朱 琦，陳 濤，劉 蓉，，孫 紅，陳曉雯，龍 航，石燕情，譚亞夏*

(1.呼吸疾病國家重點實驗室，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510120； 2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，廣州 510120； 3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廣州 510120)

CKLF1-C19對昆明小鼠的急性毒性研究

(1.呼吸疾病國家重點實驗室，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510120； 2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，廣州 510120； 3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廣州 510120)

目的研究趨化素樣因子1(CKLF1)的多肽CKLF1-C19對昆明小鼠的急性毒性作用。方法以25 mL/kg的CKLF1-C19(100 μg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL三種濃度)劑量注射實驗組小鼠，對照組則給予同等體積生理鹽水，給藥后隔天記錄小鼠的體重變化，密切觀察實驗組小鼠的一般狀況。結(jié)束實驗后留取小鼠腹主動脈血檢測肝腎功能；留取肝、腎、脾、肺組織觀察外觀、做HE染色及常規(guī)組織病理學(xué)檢查。結(jié)果兩組小鼠一般狀況良好，體重緩慢增長，兩組小鼠體重變化差異無顯著性(P> 0.05)，14 d后均無死亡情況；兩組小鼠肝腎功能相關(guān)的血液生化結(jié)果差異無顯著性(P> 0.05)；肉眼觀察兩組小鼠心臟、肝、腎、脾、肺等臟器正常， 肝、腎、脾、肺組織HE染色后結(jié)構(gòu)清晰，未見異常。結(jié)論CKLF1-C19對小鼠無急性毒性作用。

CKLF1；急性毒性；小鼠

趨化素樣因子1(chemokine-like factor 1，CKLF1)是我國北京大學(xué)人類疾病基因研究中心在國際上首次報道的一個新的人類細胞因子[1]，具有自主知識產(chǎn)權(quán)。CKLF1具備趨化因子CC亞家族的特征性結(jié)構(gòu)[1]，含有兩個CKLF1的分泌型多肽CKLF1-C19和C27[2]。CKLF1及其兩個多肽的功能性受體都是CCR4[2, 3]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)CKLF1在哮喘患者的氣道黏膜中高表達[4]，CKLF1基因?qū)肟梢l(fā)小鼠支氣管肺的炎性損傷改變，其部分病變極似哮喘氣道重塑的病理表現(xiàn)[5, 6]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)CKLF1-C19具有抑制哮喘小鼠肺部炎癥及降低小鼠過敏性鼻部炎癥反應(yīng)的作用[7, 8]，因而推測CKLF1-C19可能通過與CKLF1競爭CCR4受體而達到抑制炎癥的作用。本試驗通過單次尾靜脈注射CKLF1-C19，觀察動物的急性毒性反應(yīng)，以探討CKLF1-C19使用的安全性，從而為生產(chǎn)具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新藥奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1實驗動物

SPF級昆明小鼠，體重21～24 g，雌雄各半，來源于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心 [SCXK (粵) 2013-0002]，動物合格證號：00002006。小鼠分籠飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病國家重點實驗室的動物實驗室屏障環(huán)境 [SYXK (粵) 2013-0093]。小鼠的飼養(yǎng)溫度為25℃～28℃，相對濕度為50%～60%。實驗前進行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2主要試劑與儀器

CKLF1-C19多肽，深圳瀚宇藥業(yè)股份有限公司合成。

DM 4000B顯微鏡，RM2235石蠟切片機，染色蓋片工作站ST5020均購自德國Leica公司；全自動生化分析儀購自美國Beckman公司。

1.3實驗方法

1.3.1 預(yù)實驗

取雌性昆明小鼠15只，隨機均分為3組，實驗前禁食12 h，自由飲水[9]。將CKLF1-C19用生理鹽水配置成100 μg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL三組不同濃度的試藥。按25 mL/kg給藥體積單次尾靜脈注射給藥后，連續(xù)觀察14 d，記錄各小鼠的一般情況和不良反應(yīng)。

1.3.2 急性毒性試驗

預(yù)實驗結(jié)果顯示，各組小鼠均無死亡，無法計算其半數(shù)致死量(median lethal dose)LD50值，遂采用最大耐受量實驗。依據(jù)小鼠最大耐受量0.5 mL/20 g[10]及注射濃度20 mg/mL計算，實驗組小鼠CKLF1-C19用量為0.5 mL/20 g，相當于8 mg/只。前期報道CKLF1-C19治療哮喘小鼠的有效濃度為1～100 μg/只[7]，則本實驗的給藥濃度已達到最高有效濃度的80倍。

實驗選取40只昆明小鼠，隨機均分為給藥組和對照組，雌雄各半。小鼠禁食不禁水12 h后，給藥組按上述用量給藥，對照組予同等體積生理鹽水。給藥后隔天記錄小鼠體重，密切觀察小鼠的皮毛、行為活動、進食飲水、眼口鼻分泌物、呼吸等一般狀況,及有無豎毛、步伐不穩(wěn)、四肢癱瘓、驚厥、呼吸抑制等不良反應(yīng)甚至死亡現(xiàn)象。連續(xù)觀察14 d[11]。

1.3.3 生化指標檢測

給藥后第15天，麻醉小鼠進行腹主動脈采血，全血離心后取上清，應(yīng)用全自動生化儀檢測小鼠血清中肝腎功能相關(guān)的生化指標，即血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CRE)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspertate aminotransferase，AST)、總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALP)、總膽固醇(total cholesterol，TCHO)、甘油三酯(triglyceride，TG)。

1.3.4 病理學(xué)檢查

實驗期間無小鼠死亡現(xiàn)象，實驗結(jié)束后處死小鼠并解剖，肉眼觀察小鼠心臟、肝、腎、脾、肺等器官有無明顯病變。將肝、腎、脾、肺組織置于4%中性甲醛中固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，HE染色，常規(guī)組織病理學(xué)檢查。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1小鼠一般體征觀察及體重變化情況

實驗過程中，兩組小鼠均皮毛光潔、無豎毛現(xiàn)象。小鼠活動自如，未見步伐不穩(wěn)、煩躁不安、肌肉震顫、僵直或強迫運動。無呼吸急促或過緩，眼口鼻無異常分泌物，大便結(jié)實，進食量及攝水量正常無改變，兩組小鼠均無死亡情況。

兩組小鼠體重均緩慢增長，趨勢基本一致，組間差異無顯著性(P> 0.05)(圖1)。

2.2血液生化指標

實驗組小鼠的BUN、CRE、ALT、AST、TP、ALP、TCHO、TG與對照組比較，組間差異無顯著性(P> 0.05)(表1)。

圖1 14 d急性毒性試驗對小鼠體重的影響Fig.1 Effect of CKLF1-C19 on body weight of mice observed for 14 days during the acute toxicity test

Tab.1Comparison of blood biochemical indexes in the mice

組別Groups尿素氮/mmol/LUreanitrogen肌酐/μmol/LCreatinine谷丙轉(zhuǎn)氨酶/U/LAlaninetransaminase谷草轉(zhuǎn)氨酶/U/LAspartateaminotransferase總蛋白/g/LTotalprotein白蛋白/g/LAlbumin總膽固醇/mmol/LTotalcholesterol甘油三酯/mmol/LTriglyceride實驗組Experimentalgroup10.2±3.1*21.5±8.5*39.9±10.3*111.7±20.4*41.3±4.0*21.5±8.4*1.63±0.4*0.65±0.28*對照組Controlgroup9.1±3.721.9±8.040±11.2101.2±27.437.5±8.222.0±8.01.63±0.40.70±0.20

注：與對照組相比，*P> 0.05。

Note. Compared with the control group,*P> 0.05.

2.3小鼠主要臟器肉眼觀察及組織病理改變

肉眼觀察實驗組小鼠心臟、肝、腎、脾、肺等器官色澤明亮，質(zhì)地鮮嫩，未見臟器明顯的腫大、萎縮、充血、出血、水腫或壞死及其他病理改變，與對照組比較未見明顯差異。小鼠肝、腎、脾、肺的石蠟切片采用HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝、腎、脾、肺的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)：實驗組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，中央靜脈結(jié)構(gòu)正常，肝竇和肝索清晰可見；腎小球輪廓清晰，結(jié)構(gòu)完整，系膜未見增寬，未見炎性細胞浸潤；脾結(jié)構(gòu)完整，脾索、脾血竇及脾內(nèi)淋巴小結(jié)均清晰可見；肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)未見滲出，肺間質(zhì)未見炎性細胞浸潤。上述各組織學(xué)觀察均與對照組無明顯差異(圖2)。

注：實驗組肝(A)、腎(C)、脾(E)、肺(G)；對照組肝(B)、腎(D)、脾(F)、肺(H)。標尺長度為5 μm。圖2 14 d急性毒性試驗小鼠肝、腎、脾及肺組織HE染色結(jié)果Note. Tissues of liver (A), kidney (C), spleen (E) and lung (G) in the experimental group; Tissues of liver (B), kidney (D), spleen (F) and lung (H) in the control group. Bars=5 μm.Fig.2 Pathological changes of liver, kidney, spleen and lung tissues in the mice at 14 days during the acute toxicity test. HE staining

3 討論

近50年來，過敏性疾病的發(fā)病率一直不斷上升。大多數(shù)發(fā)達國家已有超過20%的人口罹患過敏性疾病[12]。其中，支氣管哮喘和過敏性鼻炎是發(fā)病率上升最快的疾病[10]，全球患病人數(shù)已分別高達4億人和3億人[12]，已然成為嚴重威脅公眾健康的主要慢性病之一。目前臨床上治療過敏性疾病的藥物絕大多數(shù)是糖皮質(zhì)激素和各種免疫抑制劑，但這些藥物長期使用易導(dǎo)致患者免疫功能的損傷，增加感染風險。此外對激素抵抗的過敏性疾病仍缺乏有效的治療手段。因此，開發(fā)有效且副作用少的新型藥物實為必要。

CKLF1是我國學(xué)者首次報道的一個新的人類細胞因子[1]，對人中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞均有明顯的趨化活性[1]，其功能性受體為CCR4[3]。本課題組的前期研究顯示CKLF1在哮喘患者的氣道黏膜中高表達[4]。將CKLF1基因?qū)胄∈篌w內(nèi)，可引發(fā)小鼠類似哮喘氣道重塑的病理變化[5, 6]。CKLF1-C19是CKLF1的C端衍生肽，其功能性受體亦是CCR4[2]。相關(guān)研究表明，CKLF1-C19可顯著抑制哮喘小鼠肺部炎癥及降低小鼠過敏性鼻部炎癥反應(yīng)[7, 8]。此外，新近研究發(fā)現(xiàn)，CKLF1-C19還可減輕特應(yīng)性皮炎小鼠表皮增厚、真皮血管擴張充血、炎性細胞浸潤等癥狀，上調(diào)小鼠皮損中部分調(diào)節(jié)炎癥細胞因子特定基因表達的microRNA[13]。推測CKLF1-C19是通過部分地抑制其它趨化因子與CCR4受體的結(jié)合，從而抑制了小鼠體內(nèi)的炎癥和超敏反應(yīng)，因此有望在治療過敏性疾病所致的炎癥中發(fā)揮作用。

藥物臨床前安全性評價是判斷其能否進入臨床研究的關(guān)鍵，是評估藥物臨床研究的風險程度及其開發(fā)價值的重要參考依據(jù)[14-18]。而急性毒性試驗是研究和確認藥物對機體毒效性的第一步，它指在24 h內(nèi)單次或多次大劑量給予受試物后，觀察實驗動物發(fā)生的各種中毒表現(xiàn)及嚴重程度，以測定藥物的半數(shù)致死量LD50及相關(guān)參數(shù)的試驗[19]。因預(yù)實驗中無小鼠死亡，無法計算CKLF1-C19半數(shù)致死量LD50值，故本實驗采用最大耐受量測定法，即用最大給藥濃度和最大給藥容量單次或24 h內(nèi)數(shù)次給藥，觀察動物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)[10]。本實驗中CKLF1-C19給藥量為8 mg/只，是CKLF1-C19最大有效劑量100 μg/只的80倍。實驗期間，小鼠活動飲食等一般情況無異常，體重正常增長。

肝臟和腎臟是參與藥物代謝與排泄的主要器官，也是藥物毒副作用的主要靶器官，藥物源性的肝腎毒性是制約藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用的最大障礙。為了考察CKLF1-C19的肝腎毒性，本實驗進行了肝腎及其它重要器官的病理切片觀察以及與肝腎功能相關(guān)的生化指標檢測。實驗結(jié)束后，肉眼觀察小鼠臟器均未發(fā)現(xiàn)明顯病變現(xiàn)象，肝、腎、脾、肺的病理切片也未發(fā)現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)的異常。BUN、CRE、ALT、AST等多項生化指標均未發(fā)現(xiàn)異常改變。綜上所述，CKLF1-C19對小鼠無急性毒性作用。

多肽藥物是一類以氨基酸為基本結(jié)構(gòu)單位而發(fā)展起來的新型藥物。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成藥相比，多肽藥物擁有良好的特異性和耐受性，藥用效價比高，毒性反應(yīng)弱，在體內(nèi)不易產(chǎn)生蓄積等優(yōu)勢[20, 21]，目前已成為新藥研發(fā)和生產(chǎn)的熱點之一。本實驗所用CKLF1-C19多肽是受專利保護的具有良好應(yīng)用前景的新結(jié)構(gòu)新機制的生物技術(shù)藥物，本實驗結(jié)果為CKLF1-C19的合理開發(fā)與利用提供了有益的實驗依據(jù)。

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ExplorationofacutetoxicityeffectofCKLF1-C19onKMmice

(1.State Key Laboratory of Respiratory Disease； 2.Department of Clinical Laboratory； 3.Department of Pathology; the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, China)

ObjectiveTo explore the acute toxicity effect of CKLF1-C19, a polypeptide of chemokine-like factor 1 (CKLF1), on the KM mice.MethodsA total of 40 KM mice, half male and half female, were randomly divided into 2 groups. The mice in the experimental group were injected with CKLF1-C19 at a dose of 25 mL/kg (100 μg/mL, 1 mg/mL and 10 mg/mL) through the tail vein, and those in the control group

an equal volume of sterile saline solution. Changes in the body weight of the mice were recorded the day after treatment, and the general conditions of mice in the experimental group were observed closely and compared with the normal group. Then blood samples were taken from the abdominal aorta to measure liver and kidney function. Tissue samples of liver, kidney, spleen and lung were taken for histopathological examination by HE staining.ResultsIn the maximum tolerance test, the mice of the two groups were in good condition, and their body weight was increased gradually, without significant difference between the experimental group and the control group (P> 0.05). There was no death within 14 days. The blood biochemical indexes of liver and kidney function showed no significant differences between the two groups (P> 0.05). The gross appearances of heart, liver, kidney, spleen and lung were normal in the two mouse groups, and the pathological examination with HE staining showed normal clear structure with no obvious changes in these organs of each group.ConclusionsOur results demonstrate that CKLF1-C19 has no acute toxicity effect on mice.

CKLF1; Acute toxicity; Mice

廣州呼吸疾病國家重點實驗室開放課題項目(編號：2014SKLRD-O04)。

朱琦(1986 -)，男，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：肺炎性損傷與重塑。E-mail: negu@163.com

譚亞夏(1955 -)，女，教授，研究方向：肺炎性損傷與重塑。E-mail: yaxiatan@vip.163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0019-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.005

2016-12-14