崔建強(qiáng)，賴普輝

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院,陜西 西安 710246)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化野菊花中總黃酮的超聲提取工藝

崔建強(qiáng)，賴普輝

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院,陜西 西安 710246)

以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化野菊花中總黃酮超聲提取工藝。確定最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲提取時(shí)間40 min、液料比15∶1(mL∶g)、超聲提取溫度50 ℃、超聲功率1 080 W，在此條件下，總黃酮得率可達(dá)0.881%。該提取工藝設(shè)計(jì)合理，為進(jìn)一步研究野菊花中總黃酮的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

總黃酮；超聲波；響應(yīng)曲面法

野菊花(Chrysanthemumindicum)是菊科植物野菊花的干燥頭狀花序，在我國(guó)分布廣泛[1]。其內(nèi)含有大量的黃酮類化合物，黃酮類化合物具有多種藥理活性，如清除自由基、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、防治血管硬化、降血糖等功能[2-3]。超聲提取工藝是一種新型提取方法，具有能耗低、效率高、不破壞有效成分等特點(diǎn)[4]。作者在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)曲面法優(yōu)化野菊花中總黃酮的超聲提取工藝，擬為研究野菊花中總黃酮的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1材料、試劑與儀器

野菊花，購(gòu)于西安萬(wàn)壽路中藥材市場(chǎng)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)水乙醇，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石油醚，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水，自制；5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、4%氫氧化鈉溶液，分析純，上海友思生物技術(shù)公司。

智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；低溫恒溫箱、多用途恒溫超聲波提取機(jī)，無(wú)錫德譜儀器制造有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；GY-753型粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限責(zé)任公司；紫外可見分光光度計(jì)，上海圣科儀器設(shè)備有限公司。

1.2野菊花預(yù)處理

挑選品質(zhì)優(yōu)良的野菊花在80 ℃干燥5 h，用粉碎機(jī)粉碎成細(xì)粉，過(guò)60目篩。精密稱取野菊花粉末5 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加入50 mL石油醚于70 ℃水浴鍋中回流3 h，除去脂肪。

1.3 總黃酮得率的測(cè)定

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，加入甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，即得到濃度為0.2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，在400～600 nm范圍內(nèi)全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在510 nm處出現(xiàn)最大吸收峰。因此，以510 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)[5]。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于25 mL容量瓶中，加蒸餾水至6 mL，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min；加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min；加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15 min。用紫外可見分光光度計(jì)在510 nm處測(cè)吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。擬合線性回歸方程為y=13.209x+0.2418，R2=0.9912，線性范圍為8～40 μg·mL-1。

1.3.4 總黃酮得率的計(jì)算

稱取預(yù)處理過(guò)的野菊花粉末5 g，超聲提取得到一定量的浸膏。將浸膏用無(wú)水乙醇溶解定容在V1容量瓶中，稀釋一定倍數(shù)，按1.3.3方法測(cè)定510 nm處吸光度，按下式計(jì)算總黃酮得率。

式中：W0為總黃酮含量,mg·mL-1；V1為樣液總體積，mL；W為野菊花粉末質(zhì)量，g;N為稀釋倍數(shù)。

1.4 提取工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別稱取野菊花粉末5 g，在保持其它條件不變的情況下進(jìn)行超聲提取，依次考察超聲提取時(shí)間(30 min、40 min、50 min、60 min)、超聲提取溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)、液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1，mL∶g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(20%、40%、60%、80%)、超聲功率(720 W、900 W、1 080 W、1 260 W)5個(gè)因素對(duì)總黃銅得率的影響。

1.4.2 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，找出對(duì)總黃酮得率影響最大的4個(gè)因素，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)，根據(jù)響應(yīng)曲面構(gòu)建的三維圖確定最佳超聲提取工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of single-factor experiment

從圖1可以看出，超聲功率(圖1c)對(duì)總黃酮得率的影響最小，當(dāng)超聲功率為1 080 W時(shí)，總黃酮得率最大。原因可能是，當(dāng)超聲功率增大時(shí)，超聲波強(qiáng)度會(huì)使空化閥逐漸升壓，產(chǎn)生空化作用，當(dāng)空化作用最強(qiáng)時(shí)提取率最佳；當(dāng)超聲功率超過(guò)空化閥升壓后，會(huì)產(chǎn)生反作用，使提取率降低。因此考慮到高效、節(jié)能，選擇1 080 W為最佳超聲功率。其它4個(gè)因素通過(guò)響應(yīng)曲面法優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間、液料比、超聲提取溫度作為自變量，以總黃酮得率為響應(yīng)值，通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，構(gòu)建三維數(shù)學(xué)模型優(yōu)化總黃酮的超聲提取工藝[6-8]。實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1，響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.1Factors and levels of experiment

表2響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2Results of response surface methodology experiment

2.2.2 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式的回歸方程擬合，得到回歸方程模型為：Y=0.86-0.034A+7.712×10-3B+0.021C-5.291×10-3D+0.017AB-0.015AC+0.021AD-7.500×10-4BC-0.051BD+0.021CD-0.093A2-0.12B2-0.077C2-0.12D2(R2=0.9227，Plt;0.0001)。通過(guò)采用響應(yīng)面的ANOVA來(lái)進(jìn)行回歸參數(shù)分析，檢驗(yàn)回歸方程模型和各項(xiàng)參數(shù)的顯著性,結(jié)果如表3所示。

表3響應(yīng)面回歸模型的方差分析

Tab.3Variance analysis of regression equation model for response surface

注：***表示Plt;0.0001，差異極顯著；**表示Plt;0.01，差異較顯著；*表示Plt;0.05，差異顯著。

2.2.3 交互作用的分析和優(yōu)化

乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間、液料比和超聲提取溫度4個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)兩兩交互作用對(duì)總黃酮得率影響的趨勢(shì)圖如圖2所示。

從圖2a可以看出，超聲提取時(shí)間的坡面比乙醇體積分?jǐn)?shù)的坡面平緩，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率影響較為顯著；二者等高線圖趨于圓形，說(shuō)明二者交互作用對(duì)總黃酮得率無(wú)顯著影響，由等高線可以確定的最佳參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲提取時(shí)間40 min。

從圖2b可以看出，液料比的坡面比乙醇體積分?jǐn)?shù)的坡面平緩，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率影響較為顯著；二者等高線圖趨于圓形，說(shuō)明二者交互作用對(duì)總黃酮得率無(wú)顯著影響，由等高線可以確定的最佳參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，液料比15∶1。

由圖2c可以看出，超聲提取溫度的坡面比乙醇體積分?jǐn)?shù)的坡面平緩，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率影響相對(duì)較為顯著；二者等高線圖趨于橢圓形，說(shuō)明二者交互作用對(duì)總黃酮得率有顯著影響，由等高線圖可以確定的最佳參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲提取溫度50 ℃。

由圖2d可以看出，液料比的坡面比超聲提取時(shí)間的坡面陡峭，說(shuō)明液料比對(duì)總黃酮得率影響相對(duì)較為顯著；二者等高線趨于圓形，說(shuō)明二者交互作用對(duì)總黃酮得率無(wú)顯著影響，由等高線圖可以確定的最佳參數(shù)為：液料比15∶1,超聲提取時(shí)間40 min。

由圖2e可以看出，超聲提取時(shí)間的坡面比超聲提取溫度的坡面陡峭，說(shuō)明超聲提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率影響相對(duì)顯著；二者等高線圖趨于橢圓形，說(shuō)明二者交互作用對(duì)總黃酮得率有顯著影響，由等高線圖可以確定的最佳參數(shù)為：超聲提取溫度50 ℃，超聲提取時(shí)間40 min。

由圖2f可以看出,液料比的坡面比超聲提取溫度的坡面陡峭，說(shuō)明液料比對(duì)總黃酮得率有顯著影響；二者等高線圖趨于橢圓形，說(shuō)明二者交互作用對(duì)總黃酮得率有顯著影響，由等高線圖可以確定的最佳參數(shù)為：液料比15∶1,超聲提取溫度50 ℃。

由響應(yīng)曲面圖可得出最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲提取時(shí)間40 min，液料比15∶1，超聲提取溫度50 ℃。

圖2 等高線圖和三維圖 Fig.2 The contour map and the response surface map

2.2.4 回歸模型驗(yàn)證

從2.2.3響應(yīng)曲面的圖形可以看出有最大的響應(yīng)值，通過(guò)軟件分析，預(yù)測(cè)最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲提取時(shí)間40 min、液料比15∶1(mL∶g)、超聲提取溫度50 ℃、超聲功率1 080 W，在此條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總黃酮平均得率為0.881%，與預(yù)測(cè)值相符。表明該模型設(shè)計(jì)合理。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)確定超聲提取野菊花中總黃酮的最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲提取時(shí)間40 min、液料比15∶1(mL∶g)、超聲提取溫度50 ℃、超聲功率1 080 W。對(duì)該工藝參數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證，總黃酮得率為0.881%。該提取工藝設(shè)計(jì)合理，為進(jìn)一步研究野菊花中總黃酮的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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OptimizationinUltrasonicExtractionofTotalFlavonoidsinChrysanthemumindicumbyResponseSurfaceMethodology

CUI Jian-qiang，LAI Pu-hui

(SchoolofMedicine,ShaanxiInstituteofInternationalTradeamp;Commerce，Xi′an710246，China)

Using total flavonoids yield as an evaluation index,we optimized the extraction process of total flavonoids fromChrysanthemumindicumby a single-factor experiment and a response surface methodology.The optimum extraction process could be determined as follows:ethanol volume fraction of 60%,ultrasonic extraction time of 40 min,extraction temperature of 50 ℃,liquid-solid ratio of 15∶1(mL∶g),and ultrasonic power of 1 080 W.Under above conditions,the total flavonoids yield reached 0.881%.The extraction process is designed rationally,which provides a scientific basis for the further research on the application of total flavonoids fromChrysanthemumindicum.

total flavonoids；ultrasound；response surface methodology

陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院科研項(xiàng)目(SMXY201715)

2017-07-07

崔建強(qiáng)(1979-)，男，陜西西安人，講師，研究方向：藥物分析化學(xué)，E-mail:1030287236@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.11.008

崔建強(qiáng),賴普輝.響應(yīng)曲面法優(yōu)化野菊花中總黃酮的超聲提取工藝[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(11)：30-34，48.

TQ461

A

1672-5425(2017)11-0030-05