李冬梅+趙超藝+劉小飛

摘 要 以海南三七根莖芽基部為外植體，對根莖芽基部進行初代誘導、繼代增殖、生根壯苗培養(yǎng)，并對其組培苗移栽基質進行篩選，建立海南三七根莖芽基部的組培快繁技術體系。結果表明：根莖芽基部最佳誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁；繼代增殖比較合適的培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0～8.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁；生根最佳的培養(yǎng)基為MS+ NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%香蕉泥+活性碳1.0 g/L；組培苗移栽合適的基質為進口泥炭、紅壤和腐葉土的混合基質或純進口泥炭。

關鍵詞 海南三七 ；山奈屬 ；基部 ；根莖 ；組織培養(yǎng)

中圖分類號 S567.23+6 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.09.007

Rapid Propagation of Kaempferia rotunda via Basal Part of Rhizome Buds

LI Dongmei ZHAO Chaoyi LIU Xiaofei

（Environmental Horticulture Research Institute，

Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640）

Abstract The basal part of rhizome buds of Kaempferia rotunda were used as explants which were induced into calli， subcultured for proliferation and rooted to produce rooted strong plants， and their mediums for tissue culture and transplanting were screened to establish a rapid propagation system for K. rotunda. The results showed that the inducing medium MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3% sucrose + cara rubber powder 10.0 g/L+10% coconut milk was optimum for the basal parts of rhizome buds. The optimum subculture medium for proliferation was MS+6-BA 3.0-8.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3% sucrose + cara rubber powder 10.0 g/L+10% coconut milk. The optimum rooting medium was MS+NAA 0.10 mg/L+3% sucrose + cara rubber powder 10.0 g/L+10% mashed banana + activated carbon 1.0 g/L. The optimum transplanting substrate included red soil， humus soil and imported peat， or pure imported peat.

Keywords Kaempferia rotunda ； Kaempferia ； base ； rhizome ； propagation

姜科（Zingiberaceae）植物可通過種子有性繁殖和切分根莖營養(yǎng)繁殖[1]。然而，有些種類是自交不親和的，有些是多倍體，均不能結種子，只能通過根莖繁殖[1]。切分根莖分株時，不要分得太小，一般不要少于3～4顆，太少會導致生長緩慢或死亡，同時需要帶有新生的塊莖，新分開的塊莖需去掉所有莖、葉，以減少水分的流失[1]。有些屬的植物可以通過莖桿扦插來繁殖，如閉鞘姜屬、舞花姜屬、姜花屬、姜屬的部分種類，將成熟的莖桿切成帶3～4個節(jié)的莖段，直立插入沙土中2節(jié)深，或將莖段平放，用沙土稍微覆蓋，保持濕潤和遮蔭，一段時間后，其節(jié)上的芽就會萌蘗形成小植株，稍大后分離栽培[1]。

海南三七（Kaempferia rotunda）屬于姜科山奈屬（Kaempferia）植物，分布于廣東、廣西、云南、臺灣及亞洲南部至東南部[2]，其葉叢生，葉片長橢圓形，葉面淡綠色，具暗綠色斑紋，不耐霜凍，冬季地上部分枯死；花先于葉直接從根莖抽出，頭狀花序具4～6朵花（白色），唇瓣較大（紫紅色），花期3～4個月；根莖有消腫止痛的功效。觀葉類，株形好，葉漂亮，花晶瑩美麗，在夏秋季節(jié)可作為觀賞價值高的室內觀葉植物[1-4]。由于海南三七不結果，所以不能進行有性繁殖，而且它也沒有莖桿，因此，只能采用上述的切分根莖進行營養(yǎng)繁殖。因為母本量不足，切分根莖分株繁殖速度有限，而且對母株的損傷也很大，短期內得不到大量植株。

近年來，不少科研工作者對海南三七的揮發(fā)性成分、保育、花粉發(fā)育、傳粉、組培快繁等方面進行了研究，并取得了較大進展[5-10]。劉盼盼[9]研究表明，海南三七最佳的外植體為組培苗的幼芽或莖尖，將其接種于MS+6-BA 3.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L的培養(yǎng)基中，20 d左右有愈傷組織產生，30 d左右有絨毛狀根生成；但研究也發(fā)現(xiàn)，接種到2種培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0/3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L上誘導，均只有10%被誘導成苗。吳丹[10]研究表明，海南三七無菌苗的假莖基部在暗培養(yǎng)條件下能夠獲得高質量的愈傷組織，最佳生長調節(jié)劑組合為6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L，但從外植體誘導出愈傷到分化成苗就需時110 d，周期長，每塊愈傷分化成2.38～3.75棵苗。為了建立更優(yōu)良的海南三七組培快繁體系，本研究以海南三七的根莖芽基部為外植體，進行了叢生芽誘導、繼代增殖、生根培養(yǎng)和組培苗移栽等系列研究，建立了高效穩(wěn)定的海南三七組培擴繁體系，為海南三七種苗的工廠化生產奠定基礎。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

用自來水將從野外采集的海南三七根莖清洗干凈，剪掉貯藏根和須根后，放入質量濃度0.1%的多菌靈可濕性粉劑溶液中浸泡消毒30 min，然后取出晾干表面水分（圖1-A）；再放入經(jīng)洗凈消毒的河沙中恒溫發(fā)芽，洗凈后取其根莖上長出的芽（圖1-B）。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理

將海南三七的根莖芽用自來水洗凈，以質量百分比濃度計，先用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡根莖芽30 min，再用0.1%的百菌清溶液浸泡根莖30 min；接著在自來水下反復沖洗根莖芽30 min；晾干表面水分后，在超凈工作臺上，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留約2～3 cm高的根莖芽基部；用棉球蘸取70%酒精擦拭芽基部，最后用0.1%升汞溶液消毒15～18 min，滅菌水沖洗4～5次，切掉距離芽基部兩端各約0.3～0.5 cm之外的部分，留約1～2 cm的芽基部，并將芽基部接種到誘導培養(yǎng)基中。

1.2.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室各階段溫度為25～30℃，光照強度為2 000～2 300 lx，光照時間控制為14 h/d。

1.2.3 試驗培養(yǎng)基配方

（1）初代誘導培養(yǎng)。試驗了3種芽誘導培養(yǎng)基：（A1）MS，pH 5.8；（A2）MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁，pH 5.8；（A3）MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁，pH 5.8。60 d后統(tǒng)計接種的外植體啟動率和出芽指數(shù)，啟動率=（啟動的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%；出芽指數(shù)：所有外植體上出芽數(shù)的平均數(shù)。

（2）繼代增殖培養(yǎng)。當初代芽基部叢生芽長至4～7 cm時，切下芽，截取芽基部1.0～1.5 cm接種到增殖培養(yǎng)基中誘導叢生芽。試驗了3種增殖培養(yǎng)基：（B1）MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁，pH 5.8；（B2）MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁，pH 5.8；（B3）MS+6-BA 8.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁，pH 5.8。每個處理接種20個芽基部，重復3次，25 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)，增殖系數(shù)=統(tǒng)計的總芽數(shù)/接種的總芽數(shù)。

（3）生根培養(yǎng)。選擇苗高4～6 cm的組培苗接入生根培養(yǎng)基中，每處理各接6瓶，每瓶接6株，重復3次。采用以下3種培養(yǎng)基進行海南三七組培苗的生根培養(yǎng)：（C1）MS+活性碳1.0 g/L，pH 5.8；（C2）MS+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+活性碳1.0 g/L，pH 5.8；（C3）MS+ NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%香蕉泥+活性碳1.0 g/L，pH 5.8。分別在20 d后統(tǒng)計生根率和單苗平均根數(shù)，生根率=（生根的芽苗數(shù)/接種芽苗總數(shù)）×100%；單苗平均根數(shù)=總的根數(shù)/生根的苗數(shù)。

1.2.4 組培苗的移栽

當生根培養(yǎng)基上的苗長至5～7 cm時，在溫室自然光照下煉苗7～10 d；取出組培苗，洗凈根部培養(yǎng)基，用0.1%的百菌清溶液浸泡30 min，移栽到如下基質：（1）紅壤；（2）腐葉土∶紅壤=1∶1（V∶V）；（3）進口泥炭：紅壤=1∶1（V∶V）；（4）進口泥炭∶紅壤∶腐葉土=1∶1∶1（V∶V∶V）；（5）進口泥炭。統(tǒng)計成活率和觀察長勢，成活率=成活的苗數(shù)/種的苗數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用excel 2016和SPSS16.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和方差分析。

2 結果與分析

2.1 海南三七根莖芽基部的初代誘導

從表1可看出，不同的激素種類和濃度對根莖芽基部叢生芽的啟動有著明顯的影響。其中，在A3培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，經(jīng)約20 d培養(yǎng)，能觀察到肉眼可見的綠點（圖2-A）；至離體培養(yǎng)60 d左右時，出芽指數(shù)達4.60，啟動率為98.50%，大部分外植體可以分化出3～5個叢生芽，長勢較好，是各處理中的最適培養(yǎng)基（圖2-B）。此外，A2處理的啟動率和出芽指數(shù)也較高，次于A3；A1處理的啟動率最低，芽分化得慢，可能是因為沒有添加椰汁和外源激素。

2.2 叢生芽增殖培養(yǎng)

不同激素濃度對海南三七根莖芽基部增殖培養(yǎng)的影響見表2。從表2可看出，與B1相比，提高6-BA的濃度，可顯著增加叢生芽的增殖系數(shù)，其中，在B2培養(yǎng)基上經(jīng)約25 d培養(yǎng)，增殖系數(shù)為5.87，大部分叢生芽基部可分化出5～7個叢生芽，長勢好（圖2-C）；在B3培養(yǎng)基上經(jīng)約25 d培養(yǎng)，增殖系數(shù)為7.56，大部分叢生芽基部可分化出6～9個叢生芽，長勢好；在B1培養(yǎng)基上經(jīng)約25 d培養(yǎng)，增殖系數(shù)為4.69，大部分叢生芽基部可分化出3～5個叢生芽。因此，適合海南三七根莖芽基部增殖培養(yǎng)的6-BA濃度范圍為3.0～8.0 mg/L，在此范圍內均有較多長勢好的叢生芽。

2.3 無菌小苗生根培養(yǎng)

從表3可看出，添加NAA可促進長根，但有黃葉；同時添加NAA和香蕉泥，根和苗均粗壯，而且葉片綠色。因此，海南三七組培苗的生根培養(yǎng)中，宜選用配方C3，即MS+ NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%香蕉泥+活性碳1.0 g/L，在此配方中植株粗壯，無菌苗長勢最好（圖2-D）。

2.4 海南三七組培苗移栽成活情況

將海南三七組培苗根部培養(yǎng)基洗凈并消毒（圖2-E），分別移栽至5種基質的苗床上，經(jīng)過1個月的栽培管理，其組培苗成活率高低順序依次是：進口泥炭（98%）>進口泥炭∶紅壤∶腐葉土=1∶1∶1（V∶V∶V）（95%）>進口泥炭∶紅壤=1∶1（V∶V）（80%）>腐葉土：紅壤=1∶1（V∶V）（75%）>紅壤（65%）。5種基質中，在以進口泥炭作為栽培基質的苗床上成活率達98%以上（圖2-F）；其次是進口泥炭∶紅壤∶腐葉土=1∶1∶1（V∶V∶V）的基質，成活率達95%以上。因此，海南三七組培苗宜選用較疏松且營養(yǎng)成分含量高的基質，如將進口泥炭∶紅壤∶腐葉土按一定體積混合，不宜單獨選用不透氣易板結的基質，如紅壤。endprint

3 討論與結論

本研究發(fā)現(xiàn)，海南三七根莖芽基部可誘導叢生芽，誘導結果主要受6-BA和NAA濃度的影響，此外，是否添加附加物椰汁也會對結果產生一定影響。與劉盼盼[9]和吳丹[10]的海南三七組培快繁方式不同的是，本研究不經(jīng)過愈傷組織階段，而是直接采用以芽繁芽的方式，區(qū)別于上述2種海南三七的組培快繁方式，繁殖系數(shù)顯著提高，且繁殖周期縮短，短期內可獲得大量組培苗。此外，本研究與劉盼盼[9]和吳丹[10]均選用MS為基本培養(yǎng)基，不同的是，本研究在培養(yǎng)基中添加了椰汁，至于椰汁在叢生芽誘導和增殖方面的作用，尚需要做進一步研究。

本研究也發(fā)現(xiàn)，不同栽培基質對海南三七組培苗的成活率影響顯著。采用進口泥炭作為基質時，成活率最高；其次是進口泥炭∶紅壤∶腐葉土=1∶1∶1（V∶V∶V）的混合基質；以紅壤為基質的成活率最低。由此可見，海南三七組培苗需要保水、透氣、保肥好的基質。紅壤易板結和不透氣，導致成活率低；腐葉土與紅壤混合的基質雖透氣，但保肥性差，組培苗成活率略高，但長勢不好；進口泥炭中含有保水劑且透氣，組培苗長勢最好；進口泥炭∶紅壤∶腐葉土=1∶1∶1（V∶V∶V）的混合基質，同時具有保水肥和透氣的特點。因此，組培苗成活率較高，長勢也好。綜合經(jīng)濟和實用角度考慮，海南三七組培苗宜選用進口泥炭、紅壤和腐葉土的混合基質進行栽培。

綜上所述，以海南三七根莖芽基部為外植體進行海南三七的組培快繁，是海南三七可行的組培苗繁殖方式之一，其中最佳誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁；繼代增殖比較合適的培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0～8.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁；最佳生根培養(yǎng)基為MS+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%香蕉泥+活性碳1.0 g/L。組培苗移栽合適的基質為進口泥炭、紅壤和腐葉土的混合基質或純進口泥炭。

參考文獻

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