倪利曉，陳春明，馬艷艷

(1.河海大學環(huán)境學院，江蘇 南京 210098；2.江蘇科易達環(huán)?？萍加邢薰?，江蘇 鹽城 224000)

鎘脅迫對銅綠微囊藻的抑制作用及營養(yǎng)鹽濃度對其的減緩效應

倪利曉1，陳春明1，馬艷艷2

(1.河海大學環(huán)境學院，江蘇 南京 210098；2.江蘇科易達環(huán)?？萍加邢薰荆K 鹽城 224000)

為研究鎘脅迫對銅綠微囊藻的生長和生理特征影響，評估氮、磷在減緩鎘脅迫中作用，將處于指數生長期的銅綠微囊藻接種于不同的鎘脅迫濃度和3種營養(yǎng)鹽水平下96 h。結果表明，當鎘濃度小于10 μmol/L，隨著氮、磷濃度增大，藻的生物量、比生長速率、葉綠素a、可溶性蛋白、可溶性糖的濃度和超氧化物歧化酶活性隨之增加，然而在鎘濃度為10 μmol/L時銅綠微囊藻的這些指標含量基本相同，但類胡蘿卜素只有在鎘濃度為10 μmol/L時才會出現明顯的降低。

氮；磷；鎘；生理特征；銅綠微囊藻；鎘脅迫

隨著人類生產生活、工業(yè)等的快速發(fā)展，生活污水、工業(yè)廢水和農業(yè)廢水造成的水體富營養(yǎng)化日益嚴重，成為我國大多水體普遍面臨的環(huán)境問題[1]，其中，N和P是最主要的營養(yǎng)鹽，往往導致藻類瘋長，形成水華、赤潮等。太湖是我國富營養(yǎng)化最嚴重的湖泊之一,藍藻水華頻繁發(fā)生。銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)是藍藻水華的主要藻種。影響銅綠微囊藻生長的因素有很多，例如溫度、光照、營養(yǎng)鹽、有機物等環(huán)境因素[2]。

重金屬具有毒性大、難降解、易累積等性質，對水生生態(tài)系統(tǒng)的健康構成嚴重威脅，沉積物重金屬污染已經引起廣泛關注，鎘(Cd)是環(huán)境中對植物、動物以及人類毒性最強的過度金屬元素之一[3]。營養(yǎng)鹽與重金屬共存時，會對水華藍藻的生長及生理產生影響。關于N、P與重金屬對銅綠微囊藻生物量影響的研究較多[4]，但對其生理作用機制研究較少。本文以水華藍藻銅綠微囊藻為實驗藻種，研究N、P營養(yǎng)鹽濃度改變情況下，Cd對銅綠微囊藻的生長及生化指標的影響，以期為進一步研究銅綠微囊藻吸附Cd的生理生化機制奠定理論基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 藻的培養(yǎng)

銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa, FACHB3-905)購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫。實驗前，使用BG-11培養(yǎng)基[5]預培養(yǎng)7～10 d，使之處于對數生長期。培養(yǎng)條件：光照強度為40～60 μmol/(m2·s)，光暗比為14/10，溫度為25℃，靜置培養(yǎng)，每天搖動若干次。實驗前部分藻種饑餓培養(yǎng)3 d，后將藻種以5 000 r/min離心后用質量濃度為15 mg/L的NaHCO3溶液洗滌2次，去掉上清液后接種至含不同濃度N、P的培養(yǎng)基中馴化擴大培養(yǎng)14 d。

1.2 實驗設計

以BG-11培養(yǎng)基為基礎，其他營養(yǎng)元素濃度不變，只改變N、P濃度，并設置高、中、低3個營養(yǎng)鹽水平，用NaNO3和K2HPO4·3H2O調控N、P質量濃度，依次分別為123.5 mg/L、3.56 mg/L；12.35 mg/L、0.356 mg/L；1.235 mg/L、0.035 6 mg/L。實驗用250 mL 的錐形瓶，均放入150 mL不同營養(yǎng)鹽濃度的培養(yǎng)液，將準備好的處于對數生長期的銅綠微囊藻接種于不同N、P濃度培養(yǎng)基中，并控制初始藻相對質量密度為0.2，并用CdCl2·2.5H2O設置Cd濃度分別為：0、1、2、4、10 μmol/L，每組設3個平行，每天定時人工搖動3次，每隔24 h于680 nm波長處測吸光度(O680)，并在96 h時測各生理指標。

1.3 生理指標測定

1.3.1 比生長速率的測定

為了評估銅綠微囊藻的生長，按照式(1)計算每個實驗組的比生長速率[6]：

μ=ln(Xn/Xn-1)/(tn-tn-1)

(1)

式中：μ為比生長速率，1/d；Xn為tn時刻藻細胞密度，個/mL。

1.3.2 光合色素的測定

葉綠素(Chl-a)是藻類進行光合作用的色素，植物、藻類等生物在遭受環(huán)境脅迫時,反映其光合強度的Chl-a、胡蘿卜素等色素會發(fā)生變化。Chl-a的測定參照Eullaffroy等[7]的方法并加以改進，即取50 mL藻液，4 000 r/min離心10 min，棄上清液，使用蒸餾水洗滌2次后，用95%乙醇定容至5 mL，避光，置于4℃下提取24 h。取上清液放入1 cm 比色杯，以95%乙醇為空白，用分光光度計測定波長470 nm、665 nm和750 nm時的吸光度。根據ρ(Chl-a)和類胡蘿卜素在95%乙醇吸光系數而建立的公式來計算Chl-a和類胡蘿卜素的質量濃度ρ(X·C)[8]：

ρ(Chl-a)=11.93(O665-O750)

(2)

ρ(X·C)=[1 000O470-ρ(Chl-a)]/245

(3)

式中：O665、O750、O470分別為波長為665、750、470 nm時的吸光度。

1.3.3 可溶性蛋白和可溶性糖的測定

可溶性蛋白含量的測定參照Bradford[9]的方法。取一定量(30～50 mL)的藻液，4 000 r/min離心10 min，棄上清液，使用蒸餾水洗滌2次后，超聲波破碎10 min，11 000 r/min下離心15 min，上清液即為提取液，用于測可溶性蛋白和可溶性糖。用牛血清蛋白質溶液做標準曲線，準確取1 mL蛋白提取液于試管中，再加入5 mL考馬斯亮藍G-250試劑，充分混合后放置2 min，以加入蒸餾水的考馬斯亮藍G-250的溶液為對照，在595 nm波長下比色，在標準下計算蛋白質濃度。

可溶性糖采用苯酚法測定[10]。用蔗糖溶液做標準曲線，吸取2 mL可溶糖提取液于試管中，按順序分別加入5%苯酚溶液0.5 mL，濃H2SO45 mL，然后搖勻，并室溫放置30 min，顯色，在485 nm波長處測定吸光度，可溶性糖含量由標準曲線查出。

1.3.4 超氧化物歧化酶的測定

超氧化物歧化酶活性(super oxide dismutase，SOD)測定參照Beauchamp的方法[11]。取一定量(30～50 mL)的藻液，4 000 r/min離心10 min，棄上清液，使用pH=7.8的50 mmol磷酸緩沖溶液洗滌2次后，超聲波破碎10 min，在4℃、11 000 r/min下離心15 min，上清液即為酶提取液。取1 mL粗酶液，依次加入0.8 mL磷酸緩沖溶液(50 mmol/L,pH=7.8)，0.3 mL甲硫氨酸溶液(130 mmol/L)，0.3 mL Na2EDTA溶液(100 μmol/L)，0.3 mL核黃素溶液(20 μmol/L)，0.3 mL 氮藍四唑溶液NBT(750 μmol/L)和1 mL酶提取液，總計3 mL，置于40～60 μmol/(m2·s)光照強度、25℃溫度下反應30 min。反應結束后移至黑暗環(huán)境終止反應。用未加核黃素的酶反應體系液作空白，未加酶液的反應體系做對照，在560 nm波長下分別測定各管的吸光度。根據在光照條件下SOD抑制NBT的還原作用來確定酶活性的大小，將NBT的還原抑制到對照組還原進程的50%時所需的酶量為1個酶活性，根據式(4)計算SOD的酶活性Asod。

(4)

式中：s為樣品照光后的吸光度；a為未加酶反應液照光后吸光度；b為未加酶反應液照光前吸光度；n為酶液稀釋倍數。

1.3.5 數據處理

用origin 9.2軟件繪圖，實驗數據采用SPSS13.0軟件處理。對照組和實驗組之間采用單因素方差分析，Plt;0.05表示有顯著性差異；Plt;0.01表示有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 Cd對銅綠微囊藻生長的影響

相關研究表明O680和藻細胞數量有很好的相關性[12]，不同營養(yǎng)鹽水平下Cd對銅綠微囊藻生長和比生長速率的影響見圖1。由圖1(a)～(c)可以看出，Cd對藻的生長抑制作用隨著Cd濃度的增加逐漸增強。在低營養(yǎng)鹽水平下，1、2 μmol/L Cd實驗組藻數量與對照組相比變化不大，4、10 μmol/L Cd實驗組藻細胞數量明顯降低(plt;0.05)。在中、高營養(yǎng)鹽水平下，1 μmol/L Cd與藻作用96 h后，藻細胞數量略高于對照組，說明1 μmol/L Cd對藻的生長起著低促高抑的效果，即Hormesis效應[13]；2 μmol/L Cd對藻有明顯的抑制作用，低、中、高營養(yǎng)鹽水平下藻細胞數量分別是對照組藻細胞數量的91.04%、66.92%、77.35%；4、10 μmol/L Cd實驗組藻細胞數目均低于同時期對照組(plt;0.01)，4 μmol/L Cd與藻脅迫時，低、中、高營養(yǎng)鹽水平下藻細胞數量分別是對照組藻細胞數量的48.44%、46.87%、54.93%，說明4 μmol/L Cd對銅綠微囊藻的生長有較強的抑制作用；10 μmol/L Cd脅迫使藻處于明顯抑制狀態(tài)，且營養(yǎng)鹽濃度的提高也不能使抑制作用減弱，毒性減少，說明此時的Cd濃度已經超過了藻的最大耐鎘含量。圖1(d)表明藻的比生長速率隨著Cd濃度的增大逐漸降低，隨N、P濃度的增大逐漸升高。由圖1可說明Cd能抑制銅綠微囊藻的生長，且濃度越大抑制作用越強，而營養(yǎng)鹽含量的增大有助于減緩Cd對藻的抑制作用，當Cd濃度超過藻類最大耐鎘量時，Cd的毒性致使藻類大量死亡，N、P濃度的提高對此也毫無影響。

2.2 Cd對光合色素含量影響

Chl-a和類胡蘿卜素都是藻類進行光合作用的色素，其含量的變化在一定程度上可以反映脅迫作用對藻類光合作用的影響。由圖2(a)可以看出，在低營養(yǎng)鹽水平下，1 μmol/L Cd的加入使Chl-a的含量略高于對照組，且隨著Cd濃度的增大，Chl-a含

(a) 低營養(yǎng)鹽

(b) 中營養(yǎng)鹽

(c) 高營養(yǎng)鹽

(d) 比生長速率

量逐漸降低；而中、高營養(yǎng)鹽水平下Chl-a含量隨著Cd濃度的增大變化趨勢一致，均呈負增長趨勢，且Cd濃度越大負增長趨勢越大。當10 μmol/L Cd與藻脅迫時，低、中、高3個營養(yǎng)鹽水平下Chl-a含量僅為對照組的63.5%、66.6%、66.6%，說明此時銅綠微囊藻Chl-a的含量不受營養(yǎng)鹽的影響。由圖2(b)可見，Chl-a和類胡蘿卜素含量變化趨勢和藻細胞數量類似，類胡蘿卜素只有在加入10 μmol/L Cd才有明顯的變化，說明Chl-a比類胡蘿卜素更加敏感地反映光合作用強度。Chl-a含量減少是由于Chl-a合成或者相關酶的合成受到抑制[14]。這表明，Cd可以減弱藻類光合作用，而N、P濃度的提高可以減弱Cd對光合作用的抑制作用，N是藻類進行光合作用的主要元素，充足的N、P濃度下，藻類能夠吸收足夠的營養(yǎng)物質進行光合作用，N、P濃度過低，藻細胞生理活性降低，則光合作用效率降低，從而光合色素含量下降。但當Cd累積到一定程度，即超過藻的最大耐鎘量時，N、P濃度不能影響Cd對藻的毒性，進而不能提高光合作用強度。張皓[15]的研究表明在N、P濃度過高或過低水平下，江蘺在Cd作用下Chl-a含量都不高，在適中的N、P濃度下，江蘺的Chl-a含量則明顯升高，與本實驗結果一致。

(a) Cd對Chl-a的影響

(b) Cd對類胡蘿卜素的影響

2.3 Cd對可溶性蛋白和可溶性糖的影響

不同營養(yǎng)鹽水平下Cd對銅綠微囊藻可溶性蛋白和可溶性糖的影響見圖3，其變化趨勢和藻的比生長速率(圖1(d))一致。由圖3(a)可見，當Cd濃度為0～2 μmol/L時，可溶性蛋白含量變化不明顯，即低濃度Cd對蛋白質影響較??；當Cd濃度為4 μmol/L時，可溶性蛋白含量明顯下降，低、中、高營養(yǎng)鹽下分別降到對照組的40.32%、41.33%、58.94%，可見在鎘脅迫不大時，營養(yǎng)鹽濃度的提高有助于減緩Cd對蛋白質合成的抑制作用；當Cd濃度增加到10 μmol/L時，可溶性蛋白含量降到最低，分別僅為對照組的10.40%、11.41%、10.65%，由此說明低濃度Cd對蛋白質影響不明顯，高濃度Cd則明顯抑制了蛋白質的合成。

(a) Cd對可溶性質蛋白的影響

(b) Cd對可溶性糖的影響

由圖3(b)可見，當Cd濃度為4 μmol/L時，可溶性糖含量明顯下降，低、中、高營養(yǎng)鹽下分別比對照組下降了46.23%、39.92%、31.96%；當Cd濃度增加到10 μmol/L時，可溶性糖含量降到最低，分別僅為對照組的26.82%、25.54%、32.93%，說明低濃度Cd對可溶性糖影響較小，高濃度Cd則明顯抑制了可溶性糖的合成，與對可溶性蛋白的影響相似。

可溶性糖在植物體內是最基本和最常見的營養(yǎng)物質，在一定程度上可反映細胞體內生理代謝狀況，并能反映光合作用和呼吸代謝的平衡狀況[16]。重金屬脅迫下藻細胞受到嚴重損傷，降低了藻細胞的正常生理代謝，從而使可溶性糖含量降低。Cd脅迫下綠色巴夫藻可溶性糖含量與對照組相比明顯降低，Cd為20 mg/L時僅為對照組的35%，是由于綠色巴夫藻體內的細胞器受到損傷，從而生理各指標含量降低[17]。

2.4 Cd對超氧化物歧化酶的影響

植物體內存在負責清掃活性氧的抗氧化系統(tǒng)，當機體受到脅迫后，體內會產生過量的自由基(主要為H2O2、·OH、O2-)，從而影響細胞的正常生理代謝并損害膜結構，此時浮游植物便會啟動自身的防御系統(tǒng)，體內的抗氧化酶(如SOD、POD、CAT等)和非酶類抗氧化劑(如AsA、GSH等)能夠清除體內過多的活性氧自由基來抵抗氧化損傷，維持生物體內正常生理代謝，保護藻細胞免受氧化傷害。其中超氧化物歧化酶(SOD)是植物體內重要的抗氧化酶之一，是需氧生物細胞內抗氧化防御系統(tǒng)中的第一道防線[18]。由圖4可見，在3種營養(yǎng)鹽水平下，SOD活性均隨Cd濃度增加呈先上升后下降趨勢，當Cd濃度為4 μmol/L時，SOD活性達到最大值，說明受Cd的脅迫，SOD酶活性被誘導，以提高對超氧陰離子自由基的清除能力，從而減少對細胞的氧化損傷。在相同Cd濃度下，隨著營養(yǎng)鹽濃度的升高，藻SOD活性相對降低。而當Cd濃度為10 μmol/L時，SOD活性則明顯下降，且3個營養(yǎng)鹽水平下基本相同，說明過高濃度Cd的脅迫超過了藻的耐受能力，已經超出了藻細胞通過提高SOD活性來抵制抗氧化能力的范圍，這與鄶安琪等[19]的研究結果相一致。

圖4 不同營養(yǎng)鹽水平下Cd對銅綠微囊藻SOD活性影響(plt;0.05)

3 結 論

a. 營養(yǎng)鹽濃度的增加有利于提高銅綠微囊藻的生理活性及抗Cd能力。低Cd濃度(lt;10 μmol/L)下隨著N、P營養(yǎng)鹽濃度的增加，銅綠微囊藻生物量、葉綠素a、類胡蘿卜素、可溶性糖、可溶性蛋白含量及SOD活性均隨之增加，在高Cd濃度(10 μmol/L)下，銅綠微囊藻各生理生化指標含量基本相同。

b. 低、中、高3種營養(yǎng)鹽水平下，隨著Cd濃度的增加，銅綠微囊藻生物量、葉綠素a、可溶性糖、可溶性蛋白含量逐漸下降，比生長速率降低，SOD活性則呈先上升后下降趨勢，類胡蘿卜素對Cd耐受性較強，僅在10 μmol/L Cd時明顯下降。

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InhibitoryeffectsofcadmiumstressonMicrocystisaeruginosaandthealleviationeffectsofnutrientconcentrations

NILixiao1，CHENChunming1，MAYanyan2

(1.CollegeofEnvironmental,HohaiUniversity,Nanjing210098,China； 2.JiangsuKeyidaEnvironmentalProtectionTechnologyCo.,Ltd,Yancheng224000,China)

The aim of this study was to investigate the effects of cadmium(Cd) stress on growth and physiological traits in cyanobacteriaMicrocystisaeruginosa(M.aeruginosa) and to evaluate the role of nitrogen (N) and phosphorus (P) in cadmium stress alleviation. Microcystis aeruginosa in exponential growth stage was inoculated with different Cd stress concentrations and 3 kinds of nutritive salt for 96h. When cadmium concentration was less than 10 μmol/L, with the increase of the concentration of nitrogen and phosphorus, cadmium stress caused an enhancement in biomass, specific growth rate, chlorop hyll-a (Chl-a), soluble protein, soluble sugar and super oxide dismutase (SOD) activity, and basically the same concentration occurred to the above indexes at 10 μmol/L Cd. The carotenoids had obvious decline just whenM.aeruginosawere exposed to 10 μmol/L Cd.

nitrogen；phosphorus；cadmium；physiological traits；microcystisaeruginosa; Cd stress

10.3880/j.issn.1004-6933.2017.06.15

國家自然科學基金(51109061，E090301)；水利部公益性行業(yè)科研專項(2010010105)；河海大學創(chuàng)新人才計劃項目

倪利曉(1973-)，女，副教授，博士，主要從事水環(huán)境污染控制與生態(tài)修復研究。E-mail：nilixiao@hhu.edu.cn

X172

A

1004-6933(2017)06-0096-06

2016-12-28 編輯：徐 娟)