翟夢怡 朱素英 陳作藝 李 揚(yáng)

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室, 廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室, 廣州 510631)

廣東沿海洛氏角毛藻復(fù)合群物種多樣性的探究

翟夢怡 朱素英 陳作藝 李 揚(yáng)

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室, 廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室, 廣州 510631)

為了澄清洛氏角毛藻復(fù)合群的物種多樣性, 并明確洛氏角毛藻和并基角毛藻的種間界限, 文章以廣東沿海為例, 建立了洛氏角毛藻復(fù)合群的22個單克隆培養(yǎng)株系, 利用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡技術(shù), 開展了基于生活史的連續(xù)形態(tài)學(xué)觀察; 結(jié)合基于核糖體大亞基編碼基因D1-D3區(qū)序列的分子系統(tǒng)學(xué)分析。結(jié)果表明: 文章支持近年研究的觀點, 認(rèn)為“角毛基部并行融合”不是穩(wěn)定特征, 不宜繼續(xù)作為并基角毛藻的標(biāo)志特征; 發(fā)現(xiàn)洛氏角毛藻形態(tài)相似藻株聚類在2個分支上, 確認(rèn)了洛氏角毛藻確實存在隱藏的物種多樣性。其中一類與目前認(rèn)知的洛氏角毛藻最為接近, 而另一類在角毛孔紋、休眠孢子上存在明顯區(qū)別。經(jīng)過對洛氏角毛藻歷史文獻(xiàn)的對比研究, 發(fā)現(xiàn)洛氏角毛藻的物種界定存在混亂和模糊的情況, 如休眠孢子形態(tài), 及其初生殼面是否具有二叉狀分布結(jié)構(gòu)等, 均存在相互矛盾或不一致的歷史報道。

洛氏角毛藻; 并基角毛藻; 物種多樣性; 休眠孢子; 廣東沿海

角毛藻屬(ChaetocerosEhrenberg)是硅藻門中物種多樣性最為豐富的大屬之一, 是浮游植物的重要組成[1,2]。洛氏角毛藻復(fù)合群(Chaetoceros lorenzianuscomplex)是指具有與洛氏角毛藻相似形態(tài)學(xué)特征的物種集合, 它是角毛藻屬的典型類群, 廣泛分布于全球近岸水域[2,3]。該復(fù)合群的共享特征有:(1)直鏈狀群體; (2)色素體多數(shù); (3)角毛硬且直, 基本分布在同一平面上; (4)鏈端角毛異與鏈中角毛。目前該復(fù)合群包含3個物種: 洛氏角毛藻(C. lorenzianusGrunow)、并基角毛藻(C. decipiensCleve)和密特拉角毛藻(C. mitra(Bailey) Cleve)。

該復(fù)合群的3個物種之間存在較多相似特征,易出現(xiàn)混淆鑒定的情況。其中密特拉角毛藻因為具有相對柔軟、延伸不規(guī)則的角毛, 而較易區(qū)分于其他2個物種。洛氏角毛藻和并基角毛藻則因具有更多相似特征而難以區(qū)分, 因此存在較多分類學(xué)爭議, 它們也正是該復(fù)合群物種多樣性研究的焦點所在。在以往的認(rèn)知中, 洛氏角毛藻和并基角毛藻之間的關(guān)鍵區(qū)別是: (1)洛氏角毛藻的“相鄰角毛基部不具有并行融合”, 而并基角毛藻則具有此類典型特征; (2)前者具有二叉分支結(jié)構(gòu)的休眠孢子, 而后者未見休眠孢子的報道。其中, 硅藻學(xué)家對于“相鄰角毛基部并行融合”的認(rèn)可和應(yīng)用最為廣泛, 該特征被認(rèn)為是并基角毛藻的標(biāo)志特征, 并區(qū)別于其他相似物種[2—7]。然而, 近年來有學(xué)者對這一特征進(jìn)行了針對性研究, 發(fā)現(xiàn)了更為有趣的現(xiàn)象。陳作藝等[8]在基于并基角毛藻單克隆培養(yǎng)株系的形態(tài)學(xué)和分類學(xué)研究中, 結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)“相鄰角毛基部并行融合”并不是一個穩(wěn)定特征, 認(rèn)為其不能作為并基角毛藻的專屬特征。該研究基本廓清了并基角毛藻的形態(tài)特征, 但同時也模糊了洛氏角毛藻與并基角毛藻之間的種間界限。另一方面, 該研究還認(rèn)為目前認(rèn)知的洛氏角毛藻和并基角毛藻均存在遺傳多樣性, 推測有物種多樣性未被報道。基于上述原因, 本文選擇廣東沿海作為示范海域, 開展洛氏角毛藻復(fù)合群物種多樣性的初步探究。需要說明的是, 由于密特拉角毛藻是典型冷水種, 目前僅報道于高緯度海區(qū)[2], 而本文的研究海域設(shè)置在廣東沿海, 因此本文暫不涉及密特拉角毛藻, 研究重點聚焦于洛氏角毛藻和并基角毛藻。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

于2011—2016年在廣東沿海進(jìn)行活體樣品的持續(xù)性采樣, 樣品采集的代表海域主要有汕頭、深圳、香港、珠海和湛江。利用浮游植物網(wǎng)(孔徑10 μm)進(jìn)行水平拖網(wǎng), 并盡快帶回實驗室。采集樣品時同步測定水溫、鹽度等參數(shù)。

1.2 單克隆培養(yǎng)株系的建立

在倒置顯微鏡(Mshot MI-12)下, 利用毛細(xì)管法挑取目標(biāo)藻細(xì)胞, 并轉(zhuǎn)移至盛有L1培養(yǎng)液的48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中[9], 待其繁殖至一定細(xì)胞密度后, 再轉(zhuǎn)移至盛有L1培養(yǎng)液的100 mL錐形瓶中, 以MC (Marine collection)序列進(jìn)行編號。培養(yǎng)條件如下: 普通冷光源熒光燈為光源, 光照周期為12h∶12h, 光照強(qiáng)度約為50—80 μmol photons/(m2·s), 培養(yǎng)溫度為(22±2)℃。本文的研究目標(biāo)設(shè)定為洛氏角毛藻和并基角毛藻, 因此在藻株分離純化過程中, 目標(biāo)藻株的篩選依據(jù)是: 符合現(xiàn)存分類體系中洛氏角毛藻和并基角毛藻形態(tài)特征的種類(如前言所述)。本文共建立了22個目標(biāo)藻株的單克隆培養(yǎng)株系(表1), 其中MC1109、MC1110引自陳作藝等[8], 是并基角毛藻的典型代表。

1.3 休眠孢子的誘導(dǎo)

吸取1 mL對數(shù)生長期藻液, 轉(zhuǎn)移到盛有L無氮培養(yǎng)液的100 mL三角瓶中培養(yǎng)[7], 培養(yǎng)條件是(22±2)℃、12h∶12h光循環(huán)、光照強(qiáng)度約為50—80 μmol photons/(m2·s)。每個藻株均誘導(dǎo)3次以上,并定期觀察有無休眠孢子產(chǎn)生。

1.4 形態(tài)學(xué)特征的觀察

光鏡(Light Microscope, LM)觀察: 吸取10 μL對數(shù)生長期藻液, 滴在載玻片上, 置于光學(xué)顯微鏡(Olympus BX53)下進(jìn)行微分干涉(Differential interference contrast, DIC)的觀察, 并使用Olympus DP27數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照記錄。光鏡下的主要觀察特征有: 群體類型、色素體分布和數(shù)量、窗孔特征、角毛形態(tài)和走勢、休眠孢子形態(tài)等。

掃描電鏡(Scanning Electron Microscope,SEM)觀察: 吸取200 μL對數(shù)生長期藻液, 轉(zhuǎn)移至15 mL試管中, 加入等體積的濃硫酸(＞95%), 靜止10min后, 加入滅菌雙蒸水, 并多次水洗至中性[10]。用注射式濾器將藻細(xì)胞過濾到5 μm濾膜上, 自然干燥后, 噴金并置于掃描電鏡(Zeiss Utras55)下觀察和拍照。掃描電鏡下的主要觀察特征有: 唇形突結(jié)構(gòu)、窗孔超微結(jié)構(gòu)、角毛上刺和孔紋的特征、休眠孢子超微結(jié)構(gòu)等。

表1 本文建立的洛氏角毛藻復(fù)合群株系信息Tab. 1 List and information of monoclonal strains in this study

透射電鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)觀察: 用移液槍吸取10 μL酸化處理好的藻液,平鋪在微孔銅網(wǎng)上, 自然晾干后置于透射電鏡(Philips Tecnail0)下觀察和拍照。透射電鏡下的主要觀察特征有: 殼面及殼套的超微結(jié)構(gòu)等。

1.5 基于LSU nrDNA D1-D3區(qū)的分子系統(tǒng)學(xué)分析

用離心法收集50 mL藻液進(jìn)行總DNA的提取[11]。利用D1R-F[12]和D3B-R[13]對核糖體大亞基編碼基因(LSU nrDNA)的D1-D3區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物送往上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化和測序。

從NCBI下載洛氏角毛藻和并基角毛藻的LSU序列, 運(yùn)用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對和矩陣[14],共有670個堿基用于最終的分析?；贛rModeltest 2.3[15]計算, 選擇的最適模型和參數(shù)GTR+G,([AC=0.5647], [AG=1.9928], [AT=1.1435], [CG]=0.3347, [CT]=5.1623, [GT]=1.0000, gamma shape=0.2848, nucleotide frequencies: A=0.2648, C=0.1890,G=0.2966, T=0.2496)[16], 分別用RAxML-HPC2[17]和MrBayes 3.2[18]構(gòu)建最大似然樹(Maximum Likelihood, ML)和貝葉斯推理(Bayesian inference, BI)。其中ML分析的自檢值(Bootstrap test)設(shè)定為1000,參照以往工作[7], 選用大西洋角毛藻C. atlanticusCleve(EF423454)為外群對照。

2 結(jié)果

2.1 基于形態(tài)特征的初步鑒定

本文以現(xiàn)存分類體系中洛氏角毛藻和并基角毛藻的形態(tài)特征為依據(jù), 共建立了22個單克隆培養(yǎng)株系。根據(jù)它們的主要形態(tài)特征, 如群體類型、角毛走勢、角毛孔紋、是否具有休眠孢子等, 可將其劃分為以下4個類群。

類群一:包括株系MC1109、MC1110、MC1059和MC1060。多形成長而規(guī)則的直鏈狀群體(圖版Ⅰ-1、2)。角毛硬且直, 呈Brunel-I型, 相鄰角毛基部有并行融合(圖版 Ⅰ-1、2)。角毛孔紋橢圓形(圖版 Ⅰ-7、8)。未見休眠孢子。因具有典型的“相鄰角毛基部并行融合”特征, 本類群初步鑒定為并基角毛藻C. decipiens。

類群二:包括株系MC132和MC151。可形成長而規(guī)則的直鏈狀群體(圖版 Ⅰ-9)。角毛硬且直, 呈Brunel-I型, 相鄰角毛基部未見并行融合特征(圖版Ⅰ-9、10)。角毛孔紋橢圓形(圖版 Ⅰ-12、13)。未見休眠孢子。除了沒有“相鄰角毛基部并行融合”這一特征之外, 類群二與類群一的形態(tài)特征基本一致,因此初步鑒定為形似并基角毛藻C.cf.decipiens。

類群三:包括MC150、MC153、MC786、MC794、MC1000、MC1119和MC1120。直鏈狀群體(圖版 Ⅱ-1)。角毛硬且直, 呈Brunel-I型, 相鄰角毛基部未見并行融合特征(圖版 Ⅱ-1、2)。角毛孔紋呈水滴形(圖版Ⅱ-7、8)。休眠孢子的初生殼具有兩個錐狀突起, 上生二叉分支的樹狀結(jié)構(gòu), 次生殼具1—2個低突起(圖版 Ⅱ-2、5)。本類群未見“相鄰角毛基部并行融合”, 且具有二叉分支的休眠孢子, 因此初步鑒定為洛氏角毛藻C. lorenzianus。

類群四:包括MC5、MC84、MC93、MC97、MC98、MC108、MC125、MC152、MC169、MC176和MC702。直鏈狀群體(圖版 Ⅲ-1)。角毛硬且直, 呈Brunel-I型, 相鄰角毛基部未見并行融合特征(圖版 Ⅲ-1、4)。角毛孔紋呈橢圓形(圖版 Ⅲ-8、9)。休眠孢子的殼面光滑, 初生殼上有兩個駝峰狀突起, 次生殼也有1—2個突起(圖版 Ⅲ-2、6)。本類群未見“相鄰角毛基部并行融合”, 但休眠孢子未見二叉分支結(jié)構(gòu), 因此初步鑒定為形似洛氏角毛藻C. cf.lorenzianus。

2.2 基于LSU nrDNA D1-D3區(qū)的分子系統(tǒng)學(xué)分析

以大西洋角毛藻為外類群, 構(gòu)建了基于LSU nrDNA D1-D3序列信息的ML和BI系統(tǒng)發(fā)育樹。兩者具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu), 繼而將兩者合并(圖1)。

圖1 基于核糖體大亞基LSU nrDNA部分序列的系統(tǒng)樹(以大西洋角毛藻為群外對照)Fig. 1 Molecular phylogenetic tree inferred from LSU rDNA(with C. atlanticus as outgroup)

圖1顯示, 本文的24個目標(biāo)藻株與NCBI下載的6株洛氏角毛藻和并基角毛藻, 聚類成3個大的分支,并具有相當(dāng)高的置信值(BPP=1, ML=99), 表明這30個株系呈現(xiàn)較好的單系起源。分支Ⅰ由本文的11個株系和一株分離自巴拿馬海灣(Gulf of Panama)的洛氏角毛藻(EF423437)構(gòu)成, 該分支具有較高置信值(BPP=1, ML=98)。分支Ⅱ由本文的7個株系和一株分離自加拿大芬迪灣(Fundy Bay)的形似并基角毛藻(KC986068)構(gòu)成, 也具有較高置信值(BPP=0.87, ML=99)。分支Ⅲ由本研究的6個株系,以及3株分離自意大利那不勒斯灣(Gulf of Naples)的洛氏角毛藻(EF423434、EF423435和EF423436)、1株分離自波福特海(Beaufort Sea)的并基角毛藻(JQ995413)構(gòu)成, 置信值為(BPP=0.99, ML=92)。

2.3 結(jié)合形態(tài)特征與分子系統(tǒng)的物種確認(rèn)

結(jié)合形態(tài)和分子生物學(xué)數(shù)據(jù), 本文對目標(biāo)株系進(jìn)行了物種鑒定。

首先, 圖1顯示類群一(MC1109、MC1110、MC1059和MC1060)和類群二(MC132、MC151)聚為一支(Ⅲ , BPP=0.99, ML=92), 表現(xiàn)出較為保守的遺傳多樣性, 類群一和類群二的藻株具有完全一致的LSU D1-D3序列, 更加驗證了它們屬于同一物種。鑒于類群一具有典型的“相鄰角毛基部并行融合”特征, 可以確認(rèn)為并基角毛藻。類群二雖然沒有這一特征, 但此前陳作藝等[8]已經(jīng)報道了這一特征的不穩(wěn)定性, 不能作為并基角毛藻的標(biāo)志性特征。MC 1109和MC 1110是引自陳作藝等[8]的典型并基角毛藻, 與類群一和類群二的其他藻株具有完全一致的LSU D1-D3序列, 故本文認(rèn)為類群一和類群二均為并基角毛藻。

其次, 類群三(MC150、MC153、MC786、MC794、MC1000、MC1119和MC1120)聚為一支(Ⅱ, BPP=0.87, ML=99), 具有典型的二叉分支結(jié)構(gòu)的休眠孢子, 符合目前對于洛氏角毛藻的認(rèn)知。鑒于其營養(yǎng)細(xì)胞與Grunow[19]報道的洛氏角毛藻一致,而休眠孢子則與Okamura[20]報道的休眠孢子手繪圖較為接近, 因此我們認(rèn)為類群三應(yīng)該是洛氏角毛藻。

最后, 類群四(MC5、MC84、MC93、MC97、MC98、MC108、MC125、MC152、MC169、MC176和MC702)聚為一支(Ⅰ, BPP=1.00, ML=98),其營養(yǎng)細(xì)胞符合洛氏角毛藻的特征, 但是其休眠孢子僅具有錐狀突起, 其上未見二叉分支結(jié)構(gòu), 但是與Subrahmanyan[21]報道的休眠孢子手繪圖較為接近。鑒于Okamura和Subrahmanyan對于洛氏角毛藻休眠孢子的描述不同, 而Okamura為洛氏角毛藻休眠孢子的首次記錄, 因此我們認(rèn)為類群三是洛氏角毛藻。而類群四暫定為形似洛氏角毛藻。

2.4 形態(tài)學(xué)描述

并基角毛藻Chaetoceros decipiens Cleve (圖版 Ⅰ)

Cleve, Bihang till K Svenska Vet-Akad Handlingar 1: 11, Pl. I, fig. 5a amp; b, 1873.

常由2—10個細(xì)胞形成直鏈狀群體(圖版 Ⅰ-1、2、9), 每個細(xì)胞內(nèi)含多個色素體。細(xì)胞寬環(huán)面觀呈矩形(圖版 Ⅰ-1、2、9)。相鄰細(xì)胞之間的窗孔呈長橢圓形(圖版 Ⅰ-1、2、9、10)。殼面觀呈橢圓形(圖版 Ⅰ-4)。殼套高度約占貫殼軸的三分之一(圖版 Ⅰ-1、2)。角毛硬且直, 均分布在同一個平面上, 呈Brunel-I型(圖版 Ⅰ-1、2、9)。鏈中殼面的相鄰角毛基部有或無并行融合, 融合區(qū)域或長或短(圖版 Ⅰ-1、2、9、10)。角毛上孔紋和刺交替排列成4—6排, 孔紋呈橢圓形(圖版 Ⅰ-7、8、12、13)。未見休眠孢子。

本文并基角毛藻的形態(tài)特征與陳作藝等[8]的描述基本一致。

生活類型: 海洋浮游生活。

分布: 標(biāo)本采自深圳、珠海和汕頭。本種曾報道于北大西洋和戴維斯海峽[22,23]、北美西部沿岸海域[4]、美國羅德島州納拉干塞特灣[24]、加利福尼亞灣及下加利福尼亞灣海岸[3]、南墨西哥灣[25]、丹麥沿海[6]、日本海[26]和意大利那不勒斯灣[7]。

洛氏角毛藻C. lorenzianus Grunow (圖版 Ⅱ)

Grunow, Verhandlungen der Kaiserlich-K?niglichen Zoologisch-Botanischen Gesellschaft in Wien 13:137, Pl. 5, fig. 13, 1863.

常由2—5個細(xì)胞形成直鏈狀群體(圖版 Ⅱ-1),每個細(xì)胞內(nèi)含多個色素體。細(xì)胞寬環(huán)面觀呈矩形或正方形, 窗孔呈橢圓形(圖版 Ⅱ-1、2、4), 殼面觀呈橢圓形(圖版 Ⅱ-6)。鏈端殼面中央處有一個唇形突, 外管短(圖版 Ⅱ-3)。殼面邊緣有圓弧形硅質(zhì)肋,在角毛基部與相鄰殼面的硅質(zhì)肋相接, 形成硅質(zhì)翼(圖版 Ⅱ-4), 殼套基部有一圈凹槽(圖版 Ⅱ-3)。殼面中央?yún)^(qū)域有一環(huán)紋, 環(huán)紋四周有呈放射狀排列的肋紋, 肋紋之間散布有單個小孔(圖版 Ⅱ-3、4)。角毛硬且直, 呈Brunel Ⅰ型, 相鄰角毛基部未見并行融合特征(圖版 Ⅱ-1、4)。營養(yǎng)細(xì)胞的殼面長軸為18.9—21.7 μm, 貫殼軸高12.8—19.0 μm, 窗孔高7.5—12.0 μm。角毛上孔紋和刺交替排列成4—6排, 孔紋呈水滴形(圖版 Ⅱ-7、8)。鏈端角毛比鏈中角毛稍粗, 而且前者比后者的孔紋排列密度更高。鏈端角毛密度為每10 μm含7—14個; 鏈中角毛密度為每10 μm含6—11個。

休眠孢子生于母細(xì)胞中央至一端(圖版 Ⅱ-2),初生殼呈兩錐狀突起, 錐頂著生數(shù)量眾多的二叉分枝的樹狀結(jié)構(gòu)。次生殼具1—2個低突起(圖版 Ⅱ-5)。

生活類型: 海洋浮游生活。

分布: 標(biāo)本采自珠海湛江、汕頭和香港。本種曾報道于亞德里亞海[19]、美國羅德島州納拉干塞特灣[24]、加利福尼亞灣[3]、南墨西哥灣[25]、丹麥沿海[6]和日本海[26]。

形似洛氏角毛藻C. cf. lorenzianus Grunow (圖版 Ⅲ)

Subrahmanyan. A systematic account of the mar-ine plankton diatoms of the Madras coast p. 131, fig.198-199, 202-204, 206-209, 1946.

常由2—10個細(xì)胞形成直鏈狀群體(圖版 Ⅲ-1),每個細(xì)胞內(nèi)含多個色素體。細(xì)胞寬環(huán)面觀呈矩形,窗孔呈橢圓形(圖版 Ⅲ-1、2、4), 殼面觀呈寬橢圓形。鏈端殼面中央有一個唇形突, 外管短。殼面邊緣有隆起的圓弧形硅質(zhì)肋(圖版 Ⅲ-4), 鏈中殼面邊緣角毛基部, 有一個突起的硅質(zhì)翼(圖版 Ⅲ-5)。殼面中央?yún)^(qū)域有一環(huán)紋, 環(huán)紋四周有放射狀排列的肋紋, 肋紋間沒有孔紋(圖版 Ⅲ-8)。殼套基部有一環(huán)凹槽(圖版 Ⅲ-3)。角毛硬, 呈Brunel Ⅰ型, 相鄰角毛基部未見并行融合特征(圖版 Ⅲ-1、4)。角毛上孔紋和刺交替排列成4—6排, 孔紋呈橢圓形(圖版 Ⅲ-8、9), 密度為每10 μm含11—17個。營養(yǎng)細(xì)胞的殼面長軸為17.2—37.0 μm, 貫殼軸高9.1—22.2 μm, 窗孔高6.4—15. 0 μm。

休眠孢子位于母細(xì)胞中央, 環(huán)帶與母細(xì)胞環(huán)帶相接觸, 上下殼面與母細(xì)胞殼面接觸或脫離(圖版Ⅲ-2)。初生殼上有兩個駝峰狀突起, 次生殼也有1—2個突起(圖版 Ⅲ-6)。休眠孢子的殼面光滑, 未見二叉分支的附屬結(jié)構(gòu)。

生活類型: 海洋浮游生活。

分布: 標(biāo)本采自湛江、深圳、珠海。本種曾報道于馬德拉斯沿海[21]。

3 討論

3.1 典型并基角毛藻的確認(rèn)

1873年Cleve首次報道了并基角毛藻[22], 形態(tài)學(xué)描述中沒提及“角毛基部并行融合”這一特征, 但模式標(biāo)本的手繪圖中, 這一特征清晰可見, 在此后的研究中, “角毛基部并行融合”被認(rèn)為是并基角毛藻的標(biāo)志性特征[2,3,24], 顯著區(qū)別與其他相似物種。

陳作藝等[8]對并基角毛藻開展了針對性研究,認(rèn)為“角毛基部并行融合”具有不穩(wěn)定性, 這一特征不能作為并基角毛藻的專屬特征。本文對典型并基角毛藻(MC1109和MC1110)和本研究的類群一、類群二進(jìn)行了比較, 發(fā)現(xiàn)以下主要結(jié)論。首先,除了“角毛基部并行融合”之外, 類群一(MC1059和MC1060)和類群二(MC132和MC151)與典型并基角毛藻具有完全一致的形態(tài)特征。其次, 類群一和類群二與典型并基角毛藻(MC1109和MC1110)具有完全一致的LSU nrDNA D1-D3序列, 表現(xiàn)出保守的遺傳多樣性。綜上所述, 本文支持陳作藝等[8]的研究結(jié)論, 認(rèn)為“角毛基部并行融合”并不是穩(wěn)定特征,不宜繼續(xù)作為并基角毛藻的標(biāo)志性特征。

3.2 典型洛氏角毛藻現(xiàn)存的疑問

雖然本文初步認(rèn)定了洛氏角毛藻, 以及一個形似洛氏角毛藻的物種, 但結(jié)合歷史報道, 關(guān)于洛氏角毛藻仍存在較多疑問。

洛氏角毛藻首次報道于亞德里亞海[19], 原始文獻(xiàn)僅提供了2個細(xì)胞的短鏈?zhǔn)掷L圖(Grunow 1863, p.157, Pl. 5, fig. 13)。10年之后, Cleve[22]報道了并基角毛藻, 并與洛氏角毛藻進(jìn)行了形態(tài)學(xué)比較。他認(rèn)為兩者具有較為相似的形態(tài)學(xué)特征, 主要區(qū)別是:并基角毛藻的角毛孔紋較細(xì)密, 而洛氏角毛藻的角毛孔紋更加粗大。此后也有學(xué)者開展了角毛孔紋的對比分析[5], 通過對培養(yǎng)株系的連續(xù)形態(tài)學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)角毛具有粗大孔紋的物種, 其角毛基部通常無并行融合; 而角毛基部具有并行融合的物種, 其角毛孔紋多排列緊密。這一結(jié)論在一定程度上支持了Cleve的觀點。但是由于技術(shù)手段的缺陷, 當(dāng)時并未給出明確的孔紋數(shù)據(jù)。角毛孔紋曾被認(rèn)為是相似種類之間的有效區(qū)別依據(jù)[27,28], 但其是否可作為洛氏角毛藻和并基角毛藻之間的有效區(qū)分特征,目前由于基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的缺乏, 還不能做出判斷。在今后的研究中, 需要針對洛氏角毛藻原始標(biāo)本開展數(shù)據(jù)采集工作, 正本清源, 這對后續(xù)的種源廓清工作具有重要的背景價值。

此外, 休眠孢子也曾被做為洛氏角毛藻和并基角毛藻之間的重要區(qū)別特征[2,3,6,26]。但是本文經(jīng)過對歷史文獻(xiàn)的收集, 也發(fā)現(xiàn)了一些疑問。洛氏角毛藻休眠孢子最早報道于日本, 其手繪圖(Okamura 1911, Pl. Ⅺ, fig. 31a-b)[20]顯示休眠孢子位于母細(xì)胞內(nèi), 初生殼有2個錐狀突起, 頂生多個二叉分支[20],但該休眠孢子的貫殼軸明顯延長, 與密特拉角毛藻的休眠孢子較為相似。由于該報道來自于自然樣品, 也未提供營養(yǎng)細(xì)胞的任何資料, 因此無法判斷其是否就是洛氏角毛藻的休眠孢子, 不能排除錯誤鑒定的可能。之后, Subrahmanyan[21]也提供了洛氏角毛藻休眠孢子的手繪圖(Subrahmanyan 1946, p.132, fig. 198)[21], 其殼面僅有錐狀突起, 未見末端的二叉分叉結(jié)構(gòu)。但是與此同時, 目前沿用最為廣泛的資料來自于Hasle和Syvertsen描述的洛氏角毛藻休眠孢子(Hasle amp; Syvertsen 1997, p. 205, Pl. 42,fig.a)[2], 其貫殼軸較短, 與殼面長軸基本接近。然而Hasle和Syvertsen[2]提供的也是手繪圖, 沒有提供其他更為有效的信息參考。本文共觀察到2類休眠孢子, 類群三的休眠孢子在形態(tài)上更接近于Okamura[20]的報道, 類群四的休眠孢子則更為接近于Subrahmanyan[21]的報道。類群三和類群四的休眠孢子存在明顯的形態(tài)差異。鑒于休眠孢子在角毛藻分類學(xué)中重要應(yīng)用價值, 以及這2個類群之間存在的顯著遺傳差異, 我們認(rèn)為它們應(yīng)該是2個不同的物種。從目前的認(rèn)知體系判斷, 類群三更為接近洛氏角毛藻, 而類群四應(yīng)該是新的分類單位。

綜上所述, 哪類休眠孢子才是洛氏角毛藻的休眠孢子？目前尚不能判斷。在后續(xù)的研究中, 首先需要在洛氏角毛藻營養(yǎng)細(xì)胞的模式標(biāo)本采樣地建立其培養(yǎng)株系, 然后開展休眠孢子的誘導(dǎo)和比較研究。只有首先確定了什么是真正的洛氏角毛藻, 才能認(rèn)識其休眠孢子的形態(tài)信息, 繼而廓清潛在的物種多樣性。

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PRELIMINARY STUDY ON THE SPECIES DIVERSITY OF CHAETOCEROS LORENZIANUS COMPLEX FROM GUANGDONG COASTAL WATERS

ZHAI Meng-Yi, ZHU Su-Ying, CHEN Zuo-Yi and LI Yang
(Guangzhou Key Laboratory of Subtropical Biodiversity and Biomonitoring, Guangdong Provincial key Laboratory of Healthy and Safe Aquaculture, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

In order to understand the diversity ofChaetoceros lorenzianuscomplex and divideC. decipiensandC.lorenzianusclearly, Guangdong coast was chosen as a case studied area and a total of 22 monoclonal strains withinC.lorenzianuscomplex were established in this study. Using optical and electron microscopy, their morphology was observed through life cycle, including vegetative cells and resting spores. Hypervariable D1-D3 region of nuclear ribosomal large subunit encode gene for each strain was amplified and their molecular systematics was studied. Following conclusions were made based on the combination of morphology and molecular data. The results showed that the fusing setae base was not a steady feature and could not be considered as an exclusive characteristic forC. decipiens,which supporting the opinion from Chenet al. (2017). The strains with similar morphology withC. lorenzianuslocated into two clades, and it indicated the presence of unexplored species inC. lorenzianuscomplex. The strains in one clade shared most similar morphology with present-knownC. lorenzianus, and those in another clade were distinct in the morphologies of setae poroid and resting spore. When compared wtihC. lorenzianusdescriptions in previous studies,confusion and disorder forC. lorenzianusdelineation were found. For example, there were contradictory and competing descriptions on the shape of resting spore and the presence of dichotomous branches on the primary valve. In future studies, the re-examination on typeC. lorenzianusmaterials, including the vegetative cells and resting spores, is proposed to be conducted preferentially, and then the true diversity might be achieved.

Chaetoceros lorenzianus;Chaetoceros decipiens; Species diversity; Resting spore; Guangdong coastal waters

Q949.27

A

1000-3207(2017)06-1282-09

2016-11-28;

2017-04-05

國家自然科學(xué)基金(31570205和31370235); 廣東省科技計劃項目(2015A030401084)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31570205, 31370235); Guangdong Province Science and Technology Program (2015A030401084)]

翟夢怡(1991—), 女, 廣東河源人; 碩士研究生; 主要從事藻類學(xué)研究。E-mail: zhaimengyi@m.scnu.edu.cn

李揚(yáng), E-mail: liyang@scnu.edu.cn

10.7541/2017.159

圖版 Ⅰ Plate Ⅰ

圖版 ⅡPla t e Ⅱ

圖版 ⅢPlate Ⅲ