王 吉，付 瑞，李曉波，王淑菁，王莎莎，李 威，秦 驍，鞏 薇，岳秉飛，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院，國家實驗動物微生物遺傳檢測中心，北京 100050)

牛病毒性腹瀉病毒RT-PCR方法的建立及應(yīng)用

王 吉，付 瑞，李曉波，王淑菁，王莎莎，李 威，秦 驍，鞏 薇，岳秉飛*，賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院，國家實驗動物微生物遺傳檢測中心，北京 100050)

目的建立用于牛源樣本中牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)雙重RT-PCR檢測方法。方法選擇已發(fā)表的BVDV 1型和BVDV 2型包含5’ UTR區(qū)高保守區(qū)域基因作為靶基因，分別設(shè)計合成引物，建立雙重BVDV RT-PCR方法，并對方法的特異性、敏感性、穩(wěn)定性等進行方法學評價。同時用建立的RT-PCR方法檢測了小牛血清、小牛血清去蛋白提取液、脾多肽注射液等41批次牛源性樣本和64份牛血漿樣本。牛源樣本和64份牛臨床樣本。結(jié)果建立的BVDV RT-PCR檢測方法與牛副流感病毒III型(BPIV3)、豬瘟病毒(CSFV)、乙型腦炎病毒(JEV)均無交叉反應(yīng)；檢測BVDV 1型和BVDV 2型DNA模板最低濃度分別為每微升8.87 × 102拷貝和6.31 × 102拷貝，BVDV 1型和2型cDNA在-30℃冰箱放置12個月仍可檢測出目的條帶。應(yīng)用建立的BVDV RT-PCR方法檢測41批次牛源樣本和64份牛血漿樣本，核酸陽性率分別為14.6%和29.7%。結(jié)論建立的BVDV RT-PCR檢測方法具有快速、特異、敏感及穩(wěn)定的特點，可用于牛源樣本攜帶BVDV核酸的檢測。

牛病毒性腹瀉病毒；RT-PCR；牛源樣本

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)又稱黏膜病病毒(mucosal disease virus，MDV)，屬黃病毒科(flaviviridae)瘟病毒屬(pestivirus)。病毒粒子大小為40～60 nm，為有囊膜單股正鏈RNA病毒[1-2]。BVDV可引起許多臨床癥狀及疾病，包括繁殖障礙、呼吸綜合征、先天性缺陷、腸炎、持續(xù)感染(PI)和黏膜病(MD)等，患牛表現(xiàn)發(fā)熱、白細胞減少、腹瀉、流產(chǎn)、黏膜糜爛潰瘍等急性感染癥狀及小牛先天持續(xù)性感染等癥狀。除牛以外，易感動物還包括駱駝、綿羊、山羊、豬、鹿及多種野生反芻動物。該病毒呈世界性分布，廣泛分布于美國、澳大利亞、新西蘭、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度及非洲和歐洲許多養(yǎng)牛發(fā)達國家，是危害養(yǎng)牛業(yè)的重要病原之一[2]，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[2-4]。

隨著生物醫(yī)學技術(shù)的不斷發(fā)展，動物源性生物制品的開發(fā)利用日益增多，尤其是牛源性生物制品的開發(fā)利用越來越廣泛。同時伴隨著科技及對藥品生物制品質(zhì)量發(fā)展的要求，人們對牛源性制品是否攜帶或潛在病毒污染，攜帶或潛在病毒是否會通過直接或間接途徑對人造成危害或者傳染病的擴散也越來越關(guān)注。為保障人民用藥安全及避免傳染病的擴散，最大限度地降低使用牛源性生物制品傳播牛攜帶相關(guān)病毒的風險，本實驗建立了快速、特異、敏感的BVDV雙重RT-PCR方法，用于對牛及人用牛源性生物制品及原材料可能攜帶或潛在BVDV的檢測，對保證牛源材料及牛源生物制品的使用安全性、保障人民用藥安全具有重要意義。

1 材料和方法

1.1病毒與樣品

牛病毒性腹瀉病毒1型(bovine viral diarrhea virus type 1，BVDV1)、牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)(編號分別為VR-1422、VR-281)：購自美國ATCC公司；牛病毒性腹瀉病毒2型(bovine viral diarrhea virus type 2，BVDV2)、豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)：本室凍存；乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)：由本院病毒一室提供；BVDV1和BVDV2 pGEM-T Easy-pol質(zhì)粒標準品：委托寶生物工程(大連)有限公司合成；BVDV1和BVDV2引物：由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；41批次人用牛源樣本(編號：Ny1～Ny41)：國內(nèi)8省市12個廠家和國外2個廠家提供；64份牛肛拭子樣本(編號：g1～g64)：國內(nèi)某單位提供。

1.2主要試劑與儀器

RNA快速提取試劑盒購自Qiagen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司；Taq DNA聚合酶和100 bp DNA ladder marker均購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR儀：美國Bio-Rad公司；核酸瓊脂糖凝膠電泳儀：美國Bio-Rad公司PowerPac Basic；凝膠成像分析儀：美國Kodak公司GL212 Pro。

1.3實驗方法

1.3.1 引物設(shè)計

分析已報道的BVDV基因組序列，將不同株進行比對，根據(jù)GenBank中登錄的BVDV 1型和2型毒株基因序列(序列號：M31182.1、AF502399.1)選擇包含5’ UTR區(qū)高保守區(qū)域基因作為靶基因，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計2組引物，建立雙重RT-PCR檢測方法。

表1 用于擴增5’ UTR區(qū)高保守區(qū)域2組引物序列及位置

1.3.2 病毒RNA提取

對牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、豬瘟病毒(CSFV)、乙型腦炎病毒(JEV)、正常BT細胞按照RNA/DNA快速提取試劑盒操作方法進行RNA/DNA提取。提取后的RNA立即進行cDNA的合成，剩余的RNA及DNA凍存于-70℃冰箱備用。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄

通過對隨機引物及AMV反轉(zhuǎn)錄酶濃度進行優(yōu)化，確定反轉(zhuǎn)錄體系為：5× RNA PCR buffer 2.5 μL，dNTPs mixture 2.5 μL，RNase Free ddH2O 9.5 μL，隨機引物1 μL，RNase Inhibitor 1 μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，病毒RNA 8 μL。反應(yīng)條件為：37℃，90 min；42℃，15 min；95℃，5 min。獲得cDNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 RT-PCR檢測方法的建立

以獲得的BVDV1和BVDV2質(zhì)粒為模板進行PCR擴增。對2組引物PCR反應(yīng)體系的dNTPs濃度、10×buffer濃度、Taq HS酶濃度、引物、模板量及反應(yīng)體系的退火溫度及循環(huán)次數(shù)等進行優(yōu)化，通過對正常BT細胞、BVDV1、BVDV2進行PCR擴增來確定RT-PCR反應(yīng)的最佳模式[6]。

1.3.5 RT-PCR產(chǎn)物的檢測

取5 μL擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL溴化乙錠)進行電泳鑒定。電泳緩沖液為1× TAE buffer(0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA，pH 8.0)，110 V電泳30 min，在紫外成像儀下觀察PCR產(chǎn)物條帶在凝膠中的位置，以100 bp DNA ladder marker為參照物，判定結(jié)果。RT-PCR陽性擴增片段進行測序，通過與GenBank中BVDV1和BVDV2序列進行比對以確定PCR檢測的準確性[6]。

1.3.6 特異性試驗

用2組引物分別以正常BT細胞、BVDV1質(zhì)粒標準品、BVDV2質(zhì)粒標準品、牛副流感病毒3型(BPIV3)、豬瘟病毒(CSFV)、乙型腦炎病毒(JEV)cDNA為模板，用所建立的PCR方法進行擴增，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定[6]。

1.3.7 敏感性試驗

將起始濃度為每微升8.87 × 1010拷貝和6.31 × 1010拷貝的BVDV1和BVDV2質(zhì)粒樣本做系列倍比稀釋，分設(shè)10-3到10-9共7個濃度梯度進行RT-PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷所能擴增的最小DNA質(zhì)粒模板濃度[6]。

1.3.8 穩(wěn)定性和重復(fù)性實驗

BVDV1和BVDV2質(zhì)粒及同一批PCR檢測試劑于-30℃冰箱放置3個月、6個月、12個月時，進行PCR檢測。3次試驗各做3個重復(fù)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定[5]。

1.3.9 方法的應(yīng)用及驗證

BVDV1、BVDV2、正常BT細胞、2份已知BVDV陰性對照牛血清、64份牛肛拭子樣本(編號：g1～g64)、41批次人用牛源生物制品及原材料樣本(編號：Ny1～Ny41)，具體信息見表2。同時提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，用2組引物進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定。

擴增到的陽性樣品，需要對可見的特異性目的條帶進行純化測序。測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析，與GenBank中BVDV1和BVDV2核酸序列進行比對，驗證檢測結(jié)果的準確性。

2 結(jié)果

2.1PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

通過對2組引物PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)體系的優(yōu)化，確定了PCR最佳反應(yīng)體系為：10× Ex Taq buffer(含Mg2+)2 μL，dNTPs mixture(10 mmol/L)2 μL，Taq HS酶(5 U/μL)0.5 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，DNA 2 μL，補水至20 μL；PCR最佳反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃再延伸5 min。

2.2PCR產(chǎn)物的檢測及特異性實驗

2組引物特異性實驗顯示，以BVDV1質(zhì)粒和BVDV2質(zhì)粒為模版有明顯目的條帶出現(xiàn)，以BPIV3、CSFV、JEV及正常BT細胞的cDNA為模版，均無目的條帶出現(xiàn)(見圖1)。結(jié)果顯示特異性可以達到100%。

2.3檢測結(jié)果的準確性

選擇引物1和引物2，PCR擴增BVDV 1型和BVDV 2型陽性片段進行測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析，與GenBank中BVDV 1型和BVDV 2型核酸序列同源性均為99%，說明該方法檢測準確性較好。

2.4敏感性試驗

圖2結(jié)果顯示2組引物檢測病毒DNA濃度均可以達到每微升102拷貝。

表2 41批次牛源樣本信息

注：M：100 bp DNA ladder marker；1：BVDV；2：BT細胞對照；3：BPIV3；4：CSFV；5：JEV。圖1 引物特異性驗證Note. M: 100 bp DNA ladder marker; 1: BVDV; 2: BT cells for control; 3: BPIV3; 4: CSFV; 5: JEV.Fig.1 Specificity validation of the primers

注：M：100 bp DNA ladder marker；1～7：10-3～10-9稀釋。圖2 通過BVDV質(zhì)粒濃度梯度測定2對引物PCR檢測敏感性Note. M: 100 bp DNA ladder marker; 1-7: 10-3-10-9 dilution.Fig.2 Sensitivity of 2 pairs of primers determined by BVDV plasmid in gradient concentration

2.5穩(wěn)定性和重復(fù)性實驗

電泳結(jié)果顯示，BVDV質(zhì)粒標準品在-30℃冰箱放置3個月、6個月、12個月時，用2組引物進行檢測，分別能擴增出約151 bp和303 bp可見目的條帶(圖3)。

注：M：100 bp DNA ladder marker；1～3：-30℃冰箱放置3個月的質(zhì)粒標準品；4～6：-30℃冰箱放置6個月的質(zhì)粒標準品；7～9：-30℃冰箱放置12個月的質(zhì)粒標準品。圖3 2組引物PCR檢測穩(wěn)定性Note. M: 100 bp DNA ladder marker; 1-3: Plasmid standard sample stored at -30℃ for 3 months; 4-6: Plasmid standard sample stored at -30℃ for 6 months; 7-9: Plasmid standard sample stored at -30℃ for 12 months.Fig.3 Stability of the 2 pairs of primers

注：M：100 bp DNA ladder marker；1，46：BVDV；2，47：BT細胞；3～23：g1～g21；24～45：g22～g43；48～68：g44～g64。圖4 PCR檢測64份牛肛拭子樣本(g1～g64)電泳結(jié)果Note. M: 100 bp DNA ladder marker; 1, 46: BVDV; 2, 47: BT cells; 3-23: g1-g21 bovine anal swab samples; 24-45: g22-g43 bovine anal swab samples; 48-68: g44-g64 bovine anal swab samples.Fig.4 Results of electrophoresis of 64 bovine anal swab samples (g1-g64) detected by the PCR method

2.6對牛肛拭子樣本檢測

對64份牛肛拭子樣本(編號：g1～g64)進行檢測，電泳結(jié)果顯示有19份肛拭子樣本(編號：g1、g4、g9、g15、g17、g34、g35、g43、g48、g51、g54～g61、g63)擴增出約303 bp的可見目的條帶，正常BT細胞和其他45份牛肛拭子本未擴增出可見目的條帶。樣本電泳結(jié)果見圖4。

2.7對牛源性樣本進行病毒檢測

對41批次牛源樣本進行BVDV1和BVDV2病毒檢測，有5批次牛源樣本(編號：Ny16、Ny29、Ny32、Ny35、Ny41)擴增出約303 bp的可見目的條帶，有1批次牛源樣本(編號：Ny26)擴增出約151 bp的可見目的條帶，其他35批次牛源樣本未擴增到可見目的條帶。樣本電泳結(jié)果見圖5。

注：M：100 bp DNA ladder marker；1，44∶2型BVDV；2，25，43：BT細胞；3～4：陰性牛血清對照；5～23：Ny1～Ny19牛源樣本；24:1型BVDV；26～33：Ny20～Ny27；34～42：Ny28～Ny36；45～49：Ny37～Ny41。圖5 PCR檢測41批次牛源樣本(Ny1～Ny41)1型和2型BVDV病毒的電泳結(jié)果Note. M: 100 bp DNA ladder marker; 1, 44: BVDV2; 2, 25, 43: BT cells; 3-4: Negative bovine serum control; 5-23: Ny1-Ny19 bovine-derived samples; 24: BVDV1; 26-33: Ny20-Ny27 bovine-derived samples; 34-42: Ny28-Ny36 bovine-derived samples; 45-49: Ny37-Ny41 bovine-derived samples.Fig.5 Results of electrophoresis of BVDV1 and BVDV2 in 41 bovine-derived samples (Ny1-Ny41) detected by the PCR method

2.8檢測結(jié)果的驗證

將1型BVDV和2型BVDV與GenBank中BVDV1和BVDV2標準株核苷酸序列進行比對，其同源性均為99%；BVDV2核酸陽性樣本g1、g4、g9、g15、g17、g34、g35、g43、g48、g51、g54～g61、g63、Ny16、Ny29、Ny32、Ny35、Ny41擴增產(chǎn)物純化測序，與GenBank中BVDV2標準株核苷酸序列進行比對，其同源性均在95%以上；BVDV1核酸陽性樣本Ny26擴增產(chǎn)物純化測序，與GenBank中BVDV1標準株核苷酸序列進行比對，其同源性為98%。檢測結(jié)果顯示牛肛拭子樣本陽性率為29.69%(19/64)，牛源樣本陽性率為14.6%(6/41)。

3 討論

BVDV是牛感染率較高、危害性較大的傳染病病原之一，國內(nèi)外已建立了多種檢測方法，包括血清學及PCR檢測方法等[2, 3,7-9]。但未見有針對牛源制品及牛源制品原輔材料外源BVDV檢測的報道，中華人民共和國藥典亦沒有關(guān)于牛源制品及原輔材料檢測的規(guī)定[10]。藥典在“新生小牛血清檢測”中雖然有關(guān)于新生牛血清用細胞接種法和免疫熒光法檢測病毒的規(guī)定[10]，但沒有更為敏感特異的分子生物學檢測方法，針對人用牛源性材料及人用牛源性生物制品的檢測還是空白。

本研究檢測了國內(nèi)外4個廠家人用生物制品成品(包括小牛血清去蛋白提取液、脾多肽注射液、重組牛堿性成纖維細胞生長因子滴眼液等)11批次，結(jié)果均為陰性；檢測國內(nèi)外10個廠家用于生產(chǎn)人用牛源性生物制品的原料小牛血清及實驗用小牛血清(包括胎牛血清)30批次，陽性率為20%(6/30)。6批次BVDV核酸陽性小牛血清分別屬于5個省市的5個廠家，BVDV檢出率為50%。檢測的64份牛肛拭子樣本又來源另一省市，由此可見BVDV分布范圍之廣及對人用牛源性生物制品存在的潛在危險。

我們建立的BVDV RT-PCR檢測方法，其目的主要是用于牛及人用牛源性生物制品、及人用牛源性生物制品原材料攜帶或潛在污染BVDV的檢測，如小牛血清去蛋白注射液、牛肉浸液、牛膽膏、牛骨粉、牛骨源性明膠；以及用于生產(chǎn)牛源制品的原材料，如牛血漿、牛組織、牛源細胞等。張淑琴等[4]從送檢的牛腎細胞(MDBK細胞)中分離到BVDV病毒，本實驗也在用于生產(chǎn)牛源生物制品的牛血漿中檢測到BVDV。說明用于牛源生物制品生產(chǎn)的原材料確實存在BVDV的污染。

為了保障人民用藥的安全，最大限度地降低使用牛源性生物制品傳播牛攜帶相關(guān)病毒的風險，我們建立了特異、敏感、操作簡單的RT-PCR方法，用于牛及牛源性生物制品及其原輔材料攜帶外源病毒的檢測，完善了BVDV的檢測技術(shù)，為研發(fā)BVDV RT-PCR檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)，也為今后制定相關(guān)技術(shù)的國家標準，在全國范圍內(nèi)推動牛源制品生產(chǎn)企業(yè)開展牛源制品及原輔材料BVDV檢測提供了技術(shù)支撐。

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EstablishmentandapplicationofaRT-PCRdetectionmethodforbovineviraldiarrheavirus

WANG Ji， FU Rui， LI Xiao-bo， WANG Shu-jing， WANG Sha-sha， LI Wei， QIN Xiao， GONG Wei， YUE Bing-fei*， HE Zheng-ming

(National Institutes for Food and Drug Control, National Center for Quality of Laboratory Animal, Beijing 102629, China)

ObjectiveTo establish a dual RT-PCR detection method for bovine viral diarrhea virus (BVDV) in bovine-derived samples.MethodsThe primers were designed and synthesized according to the published BVDV1 and BVDV2 genes containing highly conservative sequences in the 5’ untranslated regions (5’ UTR) to establish the dual RT-PCR method. The specificity, sensitivity, stability of this method were evaluated. Then 41 bovine-derived samples and 64 bovine plasma samples including bovine calf serum, deproteinized calf serum extract and one lienal polypeptide injection were detected with this method.ResultsThere was no cross reaction with bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV3), classical swine fever virus (CSFV) and Japanese encephalitis virus (JEV) when samples were detected with the established dual RT-PCR method. The lowest concentration of template DNA for detection of BVDV1 and BVDV2 was 8.87 × 102copies and 6.31 × 102copies per microliter, respectively. Electrophoresis bands of about 151 bp and 303 bp were still amplified and detected after the BVDV1 and BVDV2 cDNA was stored at -30℃ for 12 months. The BVDV positive rate of 41 bovine-derived samples and 64 bovine plasma samples detected with this dual RT-PCR method was 14.6% and 29.7%, respectively.ConclusionsThe established dual RT-PCR method has the advantages of high efficiency, specificity, sensitivity and stability, and can be used for the detection of BVDV in bovine-derived samples.

Bovine viral diarrhea virus; RT-PCR; Bovine-derived samples

中國食品藥品檢定研究院學科帶頭人培養(yǎng)基金項目(編號：2015X5)。

王吉(1974 -)，女，副研究員，研究方向：微生物學和免疫學。E-mail: wj_nd_jds@sina.com

岳秉飛(1960 -)，研究員，研究方向：實驗動物學。E-mail: y6784@126.com

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0068-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.014

2017-05-11