荊佩欣，張紅梅，曹 蕾，許冬梅，張永輝，郭旭生

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730020； 3.甘肅省草原技術(shù)推廣總站，甘肅 蘭州 730046)

青藏高原耐低溫乳酸菌在垂穗披堿草青貯中的應(yīng)用

荊佩欣1，張紅梅2，曹 蕾3，許冬梅1，張永輝3，郭旭生1

(1.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000； 2.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730020； 3.甘肅省草原技術(shù)推廣總站，甘肅 蘭州 730046)

為探討一株低溫發(fā)酵戊糖片球菌Q6在不同溫度條件下對(duì)垂穗披堿草(Elymusnutans)青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響。本研究設(shè)置了對(duì)照組(清水，CK)、耐低溫戊糖片球菌Q6及商品化的戊糖片球菌(APP)3個(gè)處理，分別在10、15、25 ℃溫度下進(jìn)行垂穗披堿草青貯，在青貯發(fā)酵30、60、90 d后取樣測定其發(fā)酵品質(zhì)和化學(xué)成分。結(jié)果表明，添加耐低溫戊糖片球菌Q6在15 ℃下青貯60 d時(shí)，青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)明顯優(yōu)于CK組和APP處理組，有效降低了青貯料的pH，增加了乳酸含量，并保存更多的干物質(zhì)。同時(shí)，添加菌株Q6不僅提高了青貯飼料中乳酸菌數(shù)量而且抑制了酵母和霉菌生長。因此，戊糖片球菌Q6是一株適宜于青藏高原牧草低溫青貯的優(yōu)良乳酸菌。

青藏高原；戊糖片球菌；垂穗披堿草；低溫青貯；青貯品質(zhì)

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，健康有機(jī)的畜產(chǎn)品已經(jīng)成為當(dāng)今畜牧業(yè)的發(fā)展導(dǎo)向，而健康優(yōu)質(zhì)的飼草則是有機(jī)畜牧業(yè)的基礎(chǔ)。在青貯飼料制作中添加乳酸菌，既有利于牧草的貯藏，又能使青貯飼料保持更多營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)依托乳酸菌這種益生菌可生產(chǎn)出生態(tài)、綠色的青貯飼料。

近年來，國內(nèi)外有關(guān)乳酸菌在青貯飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用備受關(guān)注。在青貯玉米(Zeamays)中添加乳酸菌可以縮短青貯時(shí)間，利于青貯玉米營養(yǎng)品質(zhì)的提高[1-2]；在青稞(Hordeumvulgare)秸稈、多年生黑麥草(Loliumperenne)、紫花苜蓿(Medicagosativa)中添加乳酸菌可以促進(jìn)乳酸菌早期發(fā)酵，使pH下降加快，保留更多粗蛋白，減少干物質(zhì)損失、酵母菌和霉菌數(shù)量[3-4]；家畜采食添加乳酸菌的青貯飼料后，產(chǎn)奶量顯著增高[5]。可見，青貯飼料中添加乳酸菌可以顯著提高青貯飼料品質(zhì)。

在自然青貯過程中，環(huán)境溫度是影響乳酸菌活性的重要因素[6]。冬季的低溫條件會(huì)限制全混合日糧(TMR)的乳酸發(fā)酵[7]。青藏高原牧草收獲季平均氣溫只有15～20 ℃，使原料自身攜帶的不多的乳酸菌代謝繁殖會(huì)受到低溫的抑制，難以調(diào)制出高品質(zhì)的青貯飼料。而傳統(tǒng)乳酸菌商品添加劑中乳酸菌適宜生長溫度為20～37 ℃，不能很好地適應(yīng)當(dāng)?shù)氐蜏貧夂?，易造成青貯飼料發(fā)酵不完全，青貯效果差，很難發(fā)揮有效作用。在20 ℃條件下,商品乳酸菌的生長活性會(huì)受到影響，不能很好地發(fā)揮作用[8]。若在青貯中添加耐低溫乳酸菌，不僅可以增加青貯乳酸菌數(shù)量，還可以代謝產(chǎn)酸，提前實(shí)現(xiàn)較低的 pH 環(huán)境，從而更好地抑制腐敗菌的活動(dòng)，提高青貯品質(zhì)。目前，國內(nèi)關(guān)于青藏高原耐低溫乳酸菌的研究很少，秦麗萍[9]發(fā)現(xiàn)，從青藏高原垂穗披堿草分離篩選得到的乳酸菌在15 ℃下可明顯提高垂穗披堿草(Elymusnutans)青貯品質(zhì)。因此，本研究將篩選的青藏高原耐低溫乳酸菌添加至垂穗披堿草，分別在10、15、25 ℃下進(jìn)行青貯，并分析其發(fā)酵品質(zhì)和化學(xué)成分，旨為青藏高原乳酸菌添加青貯飼料提供理論依據(jù)和有效乳酸菌菌劑。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以2015年7月31日采集的甘肅省武威市天?？h抓喜秀龍鄉(xiāng)天然草地(海拔2 965 m)抽穗期的垂穗披堿草為青貯原料，用飼草加工與利用實(shí)驗(yàn)室所選1株優(yōu)良耐低溫乳酸菌——戊糖片球菌(Q6)和商品化的戊糖片球菌(American commercial inoculantsPediococcuspentosaceus，APP)共兩株乳酸菌為青貯添加劑。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

青貯試驗(yàn)采用菌種×青貯溫度的雙因素設(shè)計(jì)。其中，菌種分別為蒸餾水(對(duì)照，CK)、Q6和APP，青貯溫度設(shè)10、15和25 ℃，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3測定指標(biāo)和方法

1.3.1乳酸菌添加青貯 將垂穗披堿草萎蔫至水分含量為65%～70%時(shí)，剪成2～3 cm的片段，將活化好的待添加乳酸菌按照1×106cfu·g-1的數(shù)量比均勻噴灑到草樣中，對(duì)照組用等量蒸餾水代替?；靹蚝笥镁勐纫蚁┧芰洗?30 cm×23 cm)裝200 g左右草樣，真空包裝機(jī)抽真空并封口后分別在10、15和25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30、60和90 d后取樣。

1.3.2發(fā)酵品質(zhì)測定 稱取20 g青貯原樣和垂穗披堿草青貯30、60和90 d后的樣品，同時(shí)量取180 mL蒸餾水按草水重量1∶9的比例，高速攪拌30 s后用4層紗布過濾制備浸提液，于-20 ℃保存部分浸提液用于pH、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)和氨態(tài)氮(ammonia nitrogen，AN)的測定；同時(shí)用50%硫酸溶液酸化剩余浸提液使其pH降低至2.0后于-20 ℃保存，用于乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)、丁酸(butyric acid，BA)的測定。用 pH計(jì)測定青貯料浸出液的pH，可溶性碳水化合物(WSC)用蒽銅-硫酸比色法測定；氨態(tài)氮(AN)含量用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[10]；乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)、丁酸(BA)用高效液相色譜法測定[11]；干物質(zhì)(dry matter，DM)含量在105 ℃烘干測定[12]。

宣講活動(dòng)還注意做到內(nèi)外結(jié)合，多渠道、多方式。宣講團(tuán)成員面向有關(guān)部委宣講，爭取政策；面向合作伙伴宣講，促進(jìn)合作；面向廣大知青、離退休干部和“荒二代”“荒三代”宣講，增強(qiáng)北大荒人的榮譽(yù)感、使命感和責(zé)任感。

1.3.3微生物計(jì)數(shù) 在超凈工作臺(tái)取青貯30、60和90 d的樣品或原樣5 g于含有45 mL滅菌生理鹽水的螺口瓶中封口，搖床180 r·min-1室溫振蕩60 min后取上清作為細(xì)菌懸浮液，用滅菌生理鹽水按照10-1至10-5的稀釋梯度稀釋懸浮液，選取適當(dāng)濃度涂布MRS(培養(yǎng)乳酸菌lactic acid bacteria，LAB)和PDA(培養(yǎng)酵母菌yeast和霉菌molds)平板培養(yǎng)基，MRS平板37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，PDA平板37 ℃有氧培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。

1.3.4化學(xué)成分測定 取適量90 d青貯時(shí)的垂穗披堿草樣品或原樣，于65 ℃鼓風(fēng)干燥48 h烘干，微型粉碎機(jī)粉碎后過1 mm篩后備用。粗蛋白(crude protein，CP)采用凱氏定氮法測定，中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量用范氏洗滌法測定[10]。

1.4數(shù)據(jù)分析

用EXCEL進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)整理和圖表制作，用SPSS 15.0的一般線性模型的雙因素分析進(jìn)行處理效應(yīng)的差異顯著性分析，并對(duì)不同菌處理之間進(jìn)行Duncan多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1天祝垂穗披堿草原樣營養(yǎng)成分和微生物數(shù)量

青貯進(jìn)行前，取樣測定垂穗披堿草原樣中的營養(yǎng)成分，經(jīng)測定，垂穗披堿草原樣的pH為6.52，干物質(zhì)含量占鮮樣的28.56%，粗蛋白、可溶性糖、NDF和ADF含量分別占干物質(zhì)含量的5.50%、15.90%、61.90%和31.50%。青貯前的微生物數(shù)量，乳酸菌為4.14 lg(cfu·g-1)，酵母菌3.93 lg(cfu·g-1)，霉菌為3.15 lg(cfu·g-1)。

2.2垂穗披堿草青貯樣品的發(fā)酵品質(zhì)和化學(xué)成分

表1 添加戊糖片球菌垂穗披堿草青貯30 d發(fā)酵品質(zhì)和微生物數(shù)量

注：CK為對(duì)照，Q6和APP為戊糖片球菌；NS，**，***，分別表示Pgt;0.05，Plt;0.01，Plt;0.001；同列不同小寫字母表示所有處理間差異顯著(Plt;0.05)。下同。

Note：CK, control; Q6, Pediococcus pentosaceus Q6; APP, Pediococcus pentosaceus APP; NS,Pgt;0.05; **,Plt;0.01; ***,Plt;0.001; Different lowercase letters within the same column indicate significant difference among all treatments at the 0.05 level. similarly for the following tables.

青貯60 d 后，對(duì)照組樣品的pH在3個(gè)青貯溫度下仍顯著高于其他兩個(gè)處理組(Plt;0.05)，可溶性糖含量也高于其他處理組，乳酸含量低于Q6處理組，與APP處理組差異不顯著(Pgt;0.05)(表2)。比較可知，青貯60 d樣品的乳酸菌數(shù)量低于青貯30 d樣品，但仍高于青貯原樣。隨青貯天數(shù)的延長，對(duì)照組樣品中附著酵母菌數(shù)量無顯著變化，但添加戊糖片球菌的Q6處理組和APP處理組的酵母菌在25 ℃條件下未檢測出。Q6處理組在15 ℃條件下，干物質(zhì)含量顯著高于同溫度其他處理組；pH顯著低于同溫度其他處理；可溶性糖含量與APP處理組差異不顯著；有機(jī)酸含量高于其他兩個(gè)處理組，且其青貯效果優(yōu)于25 ℃條件下青貯效果。說明所選戊糖片球菌Q6具低溫發(fā)酵優(yōu)勢。

青貯90 d后，對(duì)照組的粗蛋白含量顯著高于Q6處理組和APP處理組(Plt;0.05)(表3、表4)。青貯90 d后，Q6處理組樣品浸提液的pH與60 d時(shí)的相差很小；酵母菌和霉菌基本沒有檢測到。Q6處理組在15 ℃下的青貯樣品，pH低于對(duì)照組，高于APP處理組(Pgt;0.05)，可溶性糖較高，干物質(zhì)含量顯著低于其他處理組；在25 ℃下，pH顯著低于對(duì)照組，乳酸、乙酸含量都顯著低于APP處理組，乳酸菌數(shù)量也顯著低于APP處理組。

表2 添加戊糖片球菌垂穗披堿草青貯60 d發(fā)酵品質(zhì)和微生物數(shù)量

3 討論

大量研究發(fā)現(xiàn)，青貯飼料中添加乳酸菌可有效提高青貯飼料品質(zhì)。乳酸菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，使青貯體系pH迅速降低，抑制有害微生物的生長，減少飼料營養(yǎng)物質(zhì)的損失，使青貯飼料保存更多的干物質(zhì)和粗蛋白等。研究表明，青貯時(shí)添加乳酸菌和纖維素酶可有效提高苜蓿青貯品質(zhì)和營養(yǎng)成分[13]。作為良好青貯原料的全株玉米，在青貯完成開窖后，易發(fā)生二次發(fā)酵，使青貯飼料霉變。添加乳酸菌可有效抑制有氧損壞，提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，在一定程度上抑制青貯飼料的變質(zhì)，減少經(jīng)濟(jì)損失。將來自藏北嵩草(Kobresialittledalei)的乳酸菌篩選后添加至苜蓿進(jìn)行青貯，發(fā)現(xiàn)添加腸膜明串珠菌后，青貯苜蓿乳酸含量顯著升高，pH顯著降低，且保存更多粗蛋白[14]。從青藏高原垂穗披堿草分離得到的植物乳桿菌、戊糖片球菌及清酒乳桿菌在15 ℃下可明顯提高垂穗披堿草青貯品質(zhì)[9]。本研究將篩選所得優(yōu)良乳酸菌添加至垂穗披堿草進(jìn)行青貯后也發(fā)現(xiàn)，在低溫10和15 ℃下，所選的耐低溫戊糖片球菌Q6處理組的青貯品質(zhì)都顯著高于對(duì)照組；尤其是15 ℃，青貯60 d的青貯品質(zhì)顯著優(yōu)于對(duì)照組和APP處理組。

表3 添加戊糖片球菌垂穗披堿草青貯90 d化學(xué)成分

表4 添加戊糖片球菌垂穗披堿草青貯90 d發(fā)酵品質(zhì)

青貯飼料中，pH的快速降低能夠抑制蛋白酶的活性，減小蛋白質(zhì)的降解損失，并抑制不利于青貯發(fā)酵的厭氧微生物(如腸細(xì)菌和梭菌)的生長，因此，pH 是決定青貯飼料質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)[15-17]。本研究中，Q6處理組青貯30和60 d樣品的pH顯著低于對(duì)照組及APP處理組，但青貯90 d時(shí)，15 ℃下樣品的pH與對(duì)照及APP處理組差異不顯著，說明將戊糖片球菌Q6添加至垂穗披堿草青貯飼料中并在低溫條件下發(fā)酵，確實(shí)可以提高其青貯品質(zhì)，但青貯60 d以后，可能由于Q6處理組可發(fā)酵底物不足，同時(shí)青貯體系的pH已降到一個(gè)相對(duì)較低的水平，已不利于乳酸菌繼續(xù)發(fā)酵，導(dǎo)致無顯著差異，但具體的原因，有待進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

同時(shí)，有機(jī)酸含量及其構(gòu)成可以反映青貯飼料品質(zhì)的優(yōu)劣[18]，其中最重要的有乳酸、乙酸和丁酸。乙酸生成的途徑有兩個(gè)，一是異型乳酸菌發(fā)酵在產(chǎn)生一分子乳酸的同時(shí)產(chǎn)生一分子乙酸，二是由乳酸異化產(chǎn)生。當(dāng)梭狀芽胞桿菌和霉菌較活躍，不僅消耗營養(yǎng)物質(zhì)，還產(chǎn)生大量丁酸，而丁酸的酸臭味，在很大程度上影響了青貯飼料的適口性，使其品質(zhì)變差，本研究中所有處理組均未檢測到丁酸，說明發(fā)酵品質(zhì)較好。乳酸由乳酸菌發(fā)酵底物產(chǎn)生，可以迅速降低青貯飼料pH。本研究中，低溫條件下青貯30和60 d乳酸菌處理組的乳酸含量都明顯高于對(duì)照組，說明乳酸菌添加對(duì)提高青貯飼料品質(zhì)具有顯著作用。

乳酸菌作為添加劑，可保證青貯飼料體系中乳酸菌的數(shù)量，使乳酸菌成為青貯體系中的優(yōu)勢菌群，迅速發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，迅速降低青貯體系pH，抑制有害微生物的生長，提高青貯品質(zhì)。在進(jìn)行水稻(Oryzasativa)秸稈青貯時(shí)，在任何青貯階段，添加乳酸菌添加劑的處理組的青貯體系中乳酸菌的數(shù)量都高于對(duì)照組，且酵母菌數(shù)量要比對(duì)照組少[19]。玉米刈割后存放時(shí)間越長，其附著的有害雜菌數(shù)量越多，青貯樣品的pH越高，即青貯體系中有機(jī)酸含量越少，越不利于青貯，而添加乳酸菌青貯添加劑后，青貯飼料中的酵母菌和霉菌的生長被抑制，青貯玉米的有氧穩(wěn)定性被提高[20]。添加乳酸菌可使青飼料發(fā)酵過程中乳酸菌急劇增殖，明顯抑制霉菌、酵母菌以及一般細(xì)菌的增殖，促進(jìn)旺盛的乳酸發(fā)酵，提高了乳酸含量，提高了L(+)乳酸的生成比率7%～14%，可使青貯飼料的pH迅速下降，抑制丁酸菌的繁殖。此外，由于所加入的乳酸菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)和過氧化物，也使不良微生物的生長繁殖受到抑制或死亡[21]。本研究表明，在垂穗披堿草中添加青藏高原耐低溫乳酸菌，在青貯30 d時(shí)，雜菌生長即被抑制，且隨青貯時(shí)間延長，這種效果越明顯。

4 結(jié)論

在垂穗披堿草青貯中添加青藏高原耐低溫乳酸菌Q6，在10和15 ℃低溫下青貯后可顯著提高牧草青貯品質(zhì)；而在25 ℃時(shí)青貯，所選耐低溫乳酸菌的發(fā)酵優(yōu)勢不顯著。添加青藏高原耐低溫戊糖片球菌Q6可有效降低青貯飼料pH，增加乳酸含量，保存更多的干物質(zhì)，且可以提高青貯體系中乳酸菌數(shù)量，抑制酵母和霉菌生長。戊糖片球菌Q6是一株較適于低溫青貯的優(yōu)良乳酸菌。

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(責(zé)任編輯 武艷培)

ApplicationoflacticacidbacteriatoElymusnutanssilagefromtheTibetanPlateau

Jing Pei-xin1, Zhang Hong-mei2, Cao Lei3, Xu Dong-mei1, Zhang Yong-hui3, Guo Xu-sheng1

(1.State Key Laboratory of Grassland and Agro-Ecosystems, School of Life Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 2.State Key Laboratory of Grassland and Agro-Ecosystems, School of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, Gansu, China; 3.Gansu Provincial Extension Station of Grassland Techniques, Lanzhou 730046, Gansu, China)

The study was conducted to investigate the effect of applying a low temperature fermentative strain ofPediococcuspentosaceusQ6 on the fermentation quality ofElymusnutanssilage ensiled at different temperatures. Before ensiling ofE.nutans, the grasses were treated without inoculation or with inoculation of either the strain of Pediococcus pentosaceus Q6 or a commercial strainP.pentosaceus(APP). The treated grasses were then ensiled at 10, 15 and 25 ℃, respectively. The ensiled grasses were opened on 30, 60 and 90 d after fermentation for laboratory analysis. The results showed that after 60 days of fermentation at 15 ℃, the fermentation quality of the silage inoculated byP.pentosaceusQ6 was obviously better than the control silage or silage inoculated by APP. Inoculation ofP.pentosaceusQ6 at ensiling had an effective reduction in silage pH, and also increased the concentration of lactic acid dry matter in ensiled grasses compared to the control silage or silage inoculated by APP. Meanwhile, application ofP.pentosaceusQ6 not only increased the count of lactic acid bacteria, but also inhibited the growth of yeasts and molds in the grass silage. Therefore,P.pentosaceusQ6 is a candidate strain that can be used to making silage at low temperature in the Tibetan plateau.

Qinghai-Tibet plateau;Pediococcuspentosaceus;Elymusnutans; low temperature ensiling; fermentation quality

Guo Xu-sheng E-mail:guoxsh07@lzu.edu.cn

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0614

荊佩欣,張紅梅,曹蕾,許冬梅,張永輝,郭旭生.青藏高原耐低溫乳酸菌在垂穗披堿草青貯中的應(yīng)用.草業(yè)科學(xué),2017,34(11)：2396-2402.

Jing P X,Zhang H M,Cao L,Xu D M,Zhang Y H,Guo X S.Application of lactic acid bacteria toElymusnutanssilage from the Tibetan Plateau.Pratacultural Science，2017,34(11)：2396-2402.

S816.5+1;S543+.909.3

A

1001-0629(2017)11-2396-07

2016-12-15接受日期2017-03-24

國家自然科學(xué)基金(31272486)

荊佩欣(1992-)，女，山西運(yùn)城人，在讀碩士生，主要從事飼料青貯技術(shù)與營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)研究。E-mail:jingpx14@lzu.edu.cn

共同第一作者：張紅梅(1990-)，女，甘肅古浪人，碩士，研究方向?yàn)轱暡菁庸ぜ扒嗖馗咴樗峋l(fā)酵性能研究。

E-mail:zhanghm13@lzu.edu.cn

郭旭生(1978-)，男，寧夏海原人，教授，博士，主要從事飼料青貯技術(shù)與營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)研究。E-mail:guoxsh07@lzu.edu.cn