杜靈娟，陳凱利，劉雅莉

(1.西北農林科技大學風景園林藝術學院，陜西 楊凌 712100； 2.旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室(西北農林科技大學)農業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

葡萄風信子花青素3-O-葡糖基轉移酶基因的克隆及其表達分析

杜靈娟1,2，陳凱利1,2，劉雅莉1,2

(1.西北農林科技大學風景園林藝術學院，陜西 楊凌 712100； 2.旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室(西北農林科技大學)農業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

花青素3-O-葡糖基轉移酶(3GT)是花青素苷合成最后一步的關鍵酶，可把不穩(wěn)定的花青素催化成花青素苷。本研究利用PCR技術從藍色葡萄風信子‘亞美尼亞’(Muscariarmeniacum)中克隆到一個3GT基因(Ma3GT)，Ma3GTcDNA全長1 377 bp，編碼458個氨基酸，與其他植物的3GT蛋白序列相似性達55%～64%。進化分析表明，Ma3GT與單子葉植物3GT聚為一類，與小蒼蘭(Freesiahybrida)、荷蘭鳶尾(Irishollandica)3GT親緣關系最近。熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，Ma3GT在‘亞美尼亞’花(S4)中高表達，在葉片中微量表達，根和鱗莖中幾乎不表達，在‘白麗人’及‘粉日出’各個組織中均不表達。在‘亞美尼亞’中，Ma3GT的轉錄表達受花發(fā)育調控，開花早期(S1)幾乎不表達，隨著花發(fā)育表達量逐漸增加，至完全開放的時期(S4)達到最高峰。此外，Ma3GT在不同品種的花中轉錄表達不同，在藍色品種‘亞美尼亞’中高表達，而在白色品種‘白麗人’和粉色品種‘粉日出’中幾乎不表達。本研究為進一步研究Ma3GT基因在葡萄風信子花瓣呈色中的功能及其花色分子育種提供基因資源和依據。

葡萄風信子；花青素苷；Ma3GT；RT-PCR；糖基轉移酶；糖基化；花色

花色是觀賞植物最主要的品質特征之一?；ㄇ嗨剀帐且活愄烊坏乃苄陨?，可使植物呈現(xiàn)出粉、紅、紫和藍等各種花色[1]?；ㄇ嗨剀沼?種常見的基本苷元：天竺葵素苷元、矢車菊素苷元、飛燕草素苷元、芍藥素苷元、錦葵素苷元和矮牽牛素苷元，是由一系列結構基因編碼酶(CHS、CHI、F3H、F3′H、F3′5′H、DFR、ANS和UFGT)催化而成，最后經糖基化、?；图谆刃揎椇筠D運至液泡等部位儲存[2-4](圖1)。糖基化及隨后的?；诨ㄉ揎椫衅鸬疥P鍵作用，可通過外部氫鍵綁定糖殘基與周圍水分子以增加疏水性 類黃酮的溶解性和穩(wěn)定性[5]。

諸多糖基轉移酶參與花青素苷的糖基化過程。糖基轉移酶第一大類在其C末端包含44個氨基酸保守序列，即植物次生產物糖基轉移酶信號序列(PSPG box)，PSPG催化的糖基化可以提高復合物的溶解性，使其儲存于液泡中，從而保持宿主植物的代謝平衡[6]。其中，研究最為廣泛的是UDP-葡萄糖：花青素3-O-葡糖基轉移酶(3GT)。3GT是參與花青素苷合成最后一步的酶(圖1)，它將UDP-葡萄糖上的葡糖基轉移到花青素受體分子的C3羥基上，從而形成對應的結構穩(wěn)定的花青素苷[6]。早期人們在玉米(Zeamays)、金魚草(Antirrhinummajos)、大麥(Hordeumvulgare)、白蘇(Perillafrutescens)、葡萄(Vitisvinifera)和草莓(Fragariaananassa)等植物中對3GT酶生物化學及分子生物學特征進行了研究[7-12]。近年來，人們在三花龍膽(Gentianatriflora)、矮牽牛(Petuniahybrida)、荷蘭鳶尾(I.hollandica)、小蒼蘭(F.hybrida)、七彩竹芋(Indosasahispida)和中國水仙(Narcissustazettavar.chinensis)等觀賞植物中克隆了3GT基因并對其功能進行了研究[6,13-17]。

葡萄風信子，多年生草本植物,是一種常見的單子葉球根花卉，花開春季，多藍及藍紫色系，因其植株低矮，常用作草地中或花壇、花境鑲邊材料，也可作地被植物，用于巖石園或林下[18]。本研究以葡萄風信子為研究材料，在實驗室前期轉錄組測序的基礎上，篩選一條3GT基因的序列展開研究。首先PCR技術克隆3GT cDNA序列全長，利用在線軟件分析其基因特性；將其氨基酸序列與其他物種的GT序列進行同源性比對及進化分析；實時定量PCR技術分析了Ma3GT基因在葡萄風信子藍、白、粉色3個不同品種中的時空表達模式，為后續(xù)研究Ma3GT基因在葡萄風信子花色形成中的功能提供基礎，為進一步闡明葡萄風信子花青素苷代謝路徑提供理論依據。

1 材料和方法

1.1植物材料

本研究于2016年4月至11月在西北農林科技大學旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室進行。選擇3個葡萄風信子品種[‘亞美尼亞’(M.armeniacum)、‘粉日出(M.armeniacum‘Pink Surprise’)及‘白麗人’(M.aucheri‘White Beauty’)]為材料。根據開花的時間，將葡萄風信子花分為5個不同發(fā)育時期(S1～S5)，具體參照焦淑珍等描述[18]。2016年4月在試驗田采集3個品種不同時期的花、根、鱗莖和葉，液氮速凍后快速置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1葡萄風信子總RNA的提取與MaFLS1基因cDNA全長的克隆 分別從3個葡萄風信子品種的根、鱗莖、葉以及不同發(fā)育時期(S1～S5)的花蕾提取總RNA(Omega公司RNA試劑盒)，反轉錄合成cDNA第一鏈。

依據轉錄組測序獲得的3GT注釋序列，設計特異引物3GT-F和3GT-R(表1)，以藍色葡萄風信子‘亞美尼亞’各個組織cDNA混合樣為模板進行全長PCR擴增。反應程序：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，67 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min；28個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。電泳檢測后回收預期大小片段的條帶，連接pMD19-T載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，藍白斑篩選后，挑選陽性克隆送北京奧科生物科技有限公司測序[19]。測序后拼接序列，獲得葡萄風信子的3GT基因cDNA全長序列。

圖1 葡萄風信子‘亞美尼亞’類黃酮物質代謝示意圖

1.2.2葡萄風信子Ma3GT基因生物信息學分析 用NCBI中的ORF Finder在線工具查找葡萄風信子Ma3GT基因開放閱讀框；用ExPASyProtParam在線預測Ma3GT氨基酸序列的組成成分及理化性質；用NCBI Blastp搜索同源序列，用ProtScale在線預測Ma3GT蛋白的親水性/疏水性；用TMpred在線分析Ma3GT蛋白的跨膜結構域；用SignalP 4.1 Server分析Ma3GT蛋白信號肽；用SOPMA在線分析Ma3GT蛋白二級結構。用DNAMAN完成同源序列比對；用MEGA6.0軟件完成系統(tǒng)進化樹的構建[20-21]。

表1 葡萄風信子3GT基因克隆及表達分析所用的引物

1.2.3葡萄風信子Ma3GT基因的時空表達分析 為了研究Ma3GT在不同花色葡萄風信子的時空表達模式，根據擴增獲得的Ma3GT基因全長序列設計實時定量PCR引物3GT-qPCR-F和3GT-qPCR-R，選取Actin為內參基因[19](引物如表1所列)。以3個品種葡萄風信子根、莖、葉，不同發(fā)育時期花(S1～S5)cDNA作為模板，進行實時定量PCR。參照熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)說明書，在BIO-RAD Cycler IQ5熒光定量PCR儀上檢測Ma3GT基因的相對表達量。反應體系(20 μL)為：SYBR?Premix Ex TaqⅡ 10 μL，PCR正反向引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，cDNA模板1 μL(約100 ng)，ddH2O 7.4 μL，反應程序：94 ℃ 3 min，94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，45個循環(huán)。數據讀取由實時熒光定量PCR儀自動完成。每個樣品3個生物學重復，用SigmaPlot 10.0軟件進行數據處理及圖形繪制[19]。

2 結果與分析

2.1葡萄風信子Ma3GT基因全長cDNA克隆與序列特征分析

為了解糖基化過程中重要的編碼酶基因3GT在葡萄風信子花色形成的作用，在前期轉錄組測序的基礎上，本研究選擇一條3GT注釋序列展開研究。以此條基因序列設計特異引物，以藍色葡萄風信子品種‘亞美尼亞’各組織cDNA混合樣為模板PCR擴增基因全長，獲得一條長1 377 bp的條帶(圖2)，轉化測序后序列拼接，分析其為完整的開放閱讀框，具有起始密碼子和終止密碼子，編碼458個氨基酸，是一條完整的基因序列(圖3)。命名此cDNA序列為Ma3GT。

在線工具ProtParam分析表明，Ma3GT理論分子量約為48.3 kD，理論等電點為5.69，蛋白不穩(wěn)定系數為34.15，屬于穩(wěn)定蛋白。利用ProtScale分析，Ma3GT編碼的蛋白親水性/疏水性的最大值為2.111，最小值為-2.478，且親水性氨基酸殘基比疏水性氨基酸殘基多，推測為親水性蛋白(圖4A)。TMHMM預測Ma3GT蛋白無跨膜區(qū)域(圖4B)。SignalP4.1預測顯示Ma3GT蛋白不具備信號肽位點(圖4C)。SOPMA預測Ma3GT蛋白二級結構組成為38.21%的α螺旋、12.45%的β轉角、33.19%無規(guī)則卷曲和16.16%延伸鏈(圖4D)。

圖2 Ma3GT cDNA全長擴增產物

注：M，DNA標準分子量；1，Ma3GTcDNA全長擴增結果。

Note：M, DNA marker; 1, The product ofMa3GTcDNA.

圖3 Ma3GT基因的核苷酸序列及推導的氨基酸序列

2.2Ma3GT氨基酸序列同源性比對與進化分析

在NCBI上將葡萄風信子Ma3GT氨基酸序列進行Blastp比對，分析表明，Ma3GT與油棕(Elaeisguineensis)、海棗(Phoenixdactylifera)3GT同源性最高，可達63%～64%；與小蒼蘭、荷蘭鳶尾、中國水仙、洋蔥(Alliumcepa)、福士郁金香(Tulipafosteriana)、小果野芭蕉(Musaacuminatasubsp.malaccensis)等其他物種的同源性較高，達55%～61%，而與擬南芥、金魚草和矮牽牛等常見模式植物的同源性不高。

用DNAMAN軟件將葡萄風信子Ma3GT與其他物種已發(fā)表的3GT進行同源序列比對(圖5)，結果發(fā)現(xiàn)Ma3GT蛋白類似于其他3GT蛋白，C末端包含44個氨基酸的糖基轉移酶的PSPG保守序列(從336個氨基酸到379個氨基酸)，該序列參與綁定蛋白到糖核苷酸的UDP糖基過程，且其第22(Trp，W)、23(Asn，N)和44(Gln，Q)位氨基酸殘基為葡糖基轉移酶中的保守基序，在酶蛋白糖基供體特異性中起到決定性作用。這表明Ma3GT屬于葡糖基轉移酶，推測它與其他物種的3GT具有相同或相似的功能，待進一步實驗驗證。

圖4 Ma3GT蛋白的生物信息學分析

注：,親水性/疏水性分析;,氨基酸跨膜分析;?,信號肽位點分析;,蛋白的二級結構預測;α為α-螺旋;β為β-轉角;E為延伸鏈;R為無規(guī)則卷曲。

Note：, Analysis of hydrophilic and hydrophobic amino acids;, Transmembrane analysis; ?, Signal peptide analysis;, Secondary structures prediction; α, indicates alpha helix; β, indicates beta turn; E, indicates extend strand; R, indicates random coil.

圖5 葡萄風信子Ma3GT基因編碼的氨基酸序列與其他物種3GT氨基酸序列的比對

注：氨基酸序列相同及相似部分分別用黑、灰色陰影表示；下劃線位置為PSPG保守序列。黑星號為PSPG保守序列的第22、23和44個氨基酸。Fh3GT(小蒼蘭FreesiahybridHM590645)，Ih3GT(荷蘭鳶尾IrishollandicaAB161175)，Zm3GT(玉米ZeamaysAY167672)，Hv3GT(大麥HordeumvulgareX15694)，At3GT(擬南芥ArabidopsisthalianaAED92377)，Ph3GT(矮牽牛PetuniahybridaAB027454)。

Note：The same and similar amino acid residues are highlighted in black and gray, respectively. Underline indicates the PSPGbox found in glycosyltransferases.

用MEGA6.0將葡萄風信子Ma3GT氨基酸與其他物種GT氨基酸(包括3GT、5GT等)構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示,Ma3GT氨基酸序列首先與小蒼蘭、荷蘭鳶尾的3GT聚為一支，再與玉米、大麥3GT聚為一類，而后與其他雙子葉植物3GT聚為一大類，而與其他類葡糖基轉移酶，如5GT的親緣關系較遠(圖6)。據此結果，再次說明Ma3GT屬于3GT成員，且屬于單子葉植物亞類，與單子葉觀賞植物小蒼蘭和荷蘭鳶尾3GT親緣關系最近。

2.3葡萄風信子Ma3GT基因時空表達模式分析

以葡萄風信子根、莖、葉及盛花期(S4)花的cDNA為模板，利用熒光定量PCR檢測Ma3GT基因在葡萄風信子不同組織中的表達情況。結果顯示，Ma3GT在藍色葡萄風信子‘亞美尼亞’花(S4)中高表達，在葉片中微量表達，而根和鱗莖中幾乎不表達(圖7)。說明Ma3GT基因在藍色葡萄風信子‘亞美尼亞’中為花特異表達的模式。此外，Ma3GT基因在白色葡萄風信子‘白麗人’及粉色葡萄風信子‘粉日出’各個組織中幾乎不表達。

以藍、白和粉色3個葡萄風信子品種5個不同時期花cDNA為模板，熒光定量PCR檢測Ma3GT在不同花色葡萄風信子不同花發(fā)育時期的表達情況。結果顯示(圖8)，在‘亞美尼亞’花中，Ma3GT在未著色的小花蕾時期(S1)幾乎不表達,S2時期開始著色后Ma3GT表達量逐步迅速增加，到了完全著色的盛花期(S4)，Ma3GT的表達量到達頂峰，S5時期花開始衰敗后又有所下降。不同于‘亞美尼亞’，Ma3GT在‘白麗人’和‘粉日出’所有花發(fā)育時期幾乎不表達。在測定葡萄風信子花青素苷物質時還發(fā)現(xiàn)，藍色葡萄風信子‘亞美尼亞’不同時期的花蕾中均檢測到大量的飛燕草素3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素3-O-葡萄糖苷及天竺葵素3-O-葡萄糖苷及其他類花青素苷衍生物，而‘白麗人’花中并未檢測到花青素3-O-葡萄糖苷物質存在。推測,Ma3GT基因表達與葡萄風信子花青苷物質，尤其是花青素3-O-葡萄糖苷的累積有密切的關系。

圖6 Ma3GT蛋白與其他物種的GT蛋白的系統(tǒng)進化樹

圖7 Ma3GT在‘亞美尼亞’不同組織部位的表達分析

注：不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)。下圖同。

Note：Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level; similarly for the Fig. 8.

圖8 Ma3GT在3個葡萄風信子品種5個花發(fā)育時期的表達分析

注：S1為未著色的花蕾；S2為開始著色的花蕾；S3為完全著色未開放的花蕾；S4為完全開放的花蕾；S5為衰敗的花蕾。

Note：S1, Unpigmented flower bud; S2, Flower bud being Pigmented; S3, Pigmented flower bud just before bloom; S4, Fully-opened flower bud; S5, Declined flower bud.

3 討論與結論

糖基化是重要的花色修飾過程，研究糖基化過程中重要的編碼酶：花青素3-O-葡糖基轉移酶(3GT)基因的功能，對于葡萄風信子花色分子育種具有重要的意義。本研究在前期轉錄組測序的基礎上，采用PCR技術成功克隆到了單子葉觀賞植物葡萄風信子的一條3GT基因(Ma3GT)cDNA全長。序列比對發(fā)現(xiàn)Ma3GT氨基酸C末端包含了糖基轉移酶的PSPG保守序列。有研究表明,PSPG保守序列的第22、23和44位氨基酸殘基在酶蛋白糖基供體的選擇中具有重要作用。第22位若為色氨酸(Trp,W)可正確定位UDP-葡萄糖，而精氨酸(Arg,R)可正確定位UDP-葡萄糖醛酸;第23位的絲氨酸(Ser，S)在UDP-葡萄糖醛酸轉移酶中相對保守;第44位如果為谷氨酰胺(Gln，Q)，其糖供體為UDP-葡萄糖，而組氨酸(His，H)為UDP-半乳糖[22-24]。Ma3GT的第22、23和40氨基酸分別為Trp、Asn和Gln，因此可推測Ma3GT以UDP-葡萄糖為主要糖基供體。

早期人們對類黃酮的GTs進行進化分析，發(fā)現(xiàn)催化類黃酮3-O、5-O、7-O位置糖基化的GTs可形成三大進化支(3GTs、5GTs和7GTs)[25]。Ma3GT與其他物種中GTs蛋白聚類分析表明，Ma3GT同催化類黃酮3-O位置糖基化的3GTs聚為一支，推測Ma3GT應該參與了葡萄風信子花色修飾過程中3-O位置的糖基化過程。同時,它與單子葉觀賞植物小蒼蘭、荷蘭鳶尾3GT親緣關系最近。

有研究表明，3GT的表達活性與花青素苷的積累呈正相關，例如葡萄[26]、荔枝(Litchichinesis)[27]和箭葉淫羊藿(Epimediumsagittatum)[23]中，花青素苷大量積累的組織檢測到3GT高表達，而在少量積累和無花青素苷積累的組織中，3GT表達量極低或不表達。在本研究中，Ma3GT的表達也呈現(xiàn)相似的結果。在藍色品種‘亞美尼亞’中，盛開期的藍色花中Ma3GT高表達，葉片中有少量的表達，根、鱗莖幾乎檢測不到表達，說明Ma3GT在花青素苷大量積累的花中高表達，在該品種中具有花組織特異表達的模式。類似于小蒼蘭Fh3GT1[5]和草莓Fa3GT[28]，Ma3GT的轉錄水平受發(fā)育調控，在未著色時期花蕾呈現(xiàn)綠色時,無Ma3GT的轉錄表達，隨著花的逐漸發(fā)育，花青素苷的積累越來越多，至花蕾完全開放的時期，Ma3GT的表達達到最高峰。此外，Ma3GT在不同花色的葡萄風信子品種中轉錄表達不同，在藍色花品種中高表達，而在白色花中幾乎不表達，此結果與小蒼蘭[5]中的報道相似。而Ma3GT在粉色品種‘粉日出’5個不同時期的花中表達量類似于未著色的白色品種‘白麗人’，推測‘粉日出’中雖有少量的花青素苷存在使其著色，但無花青素3-O-葡萄糖苷物質存在，故無參與葡萄糖花青素3-O位置的糖基化過程的Ma3GT轉錄表達。

總之，本研究在葡萄風信子藍色品種‘亞美尼亞’中克隆了一條Ma3GT基因，對其氨基酸序列進行同源比對、聚類分析和蛋白功能預測，分析了Ma3GT在葡萄風信子不同組織、花色品種5個不同發(fā)育時期的轉錄表達情況，為進一步研究Ma3GT基因在葡萄風信子花瓣呈色中的功能及其花色分子育種提供基礎。

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(責任編輯 王芳)

Cloningandexpressionanalysisofanthocyanidin3-O-glucosyltransferasegeneinGrapehyacinth

Du Ling-juan1,2, Chen Kai-li1,2, Liu Ya-li1,2

(1.College of Landscape Architecture and Arts, Northwest A amp; F University, Yangling 712100, Shaanxi, China; 2.State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology and Germplasm Innovation in Northwest China, Northwest A amp; F University, Yangling 712100, Shaanxi, China)

Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase (3GT) is the last key enzyme in the anthocyanin biosynthetic pathway, which can catalyze unstable anthocyanidin into anthocyanin. In this study, we cloned a 3GT gene (designated asMa3GTfromMuscariarmeniacum) using the PCR technique. The gene’s cDNA was 1 377 bp long and encoded an open reading frame of 458 aminoacids.Ma3GTshowed 55%～64% similarity with the other 3GTs. Phylogenetic analysis indicated that Ma3GT was classified into monocot subgroups of 3GTs, and had the closest relationship with the 3GTs ofFreesiahybridandIrishollandica. QRT-PCR analysis detected transcripts ofMa3GTin different organs ofM.armeniacum. The expression level of this gene was high in the fully opened petals (stage S4), very low in the leaves, and almost zero in the roots and bulbs ofM.armeniacum. Andit almost had no expression in all the organs ofM.aucheri‘White Beauty’ andM.armeniacum‘Pink Surprise’. The gene expression was related to the floral developmental stages inM.armeniacum. The transcript level was rarely detectablein the unpigmented buds (stage S1), but increased during the pigment accumulation stages and peaked in the fully opened petals (S4). The expression had significant differences in three cultivars of different colors. The expression level was high in the petals ofM.armeniacum, and rarely detectable in the petals of ‘White Beauty’ and ‘Pink Surprise.’ This research will provide informationand theoretical support for the functional study of theMa3GTgene.

Muscari; anthocyanin;Ma3GTgene; RT-PCR; glucosyltransferase; glycosylation; flower color

Liu Ya-li E-mail:lyl6151@126.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2017-0049

杜靈娟,陳凱利,劉雅莉.葡萄風信子花青素3-O-葡糖基轉移酶基因的克隆及其表達分析.草業(yè)科學,2017,34(11)：2235-2244.

Du L J,Chen K L,Liu Y L.Cloning and expression analysis of anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase gene in Grape hyacinth.Pratacultural Science，2017,34(11)：2235-2244.

Q943.2

A

1001-0629(2017)11-2235-10

2016-12-19接受日期2017-03-20

陜西省自然科學基金青年項目(2017JQ3019)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費(Z109021603)；國家自然科學基金青年項目(31700625)

杜靈娟(1980-)，女，河南孟州人，講師，博士，主要從事園林植物分子育種研究。E-mail:9511083@qq.com

劉雅莉(1960-)，女，陜西西安人，教授，碩士，主要從事園林植物分子育種研究。E-mail:lyl6151@126.com