劉中文 徐 欣 張英華 楊新峰 郭 劍 朱緒偉

(河南省蠶業(yè)科學研究院， 河南鄭州 450008)

柞蠶微孢子蟲的研究進展

劉中文 徐 欣 張英華 楊新峰 郭 劍 朱緒偉

(河南省蠶業(yè)科學研究院， 河南鄭州 450008)

隨著柞蠶微孢子蟲(NosemapernyiWen et Ding)cDNA文庫及EST(expressed sequence tags，表達序列標簽)測序的完成，基因克隆測序、功能蛋白分析、抗體免疫等研究手段也逐漸應用于柞蠶微孢子蟲的研究，并在病原的分離檢測、感染發(fā)病規(guī)律、傳播途徑、綜合防治等方面取得較大進展。介紹了柞蠶微孢子蟲的分離純化與檢測、感染傳播規(guī)律及其分子機制的研究進展和柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶免疫應答的研究進展，展望了柞蠶微孢子蟲的研究方向和內(nèi)容。

柞蠶； 微孢子蟲； 微粒子??； 分離檢測； 垂直傳播

柞蠶生產(chǎn)上的重要病害——柞蠶微粒子病，是由柞蠶種生產(chǎn)中的唯一檢疫對象柞蠶微孢子蟲(NosemapernyiWen et Ding)誘發(fā)的，易造成絲繭生產(chǎn)減產(chǎn)，并經(jīng)柞蠶卵垂直傳播影響種繭生產(chǎn)，威脅種質(zhì)資源的保育及生產(chǎn)的安全[1]。一直以來，關于柞蠶微孢子蟲的分離檢測、感染發(fā)病規(guī)律、傳播途徑、綜合防治等方面的研究不斷有新的進展，直到2011年重慶師范大學XU等[2]初步鑒定了其核型，并對全基因組進行組裝，但由于組裝結果差異較大，全基因組草圖還需進一步研究確定；2014年，沈陽農(nóng)業(yè)大學完成了柞蠶微孢子蟲cDNA文庫的構建及EST(expressed sequence tags，表達序列標簽)測序[3]，使得柞蠶微孢子蟲的研究在分子生物學方面有了巨大進展，同時關于柞蠶微孢子蟲感染后柞蠶在轉錄組學和蛋白質(zhì)組學的研究成為熱點，為探究柞蠶對柞蠶微孢子蟲的免疫應答模式、柞蠶微粒子病的發(fā)病機理和開發(fā)新的防治藥劑提供了直接依據(jù)[4]。本文介紹了柞蠶微孢子蟲的分離純化與檢測、感染傳播規(guī)律及其感染發(fā)病分子機制的研究進展和柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶免疫應答的研究進展，以期在阻斷柞蠶微粒子病的傳播以及提高柞蠶的免疫能力等方面提供理論依據(jù)，為今后應用于柞蠶生產(chǎn)、降低微粒子病的發(fā)病率與傳播力提供幫助。

1 柞蠶微孢子蟲的分離純化與檢測技術

1.1 柞蠶微孢子蟲的分離純化

微孢子蟲孢子的分離純化方法有差速離心法、蔗糖(氯化銫) 密度梯度離心法和Percoll 密度梯度離心法等多種，其中應用最多的是Percoll密度梯度離心法。姜義仁等[5]采用傳統(tǒng)離心的方式分離得到柞蠶微孢子蟲孢子，再根據(jù)Percoll溶液自行分層的特性，設計3個單一濃度和2個不連續(xù)密度梯度的Percoll NaCl溶液進行純化試驗，最終得到了折光性和均一性一致，無組織碎片的柞蠶微孢子蟲孢子，最佳離心方法為25%、50%、75%、100%不連續(xù)梯度，15 000 r/min下離心30 min，NaCl溶液濃度為0.15 mol/L。

1.2 柞蠶微孢子蟲的檢測技術

目前，快速免疫檢測技術、酶學及分子生物學研究方法已廣泛應用于病原微生物的檢測鑒定，如抗體檢測技術、酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(ELISA法)等技術。

1.2.1 抗體檢測技術 王伯陽等[6]通過制備柞蠶微孢子蟲多克隆抗體，建立了柞蠶微孢子蟲膠體金免疫層析快速檢測法，但由于抗體效價、柞蠶血淋巴本身具有顏色等原因?qū)е聶z測靈敏度較低，后期希望配合親和性更高的單克隆抗體優(yōu)化完善檢測方法。

1.2.2 ELISA法 ELISA法測定因具有較多優(yōu)點而在生物科學各領域廣泛應用，姜義仁等[7]也用間接競爭ELISA法檢測柞蠶微孢子蟲，特異性及靈敏度較好，為開發(fā)柞蠶微孢子蟲單克隆抗體、解決檢測假陽性、提高檢測靈敏度及特異性等方面奠定了基礎。但ELISA法仍存在抗體捕獲孢子的能力較弱、靈敏度的穩(wěn)定性較差等不足之處，實用化檢測技術有待進一步研究[8]。

2 柞蠶微孢子蟲的感染傳播規(guī)律及其分子機制研究進展

2.1 具有致病性柞蠶微孢子蟲種類

目前發(fā)現(xiàn)對柞蠶具有感染致病性的微孢子蟲有5種[9]，包括柞蠶微孢子蟲、修氏內(nèi)網(wǎng)蟲(Endoreticlatusschubergi)、鏈孢變形孢蟲(VairimorphachainsporumWen et Ding)、訥卡變形孢蟲(Vairimorphanecatrix)和柞蠶微孢子蟲新種(Nosemasp.)，其中，柞蠶微孢子蟲是優(yōu)勢種。

根據(jù)宿桂梅等[10]的文獻，可以從主要侵染部位及順序、主要寄主范圍、孢子大小與形狀、極絲繞核圈數(shù)、孢子母細胞的產(chǎn)孢形式等方面對5種微孢子蟲進行分類鑒定，為研究各種微孢子蟲的致病性做準備。在此基礎上，徐亮等[11]比較5個柞蠶品種的抵抗能力發(fā)現(xiàn)，柞蠶品種582的幼蟲生長發(fā)育受微孢子蟲侵染的影響最小，柞蠶品種青6號和寬青的幼蟲生長發(fā)育受微孢子蟲侵染的影響最大，為選育對微孢子蟲侵染具有較強抵抗力的柞蠶品種提供了更充分和更準確的依據(jù)。

2.2 柞蠶微孢子蟲的感染傳播規(guī)律

柞蠶微孢子蟲的生命周期一般分為感染期、裂殖增殖期和孢子增殖期3個階段[12]。孢子階段是微孢子蟲生活史中成熟且具有侵染力的階段，也是研究微孢子蟲侵染機制、生活史及檢測診斷的關鍵階段。與微孢子蟲侵染有關的重要結構有3個：極膜體、極絲及后極泡，其中與侵染聯(lián)系最緊密的細胞器是極絲[12]。目前至少有5種極絲蛋白被鑒定，這些蛋白在微孢子蟲種間具有一定的保守性，在與宿主細胞粘附及侵染的最后階段可能發(fā)揮作用[13]；極絲蛋白還具有用于開發(fā)血清學檢查抗原的潛力[14]?？梢愿鶕?jù)微孢子蟲極絲蛋白的研究克隆得到柞蠶微孢子蟲的相關極絲蛋白，為進一步研究其侵染機制提供理論依據(jù)。

關于微孢子蟲感染細胞途徑的研究一直在進行，目前認為主要有2種方式：一是孢子發(fā)射極絲注射孢原質(zhì)到宿主細胞以達到感染的目的，有的同時形成寄生空泡再次感染[15]；二是通過微孢子蟲孢壁的主要成分孢壁蛋白與宿主細胞的相互作用，來實現(xiàn)微孢子蟲對宿主的侵染，這也是病原體免疫檢測的重要靶標蛋白[16]，關于柞蠶微孢子蟲孢壁蛋白的研究也逐漸成為熱點。

柞蠶微孢子蟲的傳播途徑有水平傳播和垂直傳播2種[1]。水平傳播即經(jīng)口感染，柞蠶微孢子蟲進入到柞蠶體內(nèi)后，微孢子蟲不斷增殖，吸收了蠶體的大量營養(yǎng)，導致柞蠶生理機能發(fā)生障礙；垂直傳播即胚種傳染，是柞蠶微孢子蟲的主要傳染途徑，也是造成檢測及防治難度較大的原因[17]。關于柞蠶微孢子蟲致病性與傳播規(guī)律相互關系的研究還比較少，但已有一些研究發(fā)現(xiàn)，病原的毒力和垂直傳播特點具有一定的關系，病原的毒力越強，胚種垂直傳染力越弱，反之亦然[18]。同時，在家蠶中發(fā)現(xiàn)，對家蠶具有病原性的不同微孢子蟲所表現(xiàn)出的垂直傳播特點不一致；另外，研究人員還從山東蠶區(qū)分離出一種納卡變形微孢子蟲，雖對家蠶具有較強的致病性[19]，但不具有垂直傳播的能力[20]。

2.3 侵染相關分子生物學方面的研究進展

龔娟娟等[21]利用Percoll-NaCl梯度純化和LC-MS/MS(液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜)鑒定技術，得到了柞蠶微孢子蟲的610個蛋白，再進行GO蛋白質(zhì)功能分析，發(fā)現(xiàn)多種與侵染、增殖相關的功能蛋白，為研究其侵染機制提供了分子依據(jù)。

孢壁蛋白在信號識別、細胞粘附和離子轉運等方面起著重要作用，SOUTHERN等[22]通過研究功能基因EnP1，證實了孢壁蛋白是病原菌侵染過程中的重要蛋白，還發(fā)現(xiàn)兔腦炎微孢子蟲孢壁蛋白EnP1和家蠶微孢子蟲表面蛋白NbSWP26有相似的功能[22-23]。同時，還有研究發(fā)現(xiàn)微孢子蟲孢壁的某些蛋白質(zhì)被破壞，如利用抗體或其他化學物質(zhì)處理微孢子蟲孢子，其孢子的感染能力顯著下降[24]。

由于微孢子蟲特有的幾丁質(zhì)孢壁結構，常規(guī)的蛋白質(zhì)提取方法難以獲得僅含微孢子蟲表面蛋白的檢測樣品，而水溶性維生素生物素和糖蛋白親和素相結合的層析分離技術可特異性標記和富集細胞表面蛋白，具備靈敏、穩(wěn)定、專一、適用廣泛等特點[25-27]。趙唯希等[28]運用生物素-親和素層析分離技術得到柞蠶微孢子蟲表面蛋白，并與家蠶微孢子蟲表面蛋白進行比對，已鑒定出3個柞蠶微孢子蟲孢子表面蛋白NpSWP30、NpSWP26、NpSWP12，并通過間接免疫熒光亞細胞定位分析確證為孢子外表面的蛋白質(zhì)，為進一步研究柞蠶微孢子蟲孢壁蛋白細胞定位以及功能奠定了基礎，也為檢測和侵染機制的研究提供了新的靶標蛋白。

3 柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶免疫應答的研究進展

柞蠶微孢子蟲的侵染對柞蠶體內(nèi)各種生理生化指標均造成不同程度的影響，主要表現(xiàn)在中腸和血淋巴的一系列反應中。宿桂梅等[10]探究了不同溫度條件對柞蠶微孢子蟲侵染組織順序及發(fā)病時間的影響不同，驗證了其是通過血液循環(huán)侵染其他組織，并發(fā)現(xiàn)侵染的過程都是從柞蠶中腸開始的。

3.1 柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶中腸相關免疫反應

基于柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶中腸的重要作用，姜義仁等[12]構建了柞蠶中腸蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，分析篩選得到差異基因和差異蛋白所在的位置和參與的代謝，并發(fā)現(xiàn)與柞蠶微孢子蟲發(fā)病相關的2種蛋白——絲氨酸蛋白酶和芳基貯存蛋白，為進一步闡明柞蠶微粒子病的發(fā)病機制奠定了基礎。之后，王勇等[32]運用qRT-PCR(定量即時聚合酶鏈鎖反應)技術對柞蠶中腸內(nèi)ApHSC70基因進行研究，發(fā)現(xiàn)其表達量在微孢子蟲感染后最高可上調(diào)近5倍，推測該基因可能參與了柞蠶的免疫防御過程。

3.2 柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶血淋巴相關免疫反應

相關研究認為血細胞總數(shù)的增加及蛋白含量的減少可以作為衡量柞蠶微粒子病的標志[33]，說明柞蠶血淋巴在柞蠶免疫系統(tǒng)中起重要作用，能夠抵抗柞蠶微孢子蟲的入侵。臧敏等[34]通過添食柞蠶微孢子蟲發(fā)現(xiàn)，血淋巴蛋白質(zhì)含量和組成發(fā)生顯著變化，影響柞蠶體內(nèi)營養(yǎng)代謝并且雌雄個體存在抗性差異，說明柞蠶微孢子蟲寄生是一個相對緩慢的侵染過程。還有研究證明，熱休克蛋白HSC70在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應以及抗病原菌感染過程中起重要作用，參與多種生物的免疫應答反應[35]，這可以作為研究柞蠶微孢子蟲侵染后柞蠶免疫反應的一個依據(jù)和方法。

4 研究展望

柞蠶微孢子蟲是生產(chǎn)上最具威脅的病原之一，與產(chǎn)業(yè)發(fā)展緊密關聯(lián)，關于其基礎理論的研究成果應該與蠶業(yè)生產(chǎn)實踐結合，以推動產(chǎn)業(yè)升級與發(fā)展。柞蠶微孢子蟲檢測技術的研究提高了實際生產(chǎn)中微粒子病的檢出率，并能實現(xiàn)柞蠶微粒子病早發(fā)現(xiàn)、早處理，降低得病率與損失。但對于寄生柞蠶的5種微孢子蟲的研究只集中在柞蠶微孢子蟲的研究，而關于其他4種微孢子蟲致病力與胚種傳染率的異同還有待進一步研究，如可以利用新技術分離純化各種微孢子蟲，為微粒子病的綜合治理提供幫助；同時在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平進一步研究柞蠶免疫相關基因，為提高柞蠶抗病性提供分子學依據(jù)。

柞蠶微孢子蟲的水平傳播需要在柞蠶場生產(chǎn)過程中加強防病意識，做好消毒工作，降低相互傳染的幾率；垂直傳播是造成柞蠶微粒子病病原污染的重要原因，而且對柞蠶種的種質(zhì)檢測工作造成諸多麻煩，因此亟需對其進行相關機制研究，以期可以找到阻斷柞蠶微孢子蟲垂直傳播的方法和藥劑，達到阻斷柞蠶微孢子蟲垂直傳播的目的。利用現(xiàn)代分子生物學技術，進行柞蠶抗性育種素材的創(chuàng)建，具有廣闊的研究前景，今后可以利用已發(fā)現(xiàn)的與侵染相關的極絲蛋白、孢壁蛋白的結構與功能差異，測定免疫相關基因的表達量變化，以揭示寄生柞蠶不同微孢子蟲垂直傳播的機理。還可以尋找阻斷垂直傳播的分子靶標，構建相關的單克隆抗體，再運用RNA干擾或轉基因技術研究柞蠶抗微粒子病新品種。

綜合柞蠶微孢子蟲近幾年的研究發(fā)展情況，盡管其核型已獲得鑒定，然而具體的遺傳規(guī)律還不清楚，詳細的基因圖譜結果還沒有獲得，相關基因在微孢子蟲侵染過程中和宿主的免疫過程中的功能還需深入研究。未來開展對柞蠶微孢子蟲侵染和垂直傳播機制的研究，并建立便捷、靈敏的檢測方法和創(chuàng)建柞蠶高抗病育種素材將是重要的研究方向。

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2017-07-13;接受日期2017-09-27

信息： 劉中文(1987—)，男，山東沂水，本科，助理農(nóng)藝師。Tel： 0377-66661675， E-mail: 1020350426@qq.com

信息： 朱緒偉(1968—)，男，河南信陽，碩士研究生，高級農(nóng)藝師。

Tel： 0377-66666115， E-mail: hnsckyzxw@126.com

S885.1

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1007-0982(2017)04-0043-05