮膚，鈍性分離肌肉，剪斷第3、4肋骨，暴露胸腔后，小心剪開心包膜，暴露心臟，以左心耳肺動脈圓錐交界處的左冠狀靜脈為標(biāo)志，對胸腺進(jìn)行固定，在左心耳下緣1～2mm處與肺動脈圓錐間穿5-0號縫合線，取一小段直徑約為1～1.5mm的線壓在結(jié)扎部位之上，后拉緊絲線，形成心肌缺血，心尖處變?yōu)樯n白色為缺血成功標(biāo)志。40min后開胸剪去結(jié)扎線再灌注120min。

2.3 測定心肌梗死面積 打開胸腔取出心臟，置于預(yù)冷的生理鹽水中洗去血漬，置于電子天平上稱取全心重后去除心房、右心室及筋膜組織，將左心室用濾紙吸取水分后稱重。將心臟置于-20℃冰箱中5min以便于切片，取出后用自制刀片沿橫切面將心臟均勻切成厚度1mm薄片。心臟切片放入37℃預(yù)熱過的1%TTC溶液中，在37℃下用水浴恒溫振蕩器振蕩染色10～15min，4%甲醛溶液固定，觀察染色結(jié)果，非梗死心肌組織為紅色，缺血壞死心肌組織為蒼白色。將染色的心臟切片置于生理鹽水中，用直尺設(shè)定好標(biāo)尺后照相，用Image-Pro Plus(IPP)圖像處理軟件計(jì)算得出缺血面積，計(jì)算心肌缺血面積占心室面積的百分比。

3 結(jié)果

3.1 對心肌梗死的影響 以心尖處變?yōu)樯n白色為心肌梗死缺血的成功標(biāo)志，經(jīng)過1%紅四氮唑進(jìn)行心臟染色。心臟切片染色結(jié)果顯示，正常組心尖顯現(xiàn)粉紅色，模型組中蒼白色的范圍較廣，說明與正常組相比模型組缺血壞死心肌組織較多；與模型組比較，迷迭香提取物(MDX 60)和燈盞花素(EBHM)4個(gè)不同治療組的心臟切片染色結(jié)果也出現(xiàn)不同程度的蒼白色，但心肌梗死范圍沒有模型組明顯，說明各治療組能有效縮小心肌梗死范圍，在一定程度上可保存更多的存活心肌。見圖1。圖中缺血為淺色，正常為深色。

3.2 對心肌梗死范圍的影響 與模型組比較，MDX60(17mg/kg、68mg/kg)和EBHM(170mg/kg、680mg/kg)的缺血面積百分比明顯縮小(Plt;0.01)；MDX 60低劑量組與EBHM低劑量組的缺血面積百分比相近，MDX 60高劑量組和EBHM高劑量組相比缺血面積有所增大。說明MDX 60可以通過減小心肌梗死面積，發(fā)揮對大鼠心肌缺血再灌注損傷的護(hù)作用，低劑量MDX 60對大鼠心肌梗死面積的保護(hù)效果和低劑量EBHM的保護(hù)作用一致。見表1。

4 討論

心肌缺血再灌注在減少急性心肌梗死面積的同時(shí)，由于冠狀動脈的驟然開通與血流恢復(fù)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常、激活炎癥因子等，導(dǎo)致再灌注損傷心肌缺血出現(xiàn)極高的發(fā)病率以及致死率。大量的動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究已經(jīng)證實(shí)心肌缺血再灌注損傷的治療方法主要是清除心肌細(xì)胞氧自由基，通過阻止細(xì)胞內(nèi)鈣超載和抑制mPTP開放來減輕線粒體損傷和細(xì)胞內(nèi)鈣超載，抑制中性粒細(xì)胞活性和NF-κB 及促炎性細(xì)胞因子的釋放發(fā)揮抗炎作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量代謝、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝以及抑制心肌細(xì)胞凋亡[6]。近年研究表明，中藥可作用于心肌缺血再灌注損傷的多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮心肌保護(hù)作用，其主要作用機(jī)制與清除氧自由基、減輕鈣超載、改善能量代謝、干預(yù)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮因子、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)[7]。

表1 迷迭香提取物對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌梗死范圍的影響

注：與模型組比較，*Plt;0.05,△Plt;0.01。

迷迭香是一種廣泛使用的中草藥，體內(nèi)外的研究表明，迷迭香活性提取物具有抗氧化，抑制肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞增殖，抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、植物病原真菌生長等作用，還具有抗病毒、抗炎、誘導(dǎo)T 細(xì)胞活化，抗血管形成等作用，對帕金森病、阿爾茨海默病、血管性癡呆也有一定的治療作用[8]。迷迭香脂溶性提取物對大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO) 模型有明顯保護(hù)作用，能明顯改善模型大鼠的神經(jīng)功能障礙，減輕模型大鼠的腦梗塞范圍，對腦系數(shù)有降低趨勢，降低模型大鼠ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集率[9]。迷迭香酸能夠顯著改善腦缺血再灌注大鼠的行為障礙和減少腦梗塞體積，可以顯著抑制腦缺血再灌注大鼠MDA的生成，明顯升高SOD和GSH-Px的活性[10]。

本實(shí)驗(yàn)采用大鼠心肌缺血再灌注損傷模型研究迷迭香提取物的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠心肌缺血再灌注損傷后使用迷迭香提取物進(jìn)行干預(yù)治療，心肌梗死面積會減少，低劑量的迷迭香提取物比燈盞花素提取物對大鼠心肌梗死面積發(fā)揮更好的保護(hù)效果，有效地減輕缺血再灌注對其心肌細(xì)胞造成的損傷，使心肌病變的程度明顯減輕，進(jìn)而發(fā)揮對心肌的保護(hù)作用，對進(jìn)一步研究心肌缺血性疾病的防治奠定基礎(chǔ)。

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ProtectiveEffectofRosemaryExtractonRatswithMyocardialIschemiaReperfusionInjury

ZHANG Lanchun1CHENG Xianrui2YU Haofei1HU Weiyan1GAO xiuli3ZHANG Rongping1*

1. Kunming Medical University，Kunming 650500,China; 2. Jiangxi Yugan County People’s Hospital，Yugan 335100,China;3.Guizhou Medical University, Guiyang 550004,China

ObjectiveTo observe the protective effects of rosemary extract(MDX 60) on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats.MethodsTotally 50 SD rats were randomly divided into model group，Dengzhanhua(EBHM) extract 170、680mg/kg control groups, and MDX 60 170、680mg/kg treated groups(n=10). The myocardial ischemia reperfusion injury model was established through occluding the left anterior descending branch of coronary artery for 40 min and removing the ligation later to reperfuse for 30 min in vivo．Different doses of aqueous extract were intragastrically administered once per day for 4 days before operation．Using 1%TTC staining measure myocardial infarct size, and Image-Pro Plus image processing software was used to gauge the size vary from myocardial ischemia area.ResultsCompared with myocardial ischemia reperfusion control group，the percentage of ischemic area with MDX 60 extract 170,680mg/kg groups and EBHM extract 170,680mg/kg groups were significantly decreased(Plt;0.01); ischemia area percentage in low dose group of MDX 60 and EBHM is similar，while，compared with EBHM the ischemia area in high dose group of MDX 60 is increased.ConclusionMDX 60 can reduce the myocardial infarct size and exert a protective effect on myocardial ischemia reperfusion injury in rats. The effect of low dose MDX 60 on myocardial infarct size in rats was better than EBHM.

Rosemary Extract; Myocardium Ischemia-reperfusion; Myocardial Infarction Range; Protection

十二五國家科技支撐計(jì)劃(2014BAI01B01～04);云南省自然科學(xué)基金——昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)(2015FB006，2016FB014); 云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(2014G003)。

張?zhí)m春(1988-)，女，白族，碩士研究生，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幩幚硌芯俊-mail：zhlch_2010@163.com

張榮平(1964-)，男，漢族，博士研究生，教授，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)及新藥研究。E-mail:zhrpkm@163.com

R285.5

A

1007-8517(2017)21-0026-04

2017-09-09 編輯：梁志慶)