沈 益，胡 南

(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800)

多種修復技術(shù)對城市內(nèi)河水質(zhì)及微生物群落的影響

沈 益，胡 南

(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800)

河流治理；微生物群落；高通量測序；水質(zhì)修復；城市內(nèi)河

城市發(fā)展過程中，工業(yè)廢水、生活污水、農(nóng)業(yè)用水的直接排放，使得城市河流水體N、P等水質(zhì)因子嚴重超標，水體富營養(yǎng)化嚴重。城市河流水體污染的加劇、生態(tài)環(huán)境的退化以及水體自凈能力的減弱[1]，嚴重影響了城市河流的各項生態(tài)功能。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，河流水體微生物群落結(jié)構(gòu)的變化越來越受到關(guān)注[9]。普遍認為，河流生態(tài)系統(tǒng)中，微生物的吸收、代謝對水體本身的自凈和修復發(fā)揮著極其重要的作用。若河流本身的微生物群落結(jié)構(gòu)遭到破壞，即使短時間治污成效明顯，也極易再次污染，因此水體微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性與豐度逐漸被當作鑒定河流水質(zhì)的一項重要指標[10-11]。劉正輝[12]通過高通量測序、熒光定量PCR等技術(shù)測定了東江水體的微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)東江上下游的微生物群落主要為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteridetes)，且受水體氮質(zhì)量濃度的梯度變化影響，這些微生物群落具有顯著的季節(jié)和空間變化特性。譚旭[13]通過高通量測序技術(shù)分析了赤水河水體的微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)赤水河中優(yōu)勢菌群為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteridetes)和放線菌門(Actinobacteria)，且赤水河夏季的微生物豐度及多樣性均高于冬季。

雖然關(guān)于水體修復的研究報道有很多，但多數(shù)集中于江河、湖泊的水體修復，而關(guān)于城市內(nèi)流河的水體修復研究較少，缺少對比和優(yōu)化，鑒定指標也以水質(zhì)參數(shù)為主，需要豐富和完善。筆者采用不同的修復技術(shù)對同一河流水域的水樣進行修復，以水質(zhì)參數(shù)、微生物多樣性、菌群豐度為鑒定指標，全面分析不同的修復技術(shù)對城市河流的修復效果，旨在為城市河流的水體修復提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與處理

圖1 有機玻璃儲水器示意圖

1.2 實驗設(shè)計與準備

實驗所用的菌劑為光合細菌和反硝化芽孢桿菌。光合細菌在市場購得，反硝化芽孢桿菌為實驗室從環(huán)境中篩選出的除氮、脫COD較強的兩株芽孢桿菌GY-45和GY-46。實驗所用碳源為乙酸(分析純AR)，每次的投加量為3 g，COD理論增加值為12.12 mg/L。所用增氧設(shè)備為ACO-001電磁式空氣泵(浙江森森實業(yè)有限公司)，用玻璃轉(zhuǎn)子流量計(LZB-3WB)控制增氧流量為0.63 dm3/min。實驗周期為8 d，增氧方式采用連續(xù)增氧，至實驗結(jié)束。菌劑和碳源的投加時間為實驗前4 d，每天上午9點。其中，光合菌劑(YSB)每天的投加量為5 mL，反硝化芽孢桿菌(GY-45,GY-46)每天的投加量為1.5 mg。實驗中，菌劑、碳源以及投加量等，均為目前城市內(nèi)河治理中常用的菌劑、碳源種類和劑量。

表1 不同儲水器的處理方案

注：1～6 表示儲水器的編號；A、B、C、M分別表示增氧(aeration)、空白(blank)、碳源(carbon)、菌劑(microbe)。

1.3 水質(zhì)分析方法

1.4 水樣總DNA的提取

每個儲水器取250 mL水樣，用0.22 μm微孔濾膜過濾后，在超凈工作臺將濾膜剪碎，放入50 mL離心管中。用水樣DNA提取試劑盒(OMEGA)提取樣品總DNA。

1.5 16S rDNA片段的 PCR擴增

PCR采用TransStartFastPfu DNA PolyMerase，20 μL 反應體系：4 μL 5×FastPfu Buffer；2 μL 1.5 mM dNTPs；0.8 μL Forward Primer(5 μmoL/L)；0.8 μL Reverse Primer(5 μmoL/L)；0.4 μL FastPfu Polymerase；10 ng Template DNA；補ddH2O至20 μL。反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸45 s，共計27個循環(huán)。最后72℃退火5 min，10℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.6 數(shù)據(jù)處理

本文所用繪圖軟件為origin 8.0。采用CANNO軟件進行PCA、RDA等相關(guān)性分析

2 結(jié)果分析

2.1 水質(zhì)凈化效果

表2是各儲水器凈化后的水質(zhì)參數(shù)。從表2可以看出，與對照水樣(1B)相比，2C水樣的DO值明顯降低，僅為0.1 mg/L；4M水樣DO值也略微下降，為4.9 mg/L；其余各水樣的DO值均顯著上升，在7.2～8.6 mg/L之間，達到并超過國家Ⅱ類水質(zhì)標準。這主要是由于在投加碳源之后，提高水體微生物反硝化能力的同時也為水體微生物的生長提供了更加有利的條件，但微生物的生長必然會消耗大量的DO[14]。

在脫氮方面，與對照水樣(1B)相比，2C、5CA和6CAM水樣的TN均明顯降低，脫氮率分別為57.94%、60.59%和59.71%，脫氮效果顯著[15]。而3A和4M水樣的TN沒有明顯變化，說明單獨添加菌劑或者增氧對水體脫氮均無明顯作用。其中，菌劑的脫氮效果與實驗室對菌株脫氮效率的測定結(jié)果存在較大差距，這可能是因為菌株脫氮效率的測定是在較高濃度的TN環(huán)境(35.14 mg/L)下進行的，而實驗水樣中的TN值(3.40 mg/L)遠低于這個水平。

COD脫除方面，3A、4M的 COD質(zhì)量濃度分別為23.32 mg/L和12.93 mg/L，COD脫除率分別為32.87%和62.78%，而其他水樣COD的質(zhì)量濃度均有所增加，這可能是由于添加的碳源沒有被及時利用所致。

表2 各儲水器的水質(zhì)參數(shù)

與對照水樣(1B)相比，其余水樣的細菌總數(shù)(TB)均增加了2～72倍，2C水樣增加尤為顯著，這說明了實驗所用的修復技術(shù)有利于水體微生物的生長。

2.2 菌落結(jié)構(gòu)多樣性分析

將擴增后的PCR產(chǎn)物進行高通量測序，得到的16s rRNA基因序列數(shù)目和OTUs總數(shù)見表3。通過Shannon指數(shù)和PD whole tree指數(shù)評估各水樣微生物群落的多樣性。從表3可以看出，各水樣均有高于88%的OTUs被發(fā)現(xiàn)，測序結(jié)果可以真實地反映水樣的微生物群落結(jié)構(gòu)。2C水樣的Shannon多樣性指數(shù)和PD whole tree多樣性指數(shù)均明顯低于1B和其他水樣，說明2C水樣的微生物多樣性在投加碳源之后明顯降低，水體生態(tài)極其脆弱。3A和4M水樣分別應用了曝氣和生物投菌技術(shù)，其PD whole tree指數(shù)分別為61.25和61.09，與原樣相比，水體的生物多樣性均有所增加，但是低于5CA和6CAM水樣，這兩個水樣綜合運用了多種生物修復技術(shù)，PD whole tree多樣性指數(shù)分別為65.44和68.61。

表3 不同方法處理后水體微生物OTUs多樣性分析

高通量測序結(jié)果表明，1B、2C、3A、4M、5CA、6CAM中的微生物分別隸屬于31、18、33、34、32、36個門，其水樣的微生物群落門水平相對豐度見圖2。從圖2可知，2C水樣中的微生物種群多樣性明顯低于其他水樣，且以變形菌門(Proteobacteria93%)為主，其次為擬桿菌門(Bacteroidetes1%)和厚壁菌門(Firmicutes4%)，在其他細菌門中的分布均低于0.1%。其余各水樣中的微生物主要以變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)為主，其次為厚壁菌門(Firmicutes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠菌門(Chlorobi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadete)等。在其余水樣中，不同菌門的相對豐度也有差別。3A和4M水樣中優(yōu)勢菌門的豐度比較相似，而在5CA水樣中，變形菌門(Proteobacteria63%)的相對豐度與原樣相比提高了6%，放線菌門(Actinobacteria9%)的相對豐度則降低了11%。6CAM在變形菌門(Proteobacteria47%)的相對豐度則低于1B，而其在擬桿菌門(Bacteroidetes38%)的相對豐度則明顯高于1B、2C、3A、4M(16%、7%、9%、15%)。

圖2 不同水樣微生物群落門水平下相對豐度比較

變形菌門雖然是各水樣的主要優(yōu)勢菌群，但其在變形菌門內(nèi)的群落分布也有差別(圖3)。2C水淹的β-變形菌綱(Betaproteobacteria 63%)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria 22%)在變形菌門中占據(jù)著極大的優(yōu)勢。3A和4M水樣的β-變形菌綱(Betaproteobacteria 38% 37%)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria 13% 18%)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria11% 20%)在其水樣中的豐度則大致相同。5CAM水樣中也是以β-變形菌(Betaproteobacteria 32%)為主，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria 16%)的豐度略高于γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria 11%)。6CAM水樣β-變形菌綱(Betaproteobacteria 32%)豐度與5CAM水樣相同，而α-變形菌綱(Alphaproteobacteria 15%)的豐度要明顯高于γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria 5%)。由此可見，投加了碳源的水樣(2C)，水體微生物多樣性急劇下降，優(yōu)勢菌群極少，水體生態(tài)很差。而經(jīng)過曝氣(3A)、生物投菌技術(shù)(4M)后的水樣，種群豐度和多樣性均比較相似，高于原樣，水體生態(tài)得到修復。綜合處理(5CA、6CAM)的水樣，種群豐度和多樣性有較大差別，高于原樣，水體生態(tài)修復效果高于其余水樣。

1B、2C、3A、4M、5CA、6CAM中的微生物分別隸屬于96、51、109、94、102、106個屬，豐度高于0.1%的優(yōu)勢菌屬分別有14個、6個、18個、17個、13個和16個(表4)。其中，各水樣中，芽孢桿菌屬(Bacillus)和紅細菌屬(Rhodobacter)的相對豐度分別為0.007%、0.001%、0.040%、0.100%、0.009%、0.100%和0.100%、0.020%、0.200%、0.700%、0.300%、0.700%。這表明，實驗所用的光合細菌和反硝化芽孢桿菌在投加后均得到了較好的生長。

圖3 各水樣中微生物群落的綱水平豐度

門類種屬1Blank2C3D4B5CD6BCD變形菌門噬氫菌屬++++紅長命菌屬++++水小桿菌屬++多核桿菌屬+++++脫氯菌屬++++++動膠菌屬++色素細菌+++++

續(xù)表4

注：“+”為相對豐度大于0.1%的屬。

2.3 相關(guān)性分析

通過不同樣本的主要微生物種屬對各樣本進行主成分分析(PCA)，見圖4。PCA的前兩個變量共可解釋76.7%的數(shù)據(jù)，其中第一軸可以解釋55.8%的數(shù)據(jù)，第二軸可以解釋20.9%的數(shù)據(jù)。從圖4可以看出，1B、3A和4M樣品在PCA圖上的距離接近，表明這3個樣本的群落組成很相似，而5CA和6CAM的群落組成則較為相似。2C距離其他樣本較遠，表明2C樣本的群落組成與其他樣本差異很大。這說明了在河流治理過程中，添加碳源容易改變水體本身的群落組成，少數(shù)菌群容易競爭形成優(yōu)勢菌群，并對微生物的生長產(chǎn)生抑制作用，而增氧和投菌技術(shù)在提高生物多樣性的同時，不會對水體微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較為明顯的變化。

圖4 不同樣本的主成分分析

圖5 不同樣本的降趨勢對應分析

3 討 論

4 結(jié) 論

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Effectsofvariousremediationtechnologiesonwaterqualityandmicrobialcommunityinurbaninlandrivers

SHENYi,HUNan

(SchoolofBiologicalandPharmaceuticalEngineering,NanjingTECHUniversity,Nanjing211800,China)

river improvement; microbial community; high-throughput sequencing; water quality restoration

10.3880/j.issn.1004-6933.2017.06.26

沈益(1991—)，男，碩士研究生，研究方向為環(huán)境微生物。E-mail:406205391@qq.com

X522

A

1004-6933(2017)06-0167-08

2016-11-28 編輯：彭桃英)