梁 葉 歐陽凱 許歡歡 楊家新

(南京師范大學生命科學學院, 南京 210023)

銅綠微囊藻對輪蟲生命表參數(shù)和表型特征的影響

梁 葉 歐陽凱 許歡歡 楊家新

(南京師范大學生命科學學院, 南京 210023)

為評價銅綠微囊藻的有毒(Microcystin-producingMicrocystis aeruginosa)、無毒(Microcystin-freeM.aeruginosa)品系對輪蟲種群增長和表型特征的影響, 研究探討了萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)在不同微囊藻溶液中的生活史參數(shù)及形態(tài)變化。實驗中各處理組單位體積總含碳量為(20.61±0.15) g C/mL, 以使輪蟲獲得等碳量的食物供應。實驗組輪蟲分別用蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)、有毒和無毒微囊藻溶液單獨投喂, 并用有毒、無毒藍藻菌分別與不同綠藻的混合液投喂。生命表實驗結果表明, 不同微囊藻混合液投喂的輪蟲凈生殖率R0(F=102.71,df=32,P＜0.001)、世代時間T(F=17.05,df=32,P＜0.001)和內(nèi)稟增長率rm(F=18.89,df=32,P＜0.001)與對照組相比降低1.36%—210.34%。側棘刺長(F=28.18,df=65,P＜0.001)和游泳速度(F=181.69,df=65,P＜0.001)下降2.63%—39.07%, 輪蟲體長(F=690.04,df=65,P＜0.001)變化顯著。與綠藻投喂的輪蟲參數(shù)值相比, 輪蟲的生命表參數(shù)和表型特征變化規(guī)律隨微囊藻溶液濃度改變。萼花臂尾輪蟲受到銅綠微囊藻脅迫時, 生長繁殖受到抑制并通過改變自身形態(tài)以抵御不利的生存環(huán)境。

銅綠微囊藻; 萼花臂尾輪蟲; 凈生殖率; 世代時間; 內(nèi)稟增長率; 表型特征

銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)是最為常見的水華藍藻[1]。有毒(Microcystin-producingM.aeruginosa)和無毒微囊藻(Microcystin-freeM. aeruginosa)共存于天然水域生態(tài)系統(tǒng)中[2]。有毒微囊藻產(chǎn)生的內(nèi)源性毒素可引起魚類、鳥類和無脊椎動物中毒死亡[3]。已有關于藍藻及其毒素的描述中,銅綠微囊藻產(chǎn)生的微囊藻毒素(Microcystin)對水體環(huán)境和浮游動物種群增長的危害備受關注[4]。

輪蟲是淡水浮游動物組成的主要類群, 在食物鏈中起至關重要的作用[5]。臂尾輪蟲常被選為水生態(tài)毒理學研究的受試動物[6]。部分輪蟲的形態(tài)在自然水環(huán)境中, 隨理化因子、捕食者釋放的化學信息素、食物組分等的變化而發(fā)生變化, 具有表型可塑性[7]。表型可塑性使得輪蟲可根據(jù)環(huán)境的特點調(diào)整自身的適應方式, 最大限度地提高自身的適合度[7]。

國內(nèi)外利用輪蟲生活史特征進行毒理學研究的報道較多, 但大多數(shù)研究局限在食物種類、豐度和污染因子對輪蟲生活史、繁殖策略和休眠卵孵化等方面[8—11]。本文在研究微囊藻對臂尾輪蟲生活史特性影響的基礎上, 將有毒和無毒銅綠微囊藻分別與不同綠藻混合, 以淡水萼花臂尾輪蟲(Brachionus calyciflorus)為受試動物, 研究單一有毒、無毒微囊藻及不同微囊藻混合液對輪蟲種群增長參數(shù)和表型特征的影響, 以期為臂尾輪蟲屬的生態(tài)毒理學參數(shù)研究提供基礎數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 輪蟲的來源與培養(yǎng)

實驗選用美國喬治亞理工學院Snall教授饋贈本實驗室克隆培養(yǎng)多年以上的萼花臂尾輪蟲品系為實驗對象。利用休眠卵剛孵出的幼體作為起始測試動物。輪蟲于(25±1)℃的恒溫光照培養(yǎng)箱中進行群體培養(yǎng)。光照強度為2500 lx, 周期為12 L∶12 D。輪蟲培養(yǎng)基為改良后的EPA (CaSO4·2H2O 60 mg/L;NaHCO396 mg/L; MgSO4·7H2O 123 mg/L; KCl 4 mg/L, pH 7.5), 其配制方法同楊家新[12]。

1.2 藻種來源與培養(yǎng)

實驗用綠藻為蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosaFACHB10)和斜生柵藻(Scenedesmus obliquusFACHB12); 藍藻為有毒銅綠微囊藻(Microcystin-producingM. aeruginosaPCC7806)和無毒銅綠微囊藻(Microcystin-freeM. aeruginosaFACHB927)。實驗藻種由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供。綠藻培養(yǎng)基為BBM, 藍藻培養(yǎng)基為BG11[13]。置于(25±1)℃的恒溫光照培養(yǎng)箱中進行充氣培養(yǎng)。選取進入指數(shù)增長期的藍藻和綠藻進行離心(6000×g, 15min, 4℃)并用EPA稀釋到所需濃度(3×106cells/mL)。

1.3 實驗設計

食物組分包括: (1)單一藻液[含碳量: (20.61±0.15) μg C/mL]: 100%蛋白核小球藻(C), 100%斜生柵藻(S), 100%有毒銅綠微囊藻(M1), 100%無毒銅綠微囊藻(M2); (2)兩種藻的混合液[總含碳量:(20.61±0.15) μg C/mL]: 50%小球藻+50%柵藻(CS),50%小球藻+50%有毒微囊藻(CM1), 50%小球藻+50%無毒微囊藻(CM2), 50%柵藻+50%有毒微囊藻(SM1), 50%柵藻+50%無毒微囊藻(SM2); (3)三種藻的混合液[總含碳量: (20.61±0.15) μg C/mL]:33.3%小球藻+33.3%柵藻+33.3%有毒微囊藻(CSM1), 33.3%小球藻+33.3%柵藻+33.3% 無毒微囊藻(CSM2) (圖1)。當配制藻溶液時, 每種藻溶液而非每種藻細胞使用碳平衡原理。實驗中各處理組單位體積總含碳量保持為(20.61±0.15) g C/mL, 以使輪蟲獲得等碳量的食物供應。本實驗以單獨投喂蛋白核小球藻的輪蟲參數(shù)值為對照組。

生命表實驗將每組10只剛孵出的非混交輪蟲幼體(＜2h)分別放入6孔板中用藻類溶液投喂。每組設置6個重復實驗(n=6)。每隔12h記錄存活母體數(shù)和新生幼體數(shù)并投喂, 同時將新生幼體從培養(yǎng)體系中移除, 每24h更換培養(yǎng)基, 實驗至初始投入的輪蟲母體全部死亡。輪蟲的體長、側棘刺長于倒置光學顯微鏡40倍鏡下用Cellsens Standard 1.9軟件(Olympus Optical Co., Ltd., Tokyo, Japan)拍照后測定。記錄10s內(nèi)輪蟲的運動軌跡, 根據(jù)軌跡的斜率計算輪蟲的游泳速度。

1.4 生命表計算方法

依據(jù)生命表實驗數(shù)據(jù)計算萼花臂尾輪蟲主要生活史參數(shù)[14]:

凈生殖率(R0): 種群經(jīng)過一個世代后的凈增長率

世代時間(T): 親代出生到子代出生所經(jīng)歷的時間

圖1 實驗流程Fig. 1 Schematic diagram of the experiment

內(nèi)稟增長率(rm): 種群特定實驗條件下的最大增長率

式中:x為輪蟲年齡;lx為x年齡組存活個體百分數(shù);mx為x年齡組平均每個雌體所產(chǎn)雌性后代數(shù)。

1.5 統(tǒng)計分析

本實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢測符合正態(tài)分布, 各參數(shù)值使用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行單因子方差分析(One-Way ANOVA), 最小顯著差法(LSD)進行比較, 差異顯著程度設置為P＜0.05。所有處理組之間兩兩比較的結果用字母標注法標出。生命表各參數(shù)圖使用繪圖軟件SigmaPlot 12.5進行制作。

2 結果

2.1 有毒、無毒銅綠微囊藻對萼花臂尾輪蟲生命表參數(shù)的影響

不同微囊藻溶液中輪蟲凈生殖率變化由圖2可看出, 不同微囊藻混合液投喂時, 輪蟲凈生殖率(R0)顯著下降(F=102.71,df=32,P＜0.001)。100%有毒微囊藻溶液(M1)、50%有毒微囊藻混合液(CM1、SM1) 或33.3%有毒微囊藻混合液(CSM1)投喂時, 輪蟲不產(chǎn)子代(0＜R0＜1)。R0值在有毒微囊藻混合液中降低95.8%—98.1%。50%無毒微囊藻與50%柵藻混合液(SM2)投喂的輪蟲凈生殖率也受到抑制, 輪蟲不產(chǎn)子代(0＜R0＜1); 50%無毒微囊藻與50%小球藻混合液(CM2)投喂的輪蟲雖產(chǎn)生子代(R0＞1), 但R0值仍低于對照組。33.3%無毒微囊藻混合液(CSM2)投喂的輪蟲所產(chǎn)子代數(shù)顯著多于其余微囊藻處理組和柵藻處理組(P＜0.001)。輪蟲用100%微囊藻溶液、50%微囊藻混合液或33.3%有毒微囊藻混合液投喂時,R0值均顯著低于C, CS,CSM2組(P＜0.001)。綠藻的混合液對輪蟲凈生殖率的影響不顯著(P=0.102＞0.05), 小球藻與柵藻混合液(CS)投喂的輪蟲R0值(12.54±1.24) ind.則接近對照組。

不同微囊藻溶液中輪蟲世代時間變化單因子方差分析結果表明微囊藻與不同綠藻混合時,其對輪蟲世代時間(T)產(chǎn)生顯著影響(F=17.05,df=32,P＜0.001) (圖3)。微囊藻的加入降低了輪蟲的世代時間, 而小球藻和柵藻混合液投喂則可顯著延長輪蟲的世代時間。與柵藻投喂的輪蟲世代時間相比, 50%和100%有毒微囊藻投喂的輪蟲世代時間降低, 而33.3%無毒微囊藻投喂的輪蟲T值則顯著增加。與對照組相比, 輪蟲世代時間在M2, SM2組降低27.9%—30.9%。33.3%有毒微囊藻投喂的輪蟲世代時間降低15.3% (P=0.04＜0.05)。50%有毒微囊藻投喂的輪蟲T值則顯著降低38.5%—46.2%(P＜0.001)。在100%有毒微囊藻溶液中, 輪蟲世代時間顯著降低54.8%至最小值(40.35±14.49)h(P＜0.001), 表明單一有毒微囊藻溶液對萼花臂尾輪蟲世代時間的抑制作用最大。

圖2 不同處理組中萼花臂尾輪蟲凈生殖率變化Fig. 2 Changes of net reproduction rate of B. calyciflorus in different treatments

圖3 不同處理組中萼花臂尾輪蟲世代時間變化Fig. 3 Changes of generation time of B. calyciflorus in different treatments

不同微囊藻溶液中輪蟲內(nèi)稟增長率變化不同微囊藻混合液投喂的輪蟲內(nèi)稟增長率(rm)顯著降低(F=18.89,df=32,P＜0.001) (圖4)。50%有毒微囊藻投喂的輪蟲內(nèi)稟增長率顯著低于柵藻處理組的rm值(P＜0.001)。33.3%無毒微囊藻投喂的輪蟲rm顯著高于100%柵藻投喂的參數(shù)值(P=0.004＜0.01)。與對照組相比, 33.3%無毒微囊藻投喂的輪蟲rm值降低48.3% (P=0.03＜0.05)。100%微囊藻, 50%微囊藻和33.3%有毒微囊藻投喂的輪蟲rm值降低82.8%—182.8% (P＜0.001)。rm在M1、M2、CM1、SM1、SM2和CSM1組出現(xiàn)負值(–1＜rm＜0)。50%有毒微囊藻投喂的輪蟲rm值顯著降低 162.1%—210.3%。rm最小值(–0.03±0.02/d)出現(xiàn)在CM1處理組。這些結果證實有毒微囊藻對輪蟲內(nèi)稟增長率的負面影響更大, 輪蟲種群增長受到抑制。

2.2 有毒、無毒銅綠微囊藻對萼花臂尾輪蟲表型特征的影響

表1給出了萼花臂尾輪蟲側棘刺長、體長以及游泳速度數(shù)據(jù)。不同微囊藻混合液顯著影響輪蟲的表型特征(F=28.18,df=65,P＜0.001)。100%有毒微囊藻溶液可促使輪蟲側棘刺長增加(P=0.01＜0.05), 而100%無毒微囊藻溶液、50%微囊藻混合液和33.3%微囊藻混合液則抑制輪蟲的棘刺生長(P＜0.001)。與柵藻投喂的輪蟲側棘刺長相比,100%或33.3%有毒微囊藻混合液投喂的輪蟲側棘刺長顯著增加, 而50%有毒微囊藻混合液投喂的輪蟲側棘刺長則減小。

輪蟲體長在不同濃度的微囊藻混合液中變化顯著(F=690.04,df=65,P＜0.001)。與單一綠藻投喂的輪蟲體長相比, 33.3%微囊藻混合液以及50%柵藻與50%微囊藻的混合液對輪蟲體長增加有促進作用, 輪蟲體長在SM1、SM2、CSM1和CSM2組顯著增加(P＜0.001)。100%微囊藻溶液以及50%小球藻與50%微囊藻的混合液對輪蟲體長則有負面影響, 輪蟲體長在M1、M2、CM1和CM2組則顯著減少(P＜0.001)。

圖4 不同處理組中萼花臂尾輪蟲內(nèi)稟增長率變化Fig. 4 Changes of intrinsic growth rate of B. calyciflorus in different treatments

表1 萼花臂尾輪蟲體長、側棘刺長和游泳速度變化Tab. 1 Changes of body length, posterolateral spine length andswimming speed of B. calyciflorus

微囊藻對輪蟲游泳速度具有顯著負面影響(F=181.69,df=65,P＜0.001)。與對照組相比, 輪蟲游泳速度在33.3%、50%和100%有毒微囊藻混合液中降低18.0%—39.1%, 而在無毒微囊藻混合液中降低5.9%—22.7%(P＜0.001)。與柵藻投喂的輪蟲游泳速度相比, 輪蟲游泳速度在100%微囊藻溶液以及50%柵藻和50%有毒微囊藻混合液中下降, 而在33.3%微囊藻混合液以及50%小球藻和50%微囊藻的混合液中則顯著增加(P＜0.001)。

3 討論

不同微囊藻混合液投喂的萼花臂尾輪蟲生命表參數(shù)值較低, 種群密度下降。以33.3%、50%和100%濃度的有毒微囊藻投喂的輪蟲凈生殖率R0,世代時間T和內(nèi)稟增長率rm均低于小球藻投喂的輪蟲參數(shù)值, 表明有毒微囊藻含有的微囊藻毒素對輪蟲的生長繁殖有負面的影響[3]。無毒微囊藻與柵藻混合液投喂的輪蟲凈生殖率受到抑制, 輪蟲不產(chǎn)子代。輪蟲凈生殖率下降的原因是柵藻內(nèi)的有毒物質(zhì)抑制了輪蟲的生長繁殖[15]。此外, 無毒微囊藻缺乏脂肪酸及其他脂類物質(zhì), 輪蟲因體內(nèi)缺乏營養(yǎng)而生殖能力下降[16]。33.3%的較低濃度無毒微囊藻混合液投喂比柵藻投喂的輪蟲R0、T和rm值大, 證實無毒微囊藻與小球藻和柵藻的混合液對輪蟲生長繁殖的影響比柵藻溶液對其影響小。以上結論驗證了銅綠微囊藻對輪蟲的種群生長不利, 與Liang等[17]發(fā)現(xiàn)微囊藻對萼花臂尾輪蟲的生活策略和攝食強度有負面影響, 輪蟲生命表參數(shù)值下降的結論一致。

輪蟲用不同濃度的微囊藻溶液投喂時通過改變自身側棘刺長、體長和游泳速度來抵御不利的生存環(huán)境。在微囊藻混合液中, 輪蟲側棘刺長和游泳速度降低而其體長變化規(guī)律隨溶液濃度改變。50%微囊藻和50%小球藻混合液投喂時, 輪蟲體長變短; 33.3%微囊藻或50%微囊藻和50%柵藻混合液投喂時, 輪蟲體長增加。在單一微囊藻溶液中,輪蟲體長和游泳速度降低而其側棘刺長變化規(guī)律隨微囊藻品系改變。100%無毒微囊藻投喂時, 輪蟲側棘刺長變短; 100%有毒微囊藻投喂時, 輪蟲側棘刺長增加。輪蟲在單一和混合微囊藻溶液中游泳速度下降的原因是微囊藻毒性物質(zhì)可抑制輪蟲的行為表型。輪蟲體長在單一微囊藻溶液中下降證實微囊藻對輪蟲生長不利從而體長減短。不同綠藻和微囊藻混合液投喂的輪蟲體長變化顯著, 表明綠藻對輪蟲生長的影響差異較大, 進而使其體長對微囊藻混合液產(chǎn)生不同的響應。輪蟲側棘刺長在微囊藻混合液和單一無毒微囊藻溶液中下降, 表明微囊藻對輪蟲的棘刺生長不利。萼花臂尾輪蟲在單一有毒微囊藻脅迫下, 其側棘刺長增加。棘刺的增長將會消耗輪蟲自身較多能量, 從而導致用于生殖的能量減少, 二者表現(xiàn)出一種負偶聯(lián)的關系[18]。這些結果證實臂尾輪蟲在受到環(huán)境脅迫后會產(chǎn)生防御性的表型[6]。殷旭旺等指出臂尾輪蟲遇到捕食壓力或環(huán)境因素的脅迫時也會通過刺激棘刺的生長來改變自身的表型特征[7]。

銅綠微囊藻對輪蟲生命表參數(shù)和表型特征的影響與微囊藻的品系有關。實驗室培養(yǎng)的微囊藻主要是單細胞或成對的細胞, 這排除了來自微囊藻其他生長形式的干擾[19]。Downing等[20]證實有毒微囊藻PCC7806能產(chǎn)生microcystin-LR。通過高效液相色譜法(HPLC)測定單個有毒微囊藻細胞的microcystin-LR含量為3.6 pg/cell[21]。不同濃度的有毒微囊藻PCC7806被攝食后, 輪蟲體內(nèi)含有microcystin-LR[17]。有毒微囊藻和綠藻的混合液改變了輪蟲體長并抑制其棘刺生長和游泳速度。輪蟲種群生長會受到其牧食的有毒微囊藻所釋放的藻毒素的抑制。Geng和Xie[22]指出微囊藻PCC7820能抑制輪蟲的種群生長和繁殖。輪蟲牧食無毒微囊藻FACHB927后, 體內(nèi)缺乏營養(yǎng)物質(zhì), 使其生長受到抑制。這一現(xiàn)象驗證了無毒微囊藻FACHB927缺乏omega-3脂肪酸及其他對輪蟲種群生長十分重要的脂類物質(zhì)的報道[16,23]。與綠藻溶液投喂的輪蟲參數(shù)值相比, 有毒或無毒微囊藻混合液使萼花臂尾輪蟲的生長繁殖參數(shù)和表型特征產(chǎn)生不同的響應。Zhao等[24]發(fā)現(xiàn)將有毒微囊藻PCC7806與柵藻混合投喂時, 輪蟲種群密度急劇下降, 而將無毒微囊藻FACHB927與柵藻混合投喂時, 輪蟲對無毒微囊藻混合液表現(xiàn)出較大的耐受性。

Li等[25]提出隨著綠藻濃度的增加, 浮游動物獲取的食物中有毒微囊藻所占的比例相對下降, 毒害作用減弱。耿紅等[26]認為微囊藻中加入綠藻后, 微囊藻毒素的性質(zhì)部分被綠藻細胞內(nèi)的化合物所改變, 從而降低毒性。然而在本研究中, 食物中加入綠藻對微囊藻毒害作用的減弱在萼花臂尾輪蟲中并沒有明顯體現(xiàn), 表明這種減弱作用隨輪蟲種類的不同而具有特異性。Geng等[22]也發(fā)現(xiàn)用有毒微囊藻PCC7820投喂萼花臂尾輪蟲和紅臂尾輪蟲(Brachionus rubens)后, 兩品系輪蟲對有毒微囊藻表現(xiàn)出不同的耐受性。

綜上所述, 有毒、無毒銅綠微囊藻能顯著抑制萼花臂尾輪蟲生命表參數(shù)。輪蟲在不同微囊藻溶液中能產(chǎn)生防御性的表型以響應微囊藻的脅迫。鑒于藍藻水華暴發(fā)時水體中理化因子(如: 溫度、pH、鹽度等)發(fā)生變化, 進而影響輪蟲種群的結構[27—28]。研究者認為溫度的升高會加劇微囊藻對輪蟲種群的抑制作用[29]。溫度及其他可食性綠藻對輪蟲和微囊藻的相互作用起到協(xié)同或拮抗作用, 從而影響食物鏈中高營養(yǎng)級的其他生物種類[24,29,30]。因此, 深入開展2種及以上環(huán)境因子同時作用的研究將進一步揭示銅綠微囊藻和藍藻混合物對輪蟲種群的影響。

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EFFECTS OF MICROCYSTIS AERUGINOSA ON THE LIFE-TABLE PARAMETERS AND PHENOTYPIC TRAITS OF ROTIFERS

LIANG Ye, OUYANG Kai, XU Huan-Huan and YANG Jia-Xin
(Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China)

To evaluate the effects of microcystin-producing and microcystin-freeMicrocystis aeruginosaon the population growth and phenotypic traits of rotifers, we discussed the responses of life history parameters and morphology ofBrachionus calyciflorusto differentM. aeruginosasolutions. In order to ensure that rotifers obtained food supply from same carbon content, the total carbon content was maintained at a level of (20.61±0.15) μg C/mL per unit volume in every treatment group. Rotifers were fed onChlorella pyrenoidosa,Scenedesmus obliquus, microcystin-producing and microcystin-freeM. aeruginosa, and mixtures of green algae with toxic and nontoxic cyanobacteria, respectively. Compared with the control group, the life-table experimental results showed that net reproduction rateR0(F=102.71,df=32,P＜0.001), generation timeT(F=17.05,df=32,P＜0.001) and intrinsic growth raterm(F=18.89,df=32,P＜0.001) of rotifers decreased 1.36%—210.34% in the groups fed with differentM. aeruginosamixtures. Posterolateral spine length(F=28.18,df=65,P＜0.001) and swimming speed (F=181.69,df=65,P＜0.001) ofB.calyciflorusdeclined 2.63%—39.07%, and the rotifer body length (F=690.04,df=65,P＜0.001) changed significantly. The life table parameters and phenotypic traits of rotifers changed with concentrations ofMicrocystissolutions compared with those in groups fed with green algae. Under the stress ofM. aeruginosa, the growth and reproduction ofB.calycifloruswere inhibited, and its morphology changed to defend adverse living environment.

Microcystis aeruginosa;Brachionus calyciflorus; Net reproduction rate; Generation time; Intrinsic growth rate; Phenotypic traits

Q178.1

A

1000-3207(2017)06-1362-07

2016-12-22;

2017-04-26

國家自然科學基金(31772458和31272388); 江蘇省水產(chǎn)三新工程項目(Y2017-35)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31772458, 31272388); Three Term Project of Aquiculture of Jiangsu Province, China (Y2017-35)]

梁葉(1984—), 女, 江蘇淮安人; 博士; 主要從事浮游動物生態(tài)學研究。E-mail: liangye_8888@126.com

通信作者: 楊家新(1964—), 男, 河南信陽人; 教授, 博士生導師; 主要從事動物學和浮游動物生態(tài)學研究。E-mail: yangjx@njnu.edu.cn

10.7541/2017.168