姚 茹，張銳虎，王 璐，陳朝陽*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，太原 030001； 2.山西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病動(dòng)物模型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001)

小鼠支氣管肺泡灌洗術(shù)的改進(jìn)

姚 茹1,2，張銳虎1,2，王 璐1,2，陳朝陽1,2*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，太原 030001； 2.山西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病動(dòng)物模型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030001)

目的改進(jìn)制備小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)的方法。方法動(dòng)物分為3組，第1組和第2組采用傳統(tǒng)方法：使用靜脈留置針對小鼠全肺進(jìn)行支氣管肺泡灌洗術(shù)；第3組采用改進(jìn)方法：使用自制注射器對小鼠全肺進(jìn)行支氣管肺泡灌洗術(shù)。每只動(dòng)物灌洗3次，每次0.5 mL，并計(jì)時(shí)。支氣管肺泡灌洗液離心，分離上清液準(zhǔn)確測量其體積。結(jié)果灌洗液收集時(shí)間比較，第1組和第2組每只小鼠用時(shí)約10 min，第3組每只小鼠用時(shí)約4 min，差異有顯著性(P< 0.05)；小鼠支氣管肺泡灌洗液體積測量比較，第3組分別多于第1組和第2組，差異有顯著性(P< 0.05)。結(jié)論改進(jìn)后的方法可簡便、經(jīng)濟(jì)、高效地收集支氣管肺泡灌洗液，特別適合初學(xué)研究者使用。

小鼠；支氣管肺泡灌洗液；技術(shù)改進(jìn)

小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)主要用于細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù)、T淋巴細(xì)胞亞群、可溶成分、塵粒和礦物質(zhì)以及感染性病原體等方面的檢測，進(jìn)一步為有關(guān)疾病的特征、診斷及預(yù)后等提供依據(jù)，為收集足夠的灌洗液，醫(yī)學(xué)生物研究者采用很多方法，但仍沒有得到支氣管灌洗的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)方法[1-3]。第一種傳統(tǒng)方法[4]是處死小鼠后，先將小鼠氣管遠(yuǎn)心端結(jié)扎，再將靜脈留置針插入氣管，退出針芯，連接2 mL注射器直接進(jìn)行抽取，每次1 mL，灌洗2次，此方法沒有在套管進(jìn)入氣管處結(jié)扎，可能導(dǎo)致抽取過程中套管松開氣管，造成實(shí)驗(yàn)失敗。第二種傳統(tǒng)方法[5]為麻醉處死小鼠，暴露氣管，提前穿兩根線于氣管、食管之間，靜脈留置套管針插入氣管，將置于氣管、食管間的線分別在氣管近心端、遠(yuǎn)心端進(jìn)行結(jié)扎，每次0.8 mL，灌洗2次，雖然此方法彌補(bǔ)了第一種方法的缺點(diǎn)，但兩種方法都不宜結(jié)扎過緊，以免切斷氣管，也不宜過松，以免套管與氣管固定不當(dāng)造成脫落；靜脈留置針需適當(dāng)深入氣管，以免退出針芯時(shí)帶出套管；用時(shí)比較長；灌洗量較大導(dǎo)致肺內(nèi)壓力急劇升高，人為導(dǎo)致細(xì)胞滲出。

本實(shí)驗(yàn)在借鑒傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，采用自制灌洗液抽取注射器，建立了一種簡便、快捷、經(jīng)濟(jì)、高效的BALF收集方法。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF級BALB/c小鼠30只，體重為18～20 g，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供 [SCXK (晉) 2015-001]。飼養(yǎng)壞境溫度為22℃～25℃，濕度為50%～70%[SYXK(晉)2015-001]。本實(shí)驗(yàn)符合山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2主要試劑與儀器

小鼠固定板，注射器，靜脈留置針，剪刀，眼科彎鑷，眼科鑷，PBS溶液，外科縫合線，計(jì)時(shí)器。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 自制插管裝置

將一次性1 mL注射器針尖和針梗去掉，保留針?biāo)?，? cm長、直徑1 mm的PE材質(zhì)組成的長筒型塑料硬管的一端剪一斜面，便于氣管插管，另一端呈空心圓狀焊接于針?biāo)ㄉ?，最后將針?biāo)ㄇ短子谧⑸淦魅轭^(圖1)。

1.3.2 動(dòng)物分組與肺泡灌洗

隨機(jī)將動(dòng)物分為3組，每組10只。頸椎脫臼法處死小鼠后，鈍性剝離暴露氣管。第1組按傳統(tǒng)方法一收集支氣管肺泡灌洗液：先將氣管遠(yuǎn)心端結(jié)扎，將靜脈留置針插入氣管，連接2 mL注射器灌洗0.5 mL(圖2A)，輕輕按摩肺組織收集灌洗液，重復(fù)3次，并計(jì)時(shí)；第2組按傳統(tǒng)方法二收集肺泡灌洗液：先穿兩根外科縫線于氣管、食管之間，將靜脈留置套管針插入氣管，分別在套管進(jìn)入氣管處、套管遠(yuǎn)端處結(jié)扎緊，連接1 mL注射器灌洗0.5 mL(圖2B)，停留30 s緩緩回抽，重復(fù)3次，并計(jì)時(shí)；第3組按改進(jìn)后的方法收集肺泡灌洗液：暴露小鼠氣管和胸腔，用眼科彎鑷鈍性分離氣管和食管；眼科鑷支撐在氣管下方，使氣管整體處于撐開狀態(tài)，距環(huán)狀軟骨遠(yuǎn)端2～3個(gè)軟骨環(huán)之間結(jié)締組織膜處剪2～3 mm左右的切口；左手持眼科彎鑷，提起少量氣管壁，右手持自制注射器水平將塑料硬管插入氣管；輕輕推動(dòng)氣管使塑料硬管充分到達(dá)左右支氣管交叉處，可在胸腔暴露處觀察是否到達(dá)，到達(dá)后，左右手持兩把眼科鑷一前一后夾住氣管和嵌套的塑料硬管(圖2C)；注射器乳頭銜接針?biāo)?，首次進(jìn)行0.5 mL PBS溶液灌洗，觀察雙側(cè)肺膨脹，停留30 s后慢慢抽取灌洗液，可見乳白色泡沫狀液體，當(dāng)感覺活塞抽不動(dòng)有阻力時(shí)停止，轉(zhuǎn)移至離心管，灌洗3次，最后一次抽取可用手輕揉雙側(cè)肺組織，使殘留灌洗液也充分得到抽取，并計(jì)時(shí)。

1.3.3 計(jì)時(shí)方法

從動(dòng)物處死固定后為起始點(diǎn)到3次抽取灌洗液結(jié)束計(jì)時(shí)為終點(diǎn)，每只動(dòng)物操作時(shí)均計(jì)時(shí)。為保障操作熟練程度的一致性，所有操作過程均由同一人完成。

1.3.4 灌洗液體積測量

將三種方法收集的BALF立即進(jìn)行離心(4℃，1400 r/min，10 min)，分離上清液并準(zhǔn)確測定體積。

圖1 自制插管裝置Fig.1 Self-made intubation device

注：A～C：分別為第1組、第2組、第3組收集支氣管肺泡灌洗液的方法。圖2 三組肺泡灌洗方法Note. A-C: The method of BALF collection in the first, second and third group, respectively.Fig.2 Three different methods of alveolar lavage

Tab.1Comparison of the time spent for BALF preparation in a mouse of different groups

組別Groups每只小鼠灌洗液制備用時(shí)/minTimespentforBALFpreparationofeachmouse第1組Thefirstgroup10±0.75*第2組Thesecondgroup12±0.88*第3組Thethirdgroup4±0.62

注：與第3組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the third group,*P< 0.05.

Tab.2Comparison of BALF volume of each mouse collected in different groups

組別Groups每只小鼠回收體積/mLRecoveryvolumeofBALFofeachmouse回收率/%Recoveryrate第1組Thefirstgroup1.03±0.25*68.7%*第2組Thesecondgroup1.13±0.22*75.4%*第3組Thethirdgroup1.34±0.1689.6%

注：與第3組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the third group,*P< 0.05.

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1制備小鼠支氣管肺泡灌洗液實(shí)驗(yàn)時(shí)間比較

第1組和第2組每只小鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)間多于第3組，差異有顯著性(P< 0.05)，見表1。

2.2小鼠支氣管肺泡灌洗液體積的比較

每只小鼠肺泡灌洗液體積為1.5 mL，第1組和第2組肺泡灌洗液回收體積少于第3組，差異有顯著性(P< 0.05)，見表2。

3 討論

報(bào)道支氣管肺泡灌洗方法的文獻(xiàn)很多，但各有自身的操作缺點(diǎn)：需要結(jié)扎牢固避免液體從氣管漏出，小鼠氣管細(xì)且脆，結(jié)扎時(shí)太緊太松皆不可行，結(jié)扎質(zhì)量難保證；且在抽取灌洗液時(shí)難免有滑脫現(xiàn)象；直型靜脈留置針軟管不易固定，易變形和堵塞；回抽負(fù)壓太大可能損傷黏膜血管，負(fù)壓太小則又可能抽取不全，影響回收率[6]；小鼠氣管短，需要把握好留置針?biāo)腿霘夤芮闆r；操作過程繁雜；操作過程耗時(shí)長，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程和實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測定結(jié)果[7]。

本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)后的方法操作過程簡單，不使用靜脈留置針，而采用自制的塑料硬管，無需結(jié)扎，使用眼科彎鑷固定并采用1 mL注射器進(jìn)行抽取，優(yōu)化了傳統(tǒng)操作的不足之處，每只小鼠完成操作用時(shí)約4 min，回收BALF體積明顯多于采用傳統(tǒng)方法的兩組，回收率達(dá)到89.6%。本方法可簡便獲得醫(yī)學(xué)研究檢測相關(guān)的BALF，操作簡單，易于掌握。與傳統(tǒng)方法相比，本方法更為簡便、經(jīng)濟(jì)、高效。傳統(tǒng)方法需要購買靜脈留置針，若進(jìn)行大批量實(shí)驗(yàn)操作，則增加成本，在操作過程中若結(jié)扎松緊不適宜，則可能出現(xiàn)漏液現(xiàn)象，且未暴露胸腔，不便于把握適度的灌洗壓力，壓力過大可致肺破損，導(dǎo)致灌洗無效。本方法采用自制塑料硬管，較經(jīng)濟(jì)；操作過程中采用眼科鑷固定，無結(jié)扎不當(dāng)現(xiàn)象，較簡便；自制塑料硬管不易變形，無需考慮回抽力度大、變形的可能，且暴露小鼠胸腔，可更加直觀地觀察送入插管部位和肺腫脹、破壞情況，相對省時(shí)高效。

本支氣管肺泡灌洗術(shù)操作時(shí)需注意：①要充分暴露氣管和胸腔，這樣做可以更加清楚地觀察是否插管成功，能夠留出足夠的空間進(jìn)行插管，也能防止氣管上端插管失敗，繼而進(jìn)行下端插管，同時(shí)在灌洗時(shí)可通過觀察肺腫大來判斷灌洗液是否進(jìn)入雙側(cè)肺。②全過程只需注意插管到左右支氣管交叉處這一步驟，保證塑料硬管到達(dá)氣管交叉口上至少2 mm即可，若氣管切口太大或插管過程中斷裂不影響后面操作。③全程操作無需結(jié)扎，用眼科鑷固定好即可，眼科鑷比結(jié)扎線更易固定、摩擦力受力點(diǎn)大。④注意注射器乳頭與針?biāo)ㄣ暯硬灰诉^緊，以防第二次灌洗時(shí)不易分開。⑤若發(fā)現(xiàn)抽取少量時(shí)就感覺抽動(dòng)有阻力，需觀察左右支氣管交叉處管口是否吸住氣管壁，此時(shí)切不可用力抽動(dòng)以防止氣管破裂，可輕輕旋轉(zhuǎn)塑料硬管口或稍進(jìn)氣管少許。

綜上所述，本方法易于掌握、便于操作，可為廣大研究者尤其是初學(xué)者提供參考。

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Technicalimprovementofbronchoalveolarlavageinmice

YAO Ru1, 2， ZHANG Rui-hu1, 2， WANG Lu1, 2， CHEN Zhao-yang1, 2 *

(1.Laboratory Animal Center, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China； 2.Key Laboratory of Laboratory Animal Science and Animal Models of Human Diseases, Taiyuan 030001)

ObjectiveTo improve the preparation of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) in mice.MethodsBALB/c mice were divided into 3 groups. In the first and second groups, the whole lung lavage was performed with the traditional method, using a vein detained needle and lavaged with sterile saline. The mice in the third group got whole lung lavage by the improved method, namely, using a self-made plastic rigid pipe connected with a syringe. Each mouse was lavaged for 3 times, with 0.5 mL of sterile saline for each time, and the time consumption was recorded. The collected BALF was centrifuged, the supernatant was separated and its volume was measured accurately.ResultsThe time spent for BALF collection in each mouse in the third group was (4±0.62) min, significantly shorter than that of (10±0.75) and (12±0.88) min, respectively in the first and second groups (P< 0.05). The volume of BALF collected in each mouse of the third group was (1.34±0.16) mL, significantly higher than that of (1.03±0.25) and (1.13±0.22) mL, respectively in the first and second groups (P< 0.05).ConclusionsThe improved method of BALF collection described in our study is simple, economical and efficient, and is useful for beginners especially.

Mice; Bronchoalveolar lavage fluid; Technical improvement

山西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專項(xiàng)(編號(hào)：2015K02)。

姚茹(1993-)，碩士研究生，研究方向：人類疾病動(dòng)物模型。E-mail: m18734116230@163.com

陳朝陽(1972-)，副教授，研究方向：人類疾病動(dòng)物模型。E-mail: ccytycn@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0080-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.016

2017-05-11