謝夢(mèng)婷，黃曉蘭，羅輝泰，黃 芳，朱志鑫，李 興，吳惠勤

(廣東省測(cè)試分析研究所 廣東省分析測(cè)試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070)

超高效凝膠色譜法測(cè)定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布

謝夢(mèng)婷，黃曉蘭*，羅輝泰，黃 芳，朱志鑫，李 興，吳惠勤

(廣東省測(cè)試分析研究所 廣東省分析測(cè)試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070)

采用超高效聚合物色譜(APC)技術(shù)，以單甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG_pALD)為代表，測(cè)定了聚乙二醇衍生物的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布和雜質(zhì)含量，優(yōu)選了色譜柱和流動(dòng)相，考察了樣品質(zhì)量濃度變化以及溶解時(shí)間等對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。優(yōu)化后3根超高效凝膠色譜柱串聯(lián)，在柱溫40 ℃，流動(dòng)相95%甲醇，流速0.5 mL/min，示差折光檢測(cè)條件下，對(duì)mPEG_pALD的分子量及其分布進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)得到雜質(zhì)的相對(duì)含量。結(jié)果測(cè)得mPEG_pALD主成分的重均分子量(Mw)為19 444，分布指數(shù)(D)為1.01；雜質(zhì)1的Mw為38 703，D為1.01，含量為1.31%；雜質(zhì)2的Mw為61 036，D為1.00，含量為0.70%。與常規(guī)凝膠滲透色譜(GPC)相比，該方法分辨率高，分析速度快，能快速測(cè)定mPEG_pALD的相對(duì)分子量及其分布，并能得到其純度和雜質(zhì)含量，為其工藝研發(fā)、質(zhì)量控制提供了科學(xué)的依據(jù)，同時(shí)也可用于其它PEG衍生物的相對(duì)分子量及其分布和純度的測(cè)定。

超高效凝膠色譜法；聚乙二醇衍生物；相對(duì)分子量；雜質(zhì)含量；單甲氧基聚乙二醇丙醛

蛋白藥物具有多種優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于臨床。但蛋白藥物存在易被酶水解、循環(huán)半衰期短、免疫原性高以及溶解度低等缺點(diǎn)[1-2]，為了維持一定的療效需要大劑量、頻繁用藥，但長(zhǎng)期、反復(fù)的用藥不僅增加了病人的痛苦而且會(huì)引發(fā)一系列的副反應(yīng)。這些缺點(diǎn)嚴(yán)重制約了蛋白類藥物的發(fā)展，通過化學(xué)修飾可以改善這些問題。用作蛋白藥物的修飾劑很多[3]，其中應(yīng)用最廣泛的是聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)及其衍生物[4-7]。PEG及其衍生物不僅可以修飾蛋白藥物，還可用于修飾其他藥物而改善其性能(增加水溶性、延長(zhǎng)半衰期等)，其分子量及分布和雜質(zhì)含量對(duì)修飾后藥物的性能有較大影響[8-10]。因此，亟需建立一種快速有效的方法測(cè)定其分子量及分布和雜質(zhì)的含量。

目前，測(cè)定PEG及其衍生物相對(duì)分子質(zhì)量的方法有粘度法[11]、紅外光譜法[12]、凝膠色譜(GPC)法[13-15]、基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)法[16-18]、快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS) 法[18-19]、核磁共振 (NMR) 法[20]等。PEG相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定方法報(bào)道較多，而測(cè)定PEG衍生物分子質(zhì)量的方法則較少報(bào)道。粘度法測(cè)定高聚物分子量操作繁瑣、花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，與紅外光譜法的準(zhǔn)確度均較差，且無法得到分子量分布；而MALDI-TOF MS法需要選擇合適的基質(zhì)，F(xiàn)AB-MS法的分子量測(cè)定上限為2 000 Da[18]，這兩種方法的儀器昂貴，難以普及；NMR法只能測(cè)定PEG衍生物的相對(duì)分子量，對(duì)樣品純度要求高。GPC法不僅可以測(cè)定聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量，同時(shí)可得到分布系數(shù)(D，Mw/Mn)，并可根據(jù)GPC色譜峰面積大小測(cè)定雜質(zhì)的相對(duì)含量，是目前測(cè)定高分子聚合物分子量的首選方法。

本文采用近兩年最新發(fā)展起來的超高效聚合物色譜(Advanced polymer chromatography，APC)技術(shù)，以單甲氧基聚乙二醇丙醛(Monomethoxy polyethylene glycol propyl aldehyde,mPEG_pALD)為代表，建立了PEG衍生物相對(duì)分子質(zhì)量及其分布和雜質(zhì)含量的快速測(cè)定方法，以期為其工藝研發(fā)、質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效聚合物系統(tǒng)(Waters Acquity APC)：Acquity APC溶劑管理器，Acquity APC 樣品管理器，Acquity APC Column Manager-30S 柱溫箱，Acquity UPLC 示差折光(RI)檢測(cè)器。

聚乙二醇(PEG，美國(guó) Sigma Fluka 公司)，峰位分子量(Mp)分別為600、1 500、2 010、3 120、6 240、8 600、12 000、23 000、40 000、230 000、478 000 Da。甲醇(色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏飲料食品有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件與方法

色譜條件：色譜柱：Acquity APC XT 450(4.6 mm×150 mm，2.5 μm)，測(cè)定分子量量程：20 000～400 000 Da；Acquity APC XT 200(4.6 mm×150 mm，2.5 μm)，測(cè)定分子量量程：3 000～70 000 Da；Acquity APC XT 45(4.6 mm×150 mm，1.7 μm)，測(cè)定分子量量程：200～5 000 Da，3根色譜柱串聯(lián)。柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：95%甲醇；流速：0.5 mL/min；示差折光檢測(cè)器：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：取PEG標(biāo)準(zhǔn)品(2.25 mg)加入1.5 mL流動(dòng)相，室溫放置24 h，待標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解后測(cè)定。

樣品溶液的制備：稱取mPEG_pALD 50 mg置于10 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相溶解定容。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在上述色譜條件下，取標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以聚乙二醇標(biāo)樣的峰位分子量(Mp)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(lgw)，以淋洗體積為橫坐標(biāo)(V)，用三階方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于計(jì)算待測(cè)樣品的相對(duì)分子量及其分布，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為lgw=16.6-8.13V+1.92V2-0.165V3，r=0.999。

1.4 樣品質(zhì)量濃度對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響

分別稱取 mPEG_pALD 5、10、20、50、100、200 mg各置于10 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相至刻度，室溫放置24 h待其溶解。在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行分析。

1.5 不同溶解時(shí)間對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響

稱取mPEG_pALD適量，配制成質(zhì)量濃度均為 5 mg/mL的待測(cè)樣品，在室溫下分別放置0、4、24 h，于相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行分析。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取 mPEG_pALD 6份，按上述條件重復(fù)測(cè)定6次，得到重均分子量、分布系數(shù)和雜質(zhì)相對(duì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 凝膠色譜系統(tǒng)的選擇

mPEG_pALD(約20 kDa)在合成過程中會(huì)產(chǎn)生2倍(或3倍)目標(biāo)分子量的雜質(zhì)，因其主成分與雜質(zhì)均為聚合物，兩者之間有部分物質(zhì)的分子量較接近，如果色譜柱分辨率不高，則主成分與雜質(zhì)分離度不好，無法準(zhǔn)確測(cè)定其分子量，也無法定量主成分含量。傳統(tǒng)的GPC色譜柱因填料顆粒較大(≥5 μm)，導(dǎo)致分辨率無法提高，不能有效分離mPEG_pALD主成分與雜質(zhì)1(分子量約為40 kDa)，且對(duì)于分子量為600、1 500、2 010、3 210 Da的PEG標(biāo)樣也無法得到很好的分離。

圖1 mPEG_pALD的APC系統(tǒng)分析色譜圖Fig.1 Chromatogram of mPEG_pALD using APC

因APC系統(tǒng)的總體擴(kuò)散低，色譜柱的填料顆粒較小(≤2.5 μm)，而將最新的超高效聚合物色譜技術(shù)與 Acquity APC 系列超高效色譜柱相結(jié)合，能顯著提高分辨率。在分離低分子量聚合物時(shí)分辨率提高尤為顯著，不僅使mPEG_pALD(20 kDa)主成分與雜質(zhì)1得到有效的分離，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了雜質(zhì)2(見圖 1)，這在傳統(tǒng)GPC中無法看到；而且對(duì)于分子量較為接近的PEG標(biāo)樣(分子量為600、1 500、2 010、3 210 Da)也能得到良好分離。因此實(shí)驗(yàn)選擇APC凝膠色譜系統(tǒng)分析mPEG_pALD。

2.2 色譜柱及流動(dòng)相的選擇

Acquity APC系列超高效色譜柱主要包括AQ水系色譜柱和XT有機(jī)系色譜柱等。AQ系列色譜柱填料是未鍵合的亞乙基橋雜化(BEH)顆粒，表面有較多的游離羥基，能與聚乙二醇類物質(zhì)相互作用，使分離作用并非單純的體積排阻作用，故有可能導(dǎo)致結(jié)果偏差。因而本實(shí)驗(yàn)選擇填料為鍵合高覆蓋率三甲基硅烷的亞乙基橋雜化顆粒的Acquity APC XT系列色譜柱。

因PEG衍生物易溶于極性有機(jī)溶劑，故采用極性有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。傳統(tǒng)的脂溶性GPC色譜柱填料通常為聚苯乙烯-二乙烯基苯，需進(jìn)行老化，以使填料在流動(dòng)相內(nèi)膨脹到適當(dāng)大小，平衡時(shí)間較長(zhǎng)；而且GPC使用的流動(dòng)相通常固定不變，如果改變流動(dòng)相則需進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的置換及平衡，并可能導(dǎo)致柱效下降。新型的Acquity APC XT系列色譜柱的填料為亞乙基橋雜化聚乙氧基硅烷顆粒，屬剛性填料，適用于有機(jī)溶劑，在不同溶劑內(nèi)的膨脹程度極小或不膨脹，因此能使用多種常見的有機(jī)溶劑(四氫呋喃、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺)作為流動(dòng)相而保持柱效不變，并且可以添加少量的水作為改善劑優(yōu)化方法。根據(jù)mPEG_pALD的溶解性，選擇甲醇作流動(dòng)相，并加入5%的水增加流動(dòng)相對(duì)mPEG_pALD的溶解性，最終確定甲醇-水(9∶5，體積比)作為流動(dòng)相。

2.3 樣品濃度的影響

不同濃度的mPEG_pALD分子量及其分布測(cè)定結(jié)果見表 1，隨著樣品質(zhì)量濃度(0.5～5 mg/mL)的增加，主成分的數(shù)均分子質(zhì)量(Mn)、重均分子質(zhì)量(Mw)、峰位分子質(zhì)量(Mp)、粘均分子質(zhì)量(Mz)呈減小趨勢(shì)，這說明隨著質(zhì)量濃度的減小，分子鏈更易展開。當(dāng)濃度達(dá)到10 mg/mL 以上時(shí)，主峰已變形，這是由于樣品量已超過色譜柱載量所致，因而影響分子量及其分布的測(cè)定。

當(dāng)質(zhì)量濃度較小時(shí)(≤2 mg/mL)，含量較少而分子量較大的雜質(zhì)檢測(cè)不到，會(huì)導(dǎo)致丟失一部分信息(見表 1)，因此，選擇樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL。

表1 不同質(zhì)量濃度的mPEG_pALD主成分和雜質(zhì)分子量及其分布測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of the molecular weight and its distribution of the principal component and impurities of mPEG_pALD at various concentrations

*not detected

2.4 溶解時(shí)間的影響

大部分聚合物的溶解需一定的溶脹時(shí)間，樣品溶解時(shí)間的不同有可能導(dǎo)致其分子量及分布的檢測(cè)結(jié)果不一致，因而考察了樣品溶解10 min、4 h、24 h對(duì)mPEG_pALD分子質(zhì)量及分布檢測(cè)的影響。結(jié)果表明：隨著溶解時(shí)間的增加，mPEG_pALD分子質(zhì)量及分布均無明顯變化，說明mPEG_pALD在流動(dòng)相中溶解性較好，溶解時(shí)間對(duì)mPEG_pALD在分子質(zhì)量及分布的測(cè)定影響不大。

2.5 流速的影響

考察了流速為0.3、0.5、0.8 mL/min對(duì)PEG標(biāo)樣分離度的影響，3種流速下標(biāo)樣均能進(jìn)行有效分離。當(dāng)流速為0.3 mL/min時(shí)所需分析時(shí)間較長(zhǎng)；當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí)，分析時(shí)間較短但系統(tǒng)壓力較高，因此選擇0.5 mL/min作為測(cè)試流速。此時(shí)分析1個(gè)樣品所需時(shí)間為10 min，而傳統(tǒng)的GPC 3根色譜柱串聯(lián)分析1個(gè)樣品需要60 min以上。與傳統(tǒng)的GPC相比，APC技術(shù)不僅能提高分離效率，還可以縮短分析時(shí)間，減少有機(jī)溶劑的使用，降低成本。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì) 6 份mPEG_pALD樣品溶液用上述條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得重均分子量(Mw)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.1%，分布系數(shù)(D)的RSD為0.07%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 不同PEG衍生物樣品的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)5個(gè)不同的PEG衍生物樣品用上述條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表 2。由表 2 可知，本文建立的超高效凝膠色譜法除了可以測(cè)定mPEG_pALD的分子量及其分布外，還可以用于其他PEG衍生物的分子量及其分布的測(cè)定，同時(shí)可以得到其雜質(zhì)的分子量及其分布。

表2 不同PEG衍生物樣品的分子量及其分布的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of the molecular weight of different PEG derivatives

*not detected

圖2 mPEG_pALD(5 mg/mL)用兩根色譜柱(AcquityAPC XT 200和Acquity APC XT 45)分析的色譜圖Fig.2 Chromatogram of mPEG_pALD(5 mg/mL) with 2 gel columns(Acquity APC XT 200 and Acquity APC XT 45)

2.8 雜質(zhì)含量的測(cè)定

由于樣品目標(biāo)分子量主要在20 kDa左右，因此選擇兩根色譜柱Acquity APC XT 200和 Acquity APC XT 45串聯(lián)(分離分子量范圍：200～70 000 Da)對(duì)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雜質(zhì)2已接近色譜柱的排阻極限，而且主峰已變形(圖2)。為得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，選擇3根色譜柱串聯(lián)(分子量范圍：200～400 000 Da)，不僅可用于mPEG_pALD的分子量及其分布和雜質(zhì)含量的測(cè)定，還可用于其他PEG及其衍生物的分子量及分布和雜質(zhì)含量的測(cè)定。由面積歸一化法得出雜質(zhì)的相對(duì)含量，結(jié)果見表3。由表3可知，本方法測(cè)得雜質(zhì)1的含量為1.32%，RSD為0.44%；雜質(zhì)2的含量為0.073%，RSD為7.9%，說明本方法測(cè)定mPEG_pALD的雜質(zhì)含量重復(fù)性良好。

表3 APC系統(tǒng)測(cè)定mPEG_pALD(5 mg/mL)主成分和雜質(zhì)含量結(jié)果Table 3 Results of content of the principal component and impurities of mPEG_pALD(5 mg/mL)using APC

3 結(jié) 論

本文采用APC技術(shù)，以mPEG_pALD為代表，建立了快速測(cè)定PEG衍生物相對(duì)分子量及其分布的超高效凝膠滲透色譜新方法。與傳統(tǒng)的GPC法相比，本方法的分辨率高、分析速度快、重復(fù)性好，同時(shí)可對(duì)PEG衍生物中的雜質(zhì)進(jìn)行定量，為其工藝研發(fā)、質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

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Determination of the Molecular Weight and Molecular Weight Distribution of Polyethylene Glycol Derivatives by Advanced Polymer Chromatography

XIE Meng-ting,HUANG Xiao-lan*,LUO Hui-tai,HUANG Fang,ZHU Zhi-xin,LI Xing,WU Hui-qin

(Guangdong Provincial Public Laboratory of Analysis and Testing Technology,Guangdong Institute of Analysis,Guangzhou 510070,China)

A method of advanced polymer chromatography(APC) was established for the determination of the molecular weights and their distributions of polyethylene glycol derivatives and the impurity contents,with monomethoxy polyethylene glycol propyl aldehyde(mPEG_pALD) as the representation for polyethylene glycol derivatives.The chromatographic conditions such as chromatographic column and mobile phase were optimized,while the effects of the concentration of sample(within the concentration range of 0.5-20 mg/mL) and dissolution time were also investigated.The optimized chromatographic conditions were as follows:three ultra-high performance gel columns were connected in series at 40 ℃ with methanol-water (95∶5,by volume) as mobile phase at a flow rate of 0.5 mL/min,and a refractive index detector was selected.The result showed that the weight-averaged molecular weight(Mw) of mPEG_pALD was 19 444 and its distribution index(D) was 1.01,while theMwfor impurity1was 38 703 with itsDindex of 1.01 and its content of 1.31%,and theMwfor impurity2was 61 036 with itsDindex of 1.00 and its content of 0.70%.Compared with the traditional GPC method,this APC method could obtain the molecular weight and its distribution of mPEG_pALD with higher resolution and less time，and the content of impurity could also be acquired.The method provides a scientific basis for the research,development and quality control of PEG derivatives,and is applicable for the determination of molecular weight,molecular weight distribution and purity of other PEG derivatives.

ultra high performance gel chromatography;polyethylene glycol derivatives;relative molecular weight;impurity content;mPEG_pALD

2017-07-04；

2017-08-10

廣東省科學(xué)院科研平臺(tái)環(huán)境與能力建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2016GDASPT-0308)

*

黃曉蘭，研究員，研究方向：色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)，Tel：020-87312430，E-mail：wenhxl@126.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.11.004

O657.7；O631.6

A

1004-4957(2017)11-1312-06