吳 超，唐 薇，趙宏斌，李進(jìn)濤，角建林，袁 鑫，鄭 紅*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，昆明 650500； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科教部，昆明 650032； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，昆明 650032； 4.昆明醫(yī)科大學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)移中心，昆明 650031)

研究報(bào)告

恒古骨傷愈合劑對(duì)骨折樹鼩血液生理和臟器系數(shù)的影響

吳 超1，唐 薇2，趙宏斌3，李進(jìn)濤1，角建林4，袁 鑫2，鄭 紅1*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，昆明 650500； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科教部，昆明 650032； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，昆明 650032； 4.昆明醫(yī)科大學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)移中心，昆明 650031)

目的評(píng)價(jià)恒古骨傷愈合劑對(duì)去勢(shì)樹鼩骨質(zhì)疏松性骨折模型的血液生理指標(biāo)和臟器系數(shù)的影響。方法30只雌性樹鼩分為對(duì)照組、模型組和治療組。治療組和模型組樹鼩切除雙側(cè)卵巢6個(gè)月證實(shí)骨質(zhì)疏松后再造成脛骨骨折。于骨折次日起，治療組用恒古骨傷愈合劑灌胃，每兩天1次；模型組和對(duì)照組用等量生理鹽水灌胃。灌胃3個(gè)月后，檢測(cè)各組樹鼩血液生理指標(biāo)和臟器系數(shù)。結(jié)果在16項(xiàng)血液生理指標(biāo)中，模型組白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值和百分率顯著低于對(duì)照組(P< 0.01)，單核細(xì)胞百分比和絕對(duì)值也降低(P< 0.05)。與模型組比較，治療組單核細(xì)胞百分比和絕對(duì)值顯著升高(P< 0.01)，淋巴細(xì)胞絕對(duì)值和百分率以及白細(xì)胞數(shù)顯著升高(P< 0.05)，且治療組脾臟系數(shù)明顯高于模型組(P< 0.05)。結(jié)論恒古骨傷愈合劑提高骨質(zhì)疏松性骨折樹鼩的免疫力。

雙側(cè)去卵巢；骨質(zhì)疏松性骨折；樹鼩；免疫力；恒古骨傷愈合劑

恒古骨傷愈合劑(Osteoking，OK)源自云南南部彝族古方，是我國擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、云南省重點(diǎn)支持開發(fā)的藥品。該藥物根據(jù)彝族醫(yī)藥關(guān)于哎哺、八宮、八極、六(八)色、天五行、地五行、人五行的理論，是治療骨折、骨病等的內(nèi)服方藥，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，例如微量元素和氨基酸等物質(zhì)，可促進(jìn)軟組織損傷修復(fù)和水腫吸收，減少炎性滲出物對(duì)神經(jīng)末梢的刺激，緩解疼痛[1]。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明恒古骨傷愈合劑對(duì)骨質(zhì)疏松有一定的療效，并且能促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折(osteopoorotic fracture，OPF)愈合[2-4]，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究通過建立骨質(zhì)疏松骨折樹鼩模型，同時(shí)給予恒古骨傷愈合劑干預(yù)，對(duì)比觀察樹鼩血液中單核細(xì)胞(monocytes，MONO)、淋巴細(xì)胞(lymphocytes，LYMPH)、白細(xì)胞(white blood cells，WBC)、紅細(xì)胞(red blood cells，RBC)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、血小板(platelet，PLT)等16項(xiàng)血液生理指標(biāo)和脾(spleen)等6項(xiàng)臟器系數(shù)及體重(body weight，BW)的變化，旨在觀察恒古骨傷愈合劑對(duì)OPF樹鼩的保護(hù)作用，初步探討其作用機(jī)制，為恒古骨傷愈合劑治療OPF提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)4月齡滇西亞種樹鼩40只，雌性，體重為100～140 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供 [SCXK (滇) K2013-002]。樹鼩飼養(yǎng)室溫度：22℃～25℃，相對(duì)濕度45%～60%，每天人工光照12 h [SYXK (滇) K2015-002]。動(dòng)物飼喂顆粒飼料，自由飲水。實(shí)驗(yàn)操作過程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2主要試劑與儀器

恒古骨傷愈合劑，25 mL/瓶，每毫升含生藥0.36 g，云南克雷斯天然藥物制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)20150406；貝克曼庫爾特Diff-2型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀，檢測(cè)試劑為原裝配套試劑；梅特勒me204e萬分之一天平；美國GE公司Prodigy型DXA骨密度儀。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型建立、分組和給藥

10只雌性樹鼩切除雙側(cè)卵巢部分脂肪組織，作為對(duì)照組。30只雌性樹鼩切除雙側(cè)卵巢，術(shù)后6個(gè)月用DXA骨密度儀測(cè)定樹鼩全身骨密度，選擇骨密度降低25%的20只，右側(cè)后肢行脛骨骨折術(shù)，建立去卵巢樹鼩骨質(zhì)疏松骨折模型：其中10只為模型組，10只為治療組。治療組經(jīng)灌胃方式，給予恒古骨傷愈合劑(0.45 mg/次)，每兩天1次，服用3個(gè)月。模型組和對(duì)照組給予同等劑量生理鹽水灌胃。每周稱重以調(diào)整給藥劑量。

1.3.2 血樣、臟器采集和檢測(cè)

樹鼩禁食12 h，稱量體重。非麻醉狀態(tài)下心臟采血0.5 mL，裝入乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管，混勻，設(shè)定好全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀精度，按照標(biāo)準(zhǔn)操作方法測(cè)定血液生理指標(biāo)。麻醉處死動(dòng)物，采集臟器，稱量臟器重量，計(jì)算臟器系數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

在檢測(cè)的16項(xiàng)生理指標(biāo)中，與模型組比較，治療組單核細(xì)胞百分比與單核細(xì)胞絕對(duì)值的水平明顯上升，差異有顯著性(P< 0.01)；治療組淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、淋巴細(xì)胞百分率、白細(xì)胞數(shù)顯著增加(P< 0.05)，其余各項(xiàng)指標(biāo)差異無顯著性(P> 0.05)。與對(duì)照組比較，模型組樹鼩白細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞絕對(duì)值、單核細(xì)胞百分比顯著減少(P< 0.01)；淋巴細(xì)胞絕對(duì)值，淋巴細(xì)胞百分率顯著減少(P< 0.05)；其他指標(biāo)，包括紅細(xì)胞數(shù)、體積、比容和分布寬度，血紅蛋白量、容量和濃度，血小板數(shù)、體積和壓積，在三組間差異無顯著性(P> 0.05)(表1)。

三組樹鼩中，模型組體重顯著高于治療組和對(duì)照組(P< 0.01)，治療組與對(duì)照組差異無顯著性(P> 0.05)。模型組脾系數(shù)顯著低于對(duì)照組(P< 0.01)；治療組顯著高于模型組(P< 0.05)。三組樹鼩其他臟器系數(shù)組間兩兩比較，差異均無顯著性(P> 0.05)(表2)。

Tab.1Comparison of blood physiological parameters of tree shrews in the three groups

指標(biāo)Parameters對(duì)照組Controlgroup模型組Modelgroup治療組Treatmentgroup單核細(xì)胞百分比/%PercentageofMONO28.060±2.74410.300±2.943**18.680±2.744ΔΔ單核細(xì)胞絕對(duì)值/109/LAbsolutevalueofMONO0.720±0.1870.125±0.035**0.285±0.053ΔΔ淋巴細(xì)胞百分率/%PercentageofLYMPH71.690±7.89261.920±7.694*70.130±5.962Δ淋巴細(xì)胞絕對(duì)值/109/LAbsolutevalueofLYMPH1.315±0.3021.155±0.347*1.293±0.262Δ白細(xì)胞計(jì)數(shù)/109/LWBCcount2.300±0.6161.300±0.413**1.750±0.460Δ紅細(xì)胞計(jì)數(shù)/1012/LRBCcount9.179±0.5069.098±0.7239.385±0.448紅細(xì)胞比容/L/LHematocrit(HCT)0.523±0.0240.530±0.0340.540±0.030紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)/fLRedbloodcelldistributionwidth-coefficientofvariation(RDW-CV)0.142±0.0120.140±0.0070.134±0.008平均紅細(xì)胞體積/fLErythrocytemeancorpuscularvolume(MCV)56.940±1.19258.250±1.92357.609±2.963血紅蛋白測(cè)定/g/LHGB162.200±10.097165.10±10.09165.000±6.116平均血紅蛋白容量/pgMeancorpuscularhemoglobin(MCH)17.690±0.57818.180±0.50517.600±0.752平均血紅蛋白濃度/g/LMeancorpuscularhemoglobinconcentration(MCHC)310.700±9.627312.500±9.958305.909±212.029血小板平均體積/fLMeanplateletvolume(MPV)10.437±0.95811.580±1.95612.227±1.824血小板計(jì)數(shù)/109/LPlateletcount491.500±57.914472.100±80.234446.600±53.402血小板壓積/fLPlateletcrit(PCT)0.544±0.1020.510±0.1620.576±0.144血小板分布寬度/%Plateletdistributionwidth(PDW)16.1±1.016.3±1.016.2±0.62

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與模型組比較，ΔP< 0.05，ΔΔP< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01; Compared with the model group,ΔP< 0.05,ΔΔP< 0.01.

Tab.2Comparision of body weight and organ coefficients of tree shrews in the three groups

指標(biāo)Indicators對(duì)照組Controlgroup模型組Modelgroup治療組Treatmentgroup體重/gBodyweight114.440±9.798132.181±7.051**115.620±7.770ΔΔ脾/%Spleen0.1625±0.04050.0748±0.0171**0.1140±0.0190*心/%Heart0.6663±0.09910.6238±0.06710.6074±0.0583肺/%Lung0.8497±0.05740.9146±0.12470.9346±0.2011肝/%Liver4.9333±0.81634.4827±0.60734.4314±0.7939左腎/%Leftkidney0.4909±0.05150.5158±0.08560.4658±0.0778右腎/%Rightkidney0.4917±0.05210.5225±0.09910.4628±0.0784

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與模型組比較，ΔP< 0.05，ΔΔP< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01; Compared with the model group,ΔP< 0.05,ΔΔP< 0.01.

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨骼系統(tǒng)疾病。隨著人口老齡化問題的日趨嚴(yán)重，已使得骨質(zhì)疏松性骨折(OPF)成為常見多發(fā)病。OPF致殘率高，對(duì)老年人健康造成了極大威脅。目前用于OPF研究的動(dòng)物有大鼠、小鼠、犬、兔、豬、羊、狒狒、猴等，其中大鼠的應(yīng)用最多，但這些動(dòng)物模型各有缺陷[5]。樹鼩與靈長類動(dòng)物親緣關(guān)系最為接近[6]，并且繁殖能力強(qiáng)，飼養(yǎng)難度低，體型與大鼠類似，可方便地完成雌性樹鼩去卵巢及造成骨折，操作可控，重復(fù)性好，這些都為樹鼩成為OPF研究的新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型創(chuàng)造了條件。因此，本實(shí)驗(yàn)室在參考王運(yùn)林等[7]方法的基礎(chǔ)上，成功建立OPF樹鼩模型并開展恒古骨傷愈合劑治療研究。

血細(xì)胞具有固有免疫活性，可在體外用免疫原激活系統(tǒng)血液固有免疫反應(yīng)。白細(xì)胞免疫系統(tǒng)是血液固有免疫系統(tǒng)的主要成分[8]。脾臟是哺乳動(dòng)物最大的外周免疫器官，是免疫應(yīng)答的重要部位。脾臟中含有豐富的T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞(dendritic cells，DC)及巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells，NK)等細(xì)胞亞群，它們的組成比例和數(shù)量的維持對(duì)于機(jī)體免疫應(yīng)答功能的發(fā)揮至關(guān)重要，且與多種臨床疾病的發(fā)生密切相關(guān)[9]。中醫(yī)理論認(rèn)為原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥病機(jī)以腎脾虛為本，于中氣不升，土氣不納，亦即陰陽兩虛導(dǎo)致[10]。恒古骨傷愈合劑功能主治為活血益氣、補(bǔ)肝腎、接骨續(xù)筋、消腫止痛，符合中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松癥和OPF的原則。但該藥治療OPF的機(jī)制還有待研究[11]。

有研究報(bào)道雌激素下降，血液循環(huán)中淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的白介素-1(IL-1)和骨髓基質(zhì)產(chǎn)生的白介素-6(IL-6)增多，白介素-2(IL-2)等免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)的產(chǎn)生減少，體內(nèi)脫氫表雄酮(DHEA)濃度顯著下降，引起免疫系統(tǒng)失調(diào)[12]。本研究顯示，雌性樹鼩經(jīng)去勢(shì)建立OPF模型后，外周血單核細(xì)胞、白細(xì)胞(P< 0.01)和淋巴細(xì)胞(P< 0.05)均明顯下降，同時(shí)模型樹鼩脾臟系數(shù)顯著低于對(duì)照組(P< 0.01)，提示OPF樹鼩機(jī)體免疫力下降，推測(cè)可能因樹鼩切除卵巢后，雌激素分泌減少，破壞神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)平衡所致。此外，雌激素可降低蛋白脂肪酶活性，抑制脂肪生成；雌激素可作用于下丘腦，減少攝食[13]；雌激素也能增加腎上腺素的解脂作用，通過以上途徑，雌激素具有降低脂肪堆積的作用[14]。本實(shí)驗(yàn)中模型組體重顯著高于對(duì)照組(P< 0.01)，推測(cè)是由于樹鼩雌激素水平下降導(dǎo)致脂肪代謝異常所致。

恒古骨傷愈合劑已用于OPF的臨床治療和兔OPF研究[4]。該藥含有人參、黃芪、三七、紅花、陳皮等成分。人參[15]、黃芪[16]等是良好的補(bǔ)氣益身藥物，兩者的藥理作用廣泛，能刺激淋巴細(xì)胞增殖使淋巴細(xì)胞增加，激活環(huán)磷酰胺增強(qiáng)非特異性免疫功能，促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌等。王庭欣等[17]將黃芪多糖溶液通過灌胃方式飼喂小鼠，結(jié)果顯示，黃芪多糖能促進(jìn)小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫和巨噬細(xì)胞功能。有文獻(xiàn)報(bào)道在鵪鶉的飼料中添加人參莖葉，改善了鵪鶉部分血液生理指標(biāo)，加快免疫器官的生長，從而提高免疫力[18]。三七中的三七多糖與杜仲可增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力，并提高自然殺傷細(xì)胞的活性，從而加快免疫細(xì)胞形成[19]。有研究者采用皮下注射環(huán)磷酰胺的方式，導(dǎo)致小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、淋巴細(xì)胞百分率下降，經(jīng)皮下注射三七皂苷Rg1治療后，以上各項(xiàng)指標(biāo)均有所恢復(fù)，認(rèn)為三七皂苷Rg1有促進(jìn)免疫力恢復(fù)的作用[20]。紅花中的紅花苷[21]和陳皮[22]也可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，提高淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。此外，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)恒古骨傷愈合劑對(duì)骨折樹鼩心臟和肝臟功能具有保護(hù)作用[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，恒古骨傷愈合劑能顯著提高OPF樹鼩單核細(xì)胞百分比和絕對(duì)值(P< 0.01)，提高淋巴細(xì)胞絕對(duì)值和百分率、白細(xì)胞數(shù)和脾系數(shù)(P< 0.05)，提示恒古骨傷愈合劑能較有效地改善OPF樹鼩免疫功能。同時(shí)，治療組體重比模型組顯著降低(P< 0.01)，表明恒古骨傷愈合劑改善了雌激素減少所致的肥胖。

免疫細(xì)胞和骨細(xì)胞源于相同的祖細(xì)胞，其分化由相同的支持細(xì)胞驅(qū)動(dòng)。機(jī)體骨重建和免疫系統(tǒng)存在著相互調(diào)節(jié)的作用，免疫系統(tǒng)的異常激活可以改變成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞之間的耦聯(lián)平衡，從而影響骨重建的失衡而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[24]。從本實(shí)驗(yàn)所獲得的數(shù)據(jù)，推測(cè)恒古骨傷愈合劑通過改善OPF樹鼩免疫功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨重建的平衡。這為恒古骨傷愈合劑治療OPF的機(jī)理研究提供了新的思路。

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EffectofOsteokingonbloodphysiologicalparametersandorganindexesinfemaletreeshrewswithosteoporoticfracture

WU Chao1， TANG Wei2， ZHAO Hong-bin3， LI Jin-tao1， JIAO Jian-lin4， YUAN Xin2， ZHENG Hong1 *

(1.Department of Laboratory Animal Science, Kunming Medical University, Kunming 650500, China； 2.Department of Science and Education, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032； 3.Department of Emergency Medicine, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032； 4.Technology Transfer Center, Kunming Medical University, Kunming 650031)

ObjectiveTo evaluate the effect of Osteoking on blood physiological parameters and organ indexes in the ovariectomized tree shrew model of osteoporotic fracture (OPF).MethodsA total of 30 4-month-old female tree shrews (Tupaiabelangeri) were randomly divided into control group, model group and treatment group, with 10 in each group. Bilateral ovaries of the tree shrews in the treatment group and model group were removed and osteoporosis was confirmed 6 months later. Then tibial fractures were generated. From the next day of fracture, tree shrews in the treatment group were gavaged with Osteoking once every two days, and tree shrews in the model group and control group were gavaged with equal volume of sterile saline. After gavaging for 3 months, 16 blood physiological parameters and 6 organ indexes of the tree shrews in each group were measured.ResultsAmong all of the 16 blood physiological parameters, the number of white blood cells, the absolute value and percentage of lymphocytes (P< 0.01) and monocytes (P< 0.05) in the model group were significantly lower than those in the control group after 3 months. Compared with the model group, the absolute value and percentage of monocytes (P< 0.01) and lymphocytes, the number of white blood cells (P< 0.05) and the spleen coefficient were significantly increased (P< 0.05) in the treatment group.ConclusionsOsteoking can improve the immunity of tree shrews with osteoporotic fracture.

Bilateral ovariectomy; Osteoporotic fracture; Tree shrews; Immunity; Osteoking

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81460647)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目 [編號(hào)：2014FB033，2017FE468(-014；016)]。

吳超(1993 -)，男，碩士生，研究方向：藥學(xué)與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: 120480903@qq.com

鄭紅(1969 -)，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向：比較醫(yī)學(xué)。E-mail: 847255170@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 11-0001-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.001

2017-04-17