張 英，丁健樺，向虹霖，劉鵬飛

(東華理工大學 化學生物與材料科學學院，江西 南昌 330013)

離子液體-分散液液微萃取/高效液相色譜法用于豬腎臟中3種四環(huán)素類抗生素的檢測

張 英，丁健樺*，向虹霖，劉鵬飛

(東華理工大學 化學生物與材料科學學院，江西 南昌 330013)

建立了分散液液微萃取(DLLME)技術(shù)進行樣品前處理，高效液相色譜(HPLC)法測定豬腎臟中土霉素(OTC)、四環(huán)素(TC)、金霉素(CTC)3種四環(huán)素類抗生素(TCs)殘留量的方法。考察了分散劑種類、離子液體用量、分散劑用量、樣品溶液pH值、萃取時間、鹽效應等因素對萃取效率的影響。優(yōu)化后的實驗條件為：以丙酮為分散劑，離子液體([BMIM]PF6)用量為50 μL，分散劑用量為140 μL，樣品溶液pH值為3.0，萃取時間為15 min，不添加鹽。該方法在0.1～10.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2≥0.999 5)，土霉素、四環(huán)素和金霉素的相對標準偏差(RSD)為2.2%～3.1%，檢出限(LOD)為54～93 μg/L，富集倍數(shù)為7.0～27.8，且樣品的加標回收率達99.5%～101.1%。該法準確度和精密度均滿足分析方法的要求，實現(xiàn)了對豬腎臟中土霉素、四環(huán)素、金霉素3種四環(huán)素類抗生素殘留量的快速、綠色、靈敏和準確檢測。

離子液體；分散液液微萃??；高效液相色譜；四環(huán)素類抗生素；豬腎臟

四環(huán)素類抗生素(TCs)是一類由放線菌產(chǎn)生的廣譜抗生素，常用的有土霉素(OTC)、四環(huán)素(TC)、金霉素(CTC)及一些半合成衍生物如強力霉素等。TCs具有良好的抑菌性，能有效地治療和預防疾病，還可作為生長促進劑被添加到飼料中，因此被廣泛應用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)[1-2]。但是抗生素使用不當或濫用，將導致動物體內(nèi)抗生素殘留量較高，其中大部分會隨糞便、尿液等排泄物排出，如果將其排泄物作為有機肥施入農(nóng)田,則會引發(fā)土壤、水體等一系列環(huán)境污染問題；同時，長期攝入含有抗生素的動物源性食品也將對人體健康造成危害[3]。目前抗生素濫用已成為人們關(guān)注的一個熱點問題，而復雜體系中抗生素殘留的靈敏、準確、可靠分析方法的研究和建立是抗生素濫用研究的前提和基礎(chǔ)，顯得非常迫切和重要。

高效液相色譜法(HPLC)是TCs殘留量檢測的一種常用分析方法，具有操作簡便、快速、準確等特點，其重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、分離效果等均能滿足產(chǎn)品的檢驗要求[4]。但由于大多數(shù)生物樣品基質(zhì)復雜，在HPLC測定前須進行樣品前處理。傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)(如液-液萃取等)存在有機溶液消耗大，易對環(huán)境造成二次污染，富集倍數(shù)低，難以滿足痕量分析要求等不足[5]。分散液液微萃取(DLLME)則是一種新型的微萃取技術(shù)，具有操作簡便、快速、成本低、富集效率高、有機溶劑用量少等優(yōu)點[6-7]。傳統(tǒng)DLLME使用的萃取劑多為高毒性的鹵代烴，對環(huán)境存在一定的污染。而離子液體(IL)是一種新型的綠色溶劑，具有難揮發(fā)、高穩(wěn)定、強極性和無污染等特性，代替常規(guī)有機溶劑作為萃取劑更為綠色環(huán)保，現(xiàn)已廣泛應用于復雜樣品的萃取分離分析[8-14]。IL-DLLME方法萃取過程耗時短，靈敏度高，易與其它檢測儀器聯(lián)用，是一種具有發(fā)展前途的環(huán)保型分離富集技術(shù)[15-18]。本文采用IL-DLLME技術(shù)結(jié)合HPLC法，建立了豬腎臟中OTC、TC、CTC 3種TCs的高效、靈敏的測定方法，為豬腎臟等動物組織中這3種TCs殘留的檢測提供了有效的參考。

1 實驗部分

高效液相色譜儀(安捷倫1260，美國安捷倫公司)；pH計(PHS-3C,儀電科學儀器公司)；超聲波清洗器(KQ5200DB，昆山市超聲儀器有限公司)；玻璃儀器氣流烘干器(KQ-8，鞏義市予華儀器有限責任公司)；離心機(X-K400，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)；冰箱(海爾BCD-216SZ，海爾集團有限公司)。

鹽酸土霉素(>96.5%)、鹽酸四環(huán)素(>95.9%)、鹽酸金霉素(>90.1%)標準品(中國食品藥品檢定研究院)；甲醇、乙腈(色譜級，國藥集團化學試劑有限公司)；三氟乙酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；[BMIM]PF6(>99%，蘭州物理研究所)；氫氧化鈉、氯化鈉、乙酸乙酯、乙醇、丙酮(分析純，西隴化工股份有限公司)；實驗用水為二次蒸餾水。

新鮮豬腎臟樣品購于學校附近菜市場。

1.2 實驗原理與操作步驟

1.2.1實驗原理在樣品溶液中加入萃取劑，再加入合適的分散劑使萃取劑在樣品溶液中均勻分散，從而增大萃取劑與樣品溶液的接觸面積。因各待測組分在樣品溶液和萃取劑中的分配系數(shù)不同，導致超聲萃取和離心后最終形成三相體系，最后用微量進樣針取其萃取相進樣分析[19]。

1.2.2操作步驟向樣品溶液中加入一定量的萃取劑([BMIM]PF6)與分散劑(丙酮)的混合溶液，搖勻，此時呈分散劑/萃取劑/樣品溶液三相體系的渾濁溶液，超聲萃取15 min，待體系達到平衡后放入離心機中離心5 min使其分層，此時待測組分被萃取到下層的沉積相中，最后吸取一定量的沉積相溶液經(jīng)HPLC進樣分析。

基于圖像技術(shù)的破碎卵石指標相關(guān)性對比分析…………………………………… 張?zhí)K花，高占須，郭慶林（5-279）

1.3 溶液的配制

標準溶液：分別稱取OTC、TC、CTC各 5 mg，用水溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中，定容，即得質(zhì)量濃度各為500 mg/L的標準儲備液。實驗中所需的標準溶液均由該儲備液適當稀釋后配制。

三氟乙酸溶液：準確移取三氟乙酸0.765 mL，用水定容至100 mL容量瓶中，得到濃度為0.1 mol/L的三氟乙酸溶液。

氫氧化鈉溶液：準確稱取氫氧化鈉固體0.4 g于燒杯中，用水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得到濃度為0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液。

樣品溶液：取新鮮豬腎臟樣品，經(jīng)絞肉機絞碎后準確稱取5.000 0 g于50 mL燒杯中，依次加入2.5 mL濃度為0.1 mol/L的三氟乙酸溶液與12.5 mL乙腈，攪拌均勻后超聲提取15 min，待過濾后用水定容至100 mL，置于冰箱備用。

1.4 色譜條件

色譜柱為C18柱(Ameritech,Dim.250 mm×4.6 mm)；柱溫為25 ℃；紫外檢測波長為350 nm。流動相：A為乙腈，B為甲醇，C為0.02%三氟乙酸；流速為1.5 mL/min；梯度洗脫：0～5 min,85%～70%A，5%～10%B；5～22 min，70%～60%A，10%B。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

取質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的TCs混合標準溶液，按照“1.2.2”萃取操作步驟和“1.4”色譜條件,分別考察了分散劑種類和用量、離子液體用量、樣品溶液pH值、萃取時間和鹽效應等因素對TCs萃取效率的影響。

2.1.1分散劑種類及用量的優(yōu)化考察了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮4種分散劑對萃取效率的影響，結(jié)果表明，以丙酮為分散劑時，離子液體的萃取效果最好，因此本文選擇丙酮為最佳分散劑。

實驗考察了分散劑丙酮的用量(60、80、100、120、140、160 μL)對萃取效率的影響。結(jié)果如圖1A所示，隨著分散劑用量在60～140 μL范圍內(nèi)逐漸增加，TCs的萃取效率總體呈增大趨勢；當分散劑用量為140 μL時萃取效率最大，這是由于增加分散劑用量，能使萃取劑與樣品溶液接觸幾率增加；而當分散劑用量大于140 μL時，TCs的萃取效率反而降低，可能是因為分散劑用量過多稀釋了樣品溶液，從而間接影響了萃取效率。因此本文選擇最佳分散劑用量為140 μL。

圖1 不同萃取條件對TCs萃取效率的影響Fig.1 The effect of different conditions on TCs extraction efficiencyA.volume of dispersant,B.volume of ionic liquid,C.pH value,D.extraction time

2.1.2離子液體([BMIM]PF6)用量的優(yōu)化以丙酮為分散劑，考察離子液體用量(0、10、20、30、40、50、60、70 μL)對萃取效率的影響。結(jié)果如圖1B所示，萃取效率隨著離子液體用量的增加而增大，但當離子液體用量高于50 μL時，萃取效率逐漸下降。這可能是因為加入的離子液體體積不足(低于50 μL)導致樣品中TCs萃取不完全；而加入離子液體過多(高于50 μL)則會較大地稀釋萃取的TCs，降低萃取效率。所以本文選擇離子液體用量為50 μL。

2.1.3樣品pH值的優(yōu)化TCs在酸性與堿性條件下很不穩(wěn)定，因此pH值對萃取效率的影響具有決定性。用0.1 mol/L三氟乙酸和氫氧化鈉溶液將樣品溶液pH值調(diào)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，以丙酮為分散劑，考察樣品pH值對萃取效率的影響。結(jié)果如圖1C所示，pH 3.0時，萃取效率最高，故本文選擇最佳樣品pH值為3.0。

2.1.4萃取時間的優(yōu)化傳質(zhì)的速率決定了體系達到平衡的時間。以丙酮為分散劑，考察了萃取時間(5、10、15、20、25 min)對萃取效率的影響。結(jié)果如圖1D所示，萃取時間為15 min時，萃取效率最高，繼續(xù)延長萃取時間，萃取效率反而降低。這是因為在DLLME過程中萃取一定時間(如15 min)后，隨著萃取時間的繼續(xù)增加，分散劑丙酮的揮發(fā)量增大，導致[BMIM]PF6萃取劑損失加劇。因此本文選擇最佳萃取時間為15 min。

2.1.5樣品鹽濃度的優(yōu)化分別加入不同量的NaCl(0、5%、10%、15%、20%、25%)，考察樣品鹽濃度對萃取效率的影響。結(jié)果表明，萃取效率隨著鹽濃度的增加反而減小，可能是因為加入鹽溶液后體系的離子強度增加，使得離子液體的溶解度增大，從而降低了萃取效率。因此本實驗選擇不加鹽。

2.2 線性范圍、精密度與檢出限

移取適量3種TCs標準儲備液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的混合標準溶液，在優(yōu)化條件下對不同濃度的混合標準溶液分別進行測定，以3種TCs的質(zhì)量濃度(x，mg/L)對其峰面積(y)進行線性回歸分析。對質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的TCs混合標準溶液，在優(yōu)化的DLLME和HPLC條件下進行11次重復測定，經(jīng)計算得3種TCs的相對標準偏差(RSD)；當信噪比(S/N)為3時，根據(jù)公式LOD=3cσ/S(c為標準品的濃度，σ為標準偏差，S為凈響應信號強度平均值)計算得3種TCs的檢出限(LOD)。其線性范圍、精密度、檢出限見表1。由表1可見，本法線性關(guān)系良好，RSD不高于3.1%，LOD為54～93 μg/L，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好的特點，能夠用于TCs的靈敏檢測。

表1 3種TCs的線性方程、線性范圍、精密度與檢出限Table 1 Linear equations,linear ranges,RSDs and LODs of three TCs

2.3 富集倍數(shù)

富集倍數(shù)是指經(jīng)IL-DLLME處理后待測物濃度與待測物原始濃度之比。取5 mg/L的TCs混合標準溶液，在優(yōu)化色譜條件和萃取條件下，分別進行萃取前和萃取后的測定。結(jié)果表明，離子液體對TCs具有較好的富集作用，對OTC、TC和CTC的富集倍數(shù)分別為7.0、16.3、27.8倍。

圖2 豬腎臟樣品中TCs萃取前后的色譜圖Fig.2 Chromatograms of TCs in pig kidney sample before and after extractiona.before extraction；b.after extraction

2.4 實際樣品分析

取1.5 mL的豬腎樣品溶液3份，第1份直接進行HPLC分析，第2份采用優(yōu)化的DLLME方法處理后再進行HPLC分析，第3份加入適量的3種TCs標準溶液后在優(yōu)化的DLLME和HPLC條件下進行加標回收率實驗。樣品的分析結(jié)果見圖2和表2。

從圖2可以看出，TCs經(jīng)DLLME萃取后富集效果明顯，且可以消除一些雜質(zhì)峰，具有一定的凈化作用，有利于實際樣品的分析檢測。經(jīng)計算，豬腎臟樣品中OTC、TC和CTC的含量分別為3 440、1 004、1 003 μg/kg，與國家標準GB/T 5009.116-2003[20]方法對比，結(jié)果偏差小于5%。根據(jù)國內(nèi)標準，TCs在動物源性食品中腎臟組織的最高殘留限量為600 μg/kg[21]，因此，本實驗所采集的豬腎樣品中TCs含量嚴重超標。

表2 實際樣品檢測結(jié)果Table 2 The detection results of actual samples

從表2可知，本方法所測3種抗生素的RSD為1.7%～2.9%，加標回收率達99.5%～101.1%，滿足豬腎臟中3種抗生素的測定需求。

3 結(jié) 論

本文建立了豬腎臟中OTC、TC、CTC殘留量的IL-DLLME/HPLC測定方法。結(jié)果表明，DLLME這種新型的樣品前處理技術(shù)集萃取、富集、凈化于一體，不僅簡化了操作步驟、降低了實驗成本，而且以離子液體代替常規(guī)有機溶劑作為萃取劑，使整個實驗過程更為綠色環(huán)保，是一種有發(fā)展前景的環(huán)保型分離富集技術(shù)。本法的相對標準偏差(RSD)不高于3.1%，檢出限(LOD)為54～93 μg/L，且樣品的加標回收率達99.5%～101.1%，具有靈敏度高、精密度好、準確可靠等優(yōu)點，可為其他復雜樣品中性質(zhì)相似的組分測定提供新的方法。

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Determination of Three Tetracyclines in Pig Kidney by High Performance Liquid Chromatography with Ionic Liquid Dispersive Liquid-Liquid Microextraction

ZHANG Ying,DING Jian-hua*,XIANG Hong-lin,LIU Peng-fei

(College of Biology,Chemistry and Material Science,East China Institute of Technology,Nanchang 330013,China)

A method was established for the determination of three tetracycline antibiotics(TCs) residues such as oxytetracycline,tetracycline and chlortetracycline in pig kidney by high performance liquid chromatography(HPLC) coupled with dispersive liquid-liquid microextraction(DLLME).The influences of dispersant type,amount of ionic liquid,amount of dispersant,pH of sample solution,extraction time and effect of salts on extraction efficiency were investigated.The optimum experimental conditions were as follows:using acetone as the dispersant,a 50 μL ionic liquid([BMIM] PF6),a 140 μL dispersant,a pH 3.0 sample solution,a 15 min of extraction time and no salt.The results showed that this method provided a wide linearity in the range of 0.1-10.0 mg/L with correlation coefficients no less than 0.999 5.The relative standard deviations(RSDs) were 2.2%-3.1%for oxytetracycline,tetracycline and chlortetracycline.The detection limits(LOD) were in the range of 54-93 μg/L with the enrichment folds of 7.0-27.8,and the recoveries were 99.5%-101.1%.It was found that the accuracy and precision could meet the requirements for the rapid,green,sensitive and accurate detection of oxytetracycline,tetracycline and chlortetracycline residues in pig kidney.

ionic liquid(IL);dispersive liquid-liquid microextraction(DLLME);high performance liquid chromatography(HPLC);tetracycline antibiotics(TCs)；pig kidney

2017-06-26；

2017-07-12

國家自然科學基金(21265002)；江西省科級支撐計劃項目(20151BBG70048)

*

丁健樺，博士，教授，研究方向：樣品前處理技術(shù)和色譜分析，Tel:0791-83896550，E-mail:375520739@qq.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.11.010

O657.7

A

1004-4957(2017)11-1352-05