李蒙，李錚，李欣，杜曼婷，宋璇，張德權(quán)

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磷酸化水平對(duì)肌紅蛋白穩(wěn)定性的影響

李蒙，李錚，李欣，杜曼婷，宋璇，張德權(quán)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

肌紅蛋白是影響肉色最主要的色素物質(zhì)，主要存在于肌漿中，其絕對(duì)含量和3種肌紅蛋白（氧合肌紅蛋白、脫氧肌紅蛋白、高鐵肌紅蛋白）間的相對(duì)含量決定了肉色。已有研究表明蛋白質(zhì)的磷酸化可能會(huì)通過對(duì)糖酵解代謝途徑以及肌紅蛋白的調(diào)控進(jìn)而負(fù)向調(diào)控肉色的穩(wěn)定性，本研究旨在探究磷酸化對(duì)肌紅蛋白穩(wěn)定性的影響，進(jìn)而為通過調(diào)控磷酸化水平提高肉色穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。用連二亞硫酸鈉還原骨骼肌肌紅蛋白純品，再經(jīng)超濾除去連二亞硫酸鈉。隨后采用堿性磷酸酶（AP）體外孵育催化肌紅蛋白的去磷酸化反應(yīng)，采用SDS-PAGE凝膠電泳和Pro-Q與Ruby染色的方法測(cè)定肌紅蛋白磷酸化水平的變化，測(cè)定孵育體系pH的變化，紫外分光光度計(jì)測(cè)定孵育過程中3種肌紅蛋白相對(duì)含量的變化，圓二色譜測(cè)定孵育過程中肌紅蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。磷酸化水平的測(cè)定結(jié)果表明，堿性磷酸酶處理組（去磷酸化處理）中肌紅蛋白的磷酸化水平在孵育6 h時(shí)顯著低于對(duì)照組（＜0.05），表明堿性磷酸酶可以在體外孵育過程中催化肌紅蛋白發(fā)生去磷酸化反應(yīng)，降低肌紅蛋白的磷酸化水平。3種肌紅蛋白相對(duì)含量的測(cè)定結(jié)果表明，從孵育2 h起，堿性磷酸酶處理組中氧合肌紅蛋白的相對(duì)含量顯著高于對(duì)照組，高鐵肌紅蛋白的相對(duì)含量顯著低于對(duì)照組。即與對(duì)照組相比，堿性磷酸酶處理組中肌紅蛋白的自動(dòng)氧化速率低，氧化還原穩(wěn)定性高（＜0.05）。pH的測(cè)定結(jié)果表明，堿性磷酸酶處理組和對(duì)照組孵育體系的pH差異不顯著（>0.05），即添加堿性磷酸酶進(jìn)行孵育沒有改變孵育體系的pH。二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定結(jié)果表明，肌紅蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。從孵育0 min到6 h，堿性磷酸酶處理組中肌紅蛋白的α-螺旋和β-折疊的含量基本不變，而對(duì)照中肌紅蛋白的α-螺旋含量增加，β-折疊的含量減少，表明堿性磷酸酶處理組中肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性高于對(duì)照組。肌紅蛋白發(fā)生磷酸化修飾后，可能會(huì)通過改變肌紅蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，降低肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，增加肌紅蛋白的自動(dòng)氧化速率，進(jìn)而加速高鐵肌紅蛋白的積累，不利于肉色穩(wěn)定性，這可能是蛋白質(zhì)磷酸化負(fù)向調(diào)控肉色穩(wěn)定性的原因之一。

肉色；肌紅蛋白；磷酸化；氧化還原穩(wěn)定性；二級(jí)結(jié)構(gòu)

0 引言

【研究意義】肉色是消費(fèi)者接觸肉及肉制品時(shí)最直觀的印象[1]，色澤差的肉給人不衛(wèi)生、品質(zhì)差的感覺，因此肉色是影響消費(fèi)者購(gòu)買決定最重要的因素之一[2-3]。肌紅蛋白（Myoglobin，Mb）是宰后肉中最重要的色素物質(zhì)[4-6]，因此，研究影響肌紅蛋白穩(wěn)定性的因素，能夠?yàn)樘岣呷馍€(wěn)定性提供一定的理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在Canto等[7]的研究中發(fā)現(xiàn)肌紅蛋白的等電點(diǎn)發(fā)生了酸性轉(zhuǎn)移，表明肌紅蛋白（PI=6.78）存在翻譯后修飾，且發(fā)生修飾的肌紅蛋白點(diǎn)在肉色不穩(wěn)定組中含量豐富，因此推測(cè)肌紅蛋白的這種翻譯后修飾會(huì)影響肉色穩(wěn)定性。Zhu等[8]的研究表明PI大于6.4的蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)的酸性轉(zhuǎn)變預(yù)示著該蛋白發(fā)生了磷酸化修飾。此外，已有研究證明人和小鼠的肌紅蛋白存在磷酸化修飾（www.phosphosite.org），因此，推測(cè)肌紅蛋白的磷酸化修飾可能會(huì)影響肉色穩(wěn)定性。筆者團(tuán)隊(duì)的前期研究表明蛋白質(zhì)的磷酸化反應(yīng)負(fù)向調(diào)控肉色穩(wěn)定性，且磷酸化可能是通過對(duì)糖酵解過程以及肌紅蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控而影響肉色[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)肉色穩(wěn)定性影響的相關(guān)研究較少，磷酸化對(duì)肌紅蛋白穩(wěn)定性影響的研究也較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以純品骨骼肌肌紅蛋白為材料，經(jīng)連二亞硫酸鈉還原得到還原態(tài)肌紅蛋白。將肌紅蛋白與堿性磷酸酶（AP）進(jìn)行體外孵育（37℃）進(jìn)而調(diào)控肌紅蛋白的磷酸化水平，得到磷酸化水平差異的肌紅蛋白樣品。通過對(duì)肌紅蛋白氧化還原穩(wěn)定性的分析，探究肌紅蛋白磷酸化對(duì)其氧化還原穩(wěn)定性的影響。通過對(duì)肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究，明確磷酸化對(duì)肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

本研究于2016年10月至2017年3月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

Pro-Q Diamond染色液、SYPRO Ruby染色液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris Base）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉雙丙烯酰胺（Methylene diacrylamide）、過硫酸銨（APS）、二硫蘇糖醇（DTT）、四甲基乙二胺（TEMED）、連二亞硫酸鈉、馬骨骼肌肌紅蛋白均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、異丙醇、乙醇、甲醇、乙酸、乙腈、乙酸鈉等均為分析純，均購(gòu)自國(guó)藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；15 mL超濾管，截留分子量5 kD，購(gòu)自美國(guó)millipore公司。

超純水機(jī)FCR1000-UF-E，青島富勒姆科技有限公司；磁力攪拌器，天津歐諾儀器儀表有限公司；電子天平ML204/02，上海梅特勒-托利多有限公司；水平脫色搖床TS-2型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Mettler-Toledo pH計(jì)，上海梅特勒-托利多有限公司；雪花制冰機(jī)，北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器公司；臺(tái)式高效冷凍離心機(jī)Neofuge 15R，上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；紫外可見光分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司；ChemiDocTM MP成像系統(tǒng)、電泳設(shè)備（Mini-Protein Tetra System），美國(guó)Bio-Rad公司；移液槍，德國(guó)Eppendorf公司；MJ-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；圓二色譜儀MOS-450/AF-CD，法國(guó)Bio-Logic公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品孵育 用磷酸鹽緩沖液（pH 8.0，50 mmol?L-1）將馬骨骼肌肌紅蛋白配制成4 mg?mL-1的溶液，添加連二亞硫酸鈉將肌紅蛋白還原為還原態(tài)肌紅蛋白。在3 000×，4℃超濾離心15 min，重復(fù)離心兩次以除去連二亞硫酸鈉。堿性磷酸酶（AP）用磷酸鹽緩沖液稀釋后加入孵育體系，孵育體系中肌紅蛋白濃度為0.5 mg?mL-1，堿性磷酸酶用量為25 U/100 μg Mb。試驗(yàn)組為肌紅蛋白與堿性磷酸酶的混合液，對(duì)照組中為肌紅蛋白溶液，每組3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 肌紅蛋白含量的測(cè)定 按照Tang等[10]的方法測(cè)定3種肌紅蛋白的相對(duì)含量。用紫外可見光分光光度計(jì)測(cè)定樣品在503、525、557、和582 nm處的吸光值。3種肌紅蛋白相對(duì)含量計(jì)算公式如下：

[DMb]=-0.5431+1.5942+0.5523-1.329

[MbO2]=0.7221-1.4322-1.6593+2.599

[MetMb]=-0.1591-0.0852+1.2623-0.520

式中，1=A582/A525，2=A557/A525，3=A503/A525。

1.2.3 pH測(cè)定 將pH計(jì)校正后，直接將探針插入溶液中測(cè)定孵育體系的pH。分別在孵育0 min、30 min、2 h、6 h、24 h和48 h時(shí)取樣測(cè)定孵育體系的pH，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.4 肌紅蛋白磷酸化水平測(cè)定 參照文獻(xiàn)[11-13]測(cè)定肌紅蛋白的磷酸化水平。將1體積的肌紅蛋白溶液與等體積的2倍上樣緩沖液混合（100 mmol?L-1Tris-HCl，pH 6.8，40 g?L-1的SDS，1 g?L-1的考馬斯亮藍(lán)，250 g?L-1的甘氨酸），在100℃下煮沸5 min。電泳采用12%的分離膠和4%的濃縮膠，每孔上樣量為0.3 μg肌紅蛋白，每個(gè)蛋白樣品做3個(gè)重復(fù)。電泳初始電壓為70 V，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至110 V，待溴酚藍(lán)距離底部1 cm左右時(shí)關(guān)閉電源。

電泳結(jié)束后，按照Pro-Q Diamond染液和SYPRO Ruby染液的試劑說明書進(jìn)行熒光染色，凝膠用固定液（10%乙酸，50%甲醇）固定（2次，每次30 min）后水洗（3次，每次10 min），隨后經(jīng)Pro-Q Diamond染料避光染色（90 min），再經(jīng)Pro-Q脫色液（20%乙腈，50 mmol?L-1乙酸鈉，pH 4.0）脫色（避光，2次，每次30 min）。脫色后水洗（避光，3次，每次5 min），并采用ChemiDocTMMP凝膠呈像系統(tǒng)對(duì)磷酸化蛋白進(jìn)行圖像掃描。磷酸化蛋白圖像掃描后用SYPRO Ruby染液進(jìn)行全蛋白染色（避光，4 h，可過夜），再經(jīng)Ruby脫色液（7%乙酸，10%乙醇）脫色（避光，每次30 min，2次），隨后水洗（避光，3次，每次5 min），并經(jīng)ChemiDocTMMP凝膠呈像系統(tǒng)進(jìn)行圖像掃描。采用Quantity One軟件對(duì)Pro-Q染色和Ruby染色后的光密度值進(jìn)行定量分析。Mb的磷酸化水平用Pro-Q染色后的光密度值（P）與Ruby染色后的光密度值（T）的比值來表示。P/T值是衡量蛋白質(zhì)磷酸化水平的一種半定量方法[14]。用堿性磷酸酶孵育0 min時(shí)的樣品，對(duì)不同膠上的磷酸化水平進(jìn)行歸一化來消除不同凝膠上電泳及染色的差異。

1.2.5 肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定 掃描波長(zhǎng)范圍190—250 nm，掃描波長(zhǎng)間隔1 nm，每nm波長(zhǎng)測(cè)量持續(xù)時(shí)間為2 s；采用1 mm光徑的樣品池，每組3個(gè)樣品，每個(gè)樣品自動(dòng)掃描2次。上機(jī)時(shí)將肌紅蛋白溶液稀釋為0.1 mg?mL-1，以磷酸鹽緩沖液（pH 8.0，50 mmol?L-1）為空白。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行在線二級(jí)結(jié)構(gòu)分析（http:// dichroweb.cryst.bbk.ac.uk），選擇CDSSTR算法計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 用IBM SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。最小顯著差異法（Least significant difference）和鄧肯多重比較法（Duncan’s multiple range tests）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性分析設(shè)置在5%的差異顯著水平，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。

2 結(jié)果

2.1 肌紅蛋白磷酸化水平

由于孵育體系中只有肌紅蛋白，因此在單向電泳中只存在一個(gè)肌紅蛋白的蛋白條帶，所測(cè)定的磷酸化水平即為肌紅蛋白的磷酸化水平。圖1-A為磷酸化染色電泳圖，圖1-B為總肌紅蛋白染色電泳圖，電泳圖經(jīng)Quantity One軟件進(jìn)行分析，計(jì)算得到肌紅蛋白的磷酸化水平（P/T值）。

蛋白質(zhì)在激酶催化下發(fā)生磷酸化反應(yīng)，在磷酸酶催化下發(fā)生去磷酸化反應(yīng)，其中堿性磷酸酶可以催化蛋白發(fā)生去磷酸化反應(yīng)，降低蛋白的磷酸化水平[15]。肌紅蛋白磷酸化水平的分析結(jié)果如圖2所示，在孵育6 h時(shí)，兩組間肌紅蛋白的磷酸化水平出現(xiàn)顯著差異（＜0.05），堿性磷酸酶處理組（AP組）肌紅蛋白磷酸化水平顯著低于對(duì)照組（＜0.05），表明堿性磷酸酶催化肌紅蛋白發(fā)生了去磷酸化反應(yīng)，降低了肌紅蛋白的磷酸化水平。

A：磷酸化肌紅蛋白染色圖；B：總肌紅蛋白染色圖

不同的字母代表同一時(shí)間點(diǎn)兩組間差異顯著（P＜0.05）。下同

2.2 3種肌紅蛋白相對(duì)含量變化

肌紅蛋白由一分子珠蛋白（包含153個(gè)氨基酸）和一分子血紅素輔基組成[16]。血紅素輔基由一個(gè)鐵離子和四分子吡咯環(huán)組成的鐵卟啉構(gòu)成。鐵離子共有6個(gè)配位鍵，其中第6個(gè)配位鍵可以與一些小分子物質(zhì)結(jié)合，如氧氣、氮?dú)狻⑺肿?、一氧化碳等。由于肌紅蛋白第6個(gè)配位鍵所結(jié)合配體的不同，肌紅蛋白存在多種狀態(tài)，其中以脫氧肌紅蛋白（DMb）、氧合肌紅蛋白（MbO2）和高鐵肌紅蛋白（MetMb）為主。在宰后放血充分的肉中，肌紅蛋白是最重要的色素物質(zhì)，且肌紅蛋白的絕對(duì)含量和3種肌紅蛋白的相對(duì)含量決定了肉色[6,17]。3種肌紅蛋白相對(duì)含量的測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

在孵育0—30 min時(shí)，孵育體系中以脫氧肌紅蛋白為主，隨后脫氧肌紅蛋白與氧結(jié)合生成氧合肌紅蛋白，同時(shí)肌紅蛋白被氧化生成高鐵肌紅蛋白。在孵育2 h時(shí)，體系中以氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白為主。從2 h起體系中MbO2的含量逐漸降低，MetMb的含量逐漸增加。從孵育2 h起，孵育體系中DMb、MbO2以及MetMb的相對(duì)含量在AP組和對(duì)照組間差異顯著（＜0.05）。其中，對(duì)照組中MbO2的含量顯著低于AP組（＜0.05），DMb的含量顯著低于AP組（＜0.05），而MetMb的含量顯著高于AP組（＜0.05）。這表明與對(duì)照組相比，AP組中還原態(tài)肌紅蛋白的含量較高（＜0.05），MetMb的含量較低（＜0.05）。

2.3 孵育體系pH變化

pH是影響肌紅蛋白穩(wěn)定性的重要因素，為明確孵育體系pH是否對(duì)肌紅蛋白穩(wěn)定性產(chǎn)生了影響，測(cè)定了孵育過程中孵育體系pH的變化，結(jié)果表明在整個(gè)孵育過程中AP組和對(duì)照組間的pH差異不顯著（>0.05）（圖4）。這說明添加堿性磷酸酶處理沒有導(dǎo)致孵育體系pH的變化。因此推測(cè)，在孵育過程中AP組和對(duì)照組間肌紅蛋白穩(wěn)定性的差異不是pH造成的。

2.4 肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

肌紅蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主[18]。AP孵育前后肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化如表1所示，肌紅蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主。在孵育30 min和6 h時(shí)，AP組中α-螺旋的含量低于對(duì)照組，β-折疊的含量高于對(duì)照組。孵育24 h和48 h時(shí)，AP組和對(duì)照組中肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均以α-螺旋為主，且兩組間的螺旋含量無差異。從孵育0—6 h，AP組中肌紅蛋白的α-螺旋和β-折疊的含量變化較小，對(duì)照組中肌紅蛋白的α-螺旋含量增加，β-折疊的含量減少，這表明AP組中肌紅蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高于對(duì)照組，即肌紅蛋白磷酸化后影響了其二級(jí)結(jié)構(gòu)，且低磷酸化水平肌紅蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高。

A：氧合肌紅蛋白含量隨時(shí)間變化；B：脫氧肌紅蛋白含量隨時(shí)間變化；C：高鐵肌紅蛋白含量隨時(shí)間變化

圖4 孵育體系pH值隨時(shí)間變化

表1 肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

3 討論

當(dāng)肉表面以脫氧肌紅蛋白為主時(shí)，肉呈現(xiàn)紫紅色或紫粉色。當(dāng)肉表面以氧合肌紅蛋白為主時(shí)，肉呈現(xiàn)鮮紅色。當(dāng)肉表面以高鐵肌紅蛋白為主時(shí)，肉呈現(xiàn)褐色，因此高鐵肌紅蛋白的生成伴隨著肉色的劣變[17,19]。AP組中高鐵肌紅蛋白的含量顯著低于對(duì)照，表明AP組中肌紅蛋白的自動(dòng)氧化速率低于對(duì)照組，氧化還原穩(wěn)定性高于對(duì)照。另外，AP組中肌紅蛋白的磷酸化水平低于對(duì)照組。推測(cè)低磷酸化水平組肌紅蛋白的自動(dòng)氧化速率低于高磷酸化水平組，即低磷酸化水平肌紅蛋白的氧化還原穩(wěn)定性高于高磷酸化水平肌紅蛋白，肌紅蛋白的磷酸化可能負(fù)向調(diào)控肌紅蛋白的氧化還原穩(wěn)定性。

宰后pH的下降速率和下降程度是影響肉色最重要的因素之一[20]，且肌紅蛋白的氧化還原速率受到pH的顯著影響。在較低的pH環(huán)境下會(huì)降低肌紅蛋白分子中珠蛋白和血紅素輔基結(jié)合鍵的穩(wěn)定性，進(jìn)而使得肌紅蛋白自動(dòng)氧化速率升高，氧化還原穩(wěn)定性降低而易被氧化。Gutzke等[21]的研究中發(fā)現(xiàn)，在不同的物種和溫度下肌紅蛋白的氧化速率受到pH的顯著影響。Shikama等[22]研究了pH（4.8—2.6）對(duì)肌紅蛋白氧化的影響，結(jié)果表明肌紅蛋白的氧化反應(yīng)直接受H+濃度的影響。而在本研究中，AP組和對(duì)照間孵育體系的pH無差異，因此可以排除pH對(duì)肌紅蛋白穩(wěn)定性的影響，即試驗(yàn)中AP組和對(duì)照組間肌紅蛋白穩(wěn)定性的差異不是pH造成的。此外，由于孵育試驗(yàn)是用相同的材料并在相同的環(huán)境溫度下進(jìn)行的，因此可以排除其他外在因素對(duì)肌紅蛋白自動(dòng)氧化速率的影響，推測(cè)AP組和對(duì)照組肌紅蛋白間穩(wěn)定性的差異是由于兩組間肌紅蛋白磷酸化水平的差異引起的。

肌紅蛋白是一種單體球蛋白，可以儲(chǔ)存氧氣并向線粒體傳遞氧。有研究表明，通過共價(jià)或非共價(jià)的修飾來調(diào)控單體球蛋白的活性是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象[23]，如人的神經(jīng)球蛋白（單體球蛋白）無論在體內(nèi)或者體外，都會(huì)在缺氧條件下發(fā)生磷酸化（共價(jià)修飾）修飾進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。推測(cè)肌紅蛋白的磷酸化可能與氧氣的含量相關(guān)，并影響肌紅蛋白與氧的結(jié)合能力，進(jìn)而會(huì)影響肌紅蛋白的存在狀態(tài)。研究表明，磷酸化會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、活性和穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的調(diào)控，如丙酮酸激酶在發(fā)生磷酸化后會(huì)轉(zhuǎn)變成一種酸性穩(wěn)定異構(gòu)體，進(jìn)而在PSE肉中保持較高的活性[24]。糖原磷酸化酶第十四位的絲氨酸可以被磷酸化，引起其結(jié)構(gòu)的改變，并使其激活[25-26]。磷酸果糖激酶磷酸化后與肌動(dòng)蛋白形成一個(gè)復(fù)合物，調(diào)控磷酸果糖激酶的活性并為細(xì)胞提供能量[27-28]。此外，Díaz-Moreno等[29]的研究表明KSRP發(fā)生磷酸化后，會(huì)使其不穩(wěn)定的KH1區(qū)域中不規(guī)則的結(jié)構(gòu)伸展，進(jìn)而改變?cè)摰鞍椎慕Y(jié)構(gòu)。Zhang等[30]的研究表明GhPK6在第215和402位的絲氨酸存在磷酸化，其中第215位絲氨酸的磷酸化會(huì)抑制該酶的活性，在215位和402位的磷酸化會(huì)促進(jìn)該蛋白的降解。而在本研究中，磷酸化水平差異的肌紅蛋白其二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也存在差異。因此，推測(cè)可能是AP組和對(duì)照組兩組間肌紅蛋白磷酸化水平的差異，引起了兩組間肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異，而結(jié)構(gòu)的差異可能導(dǎo)致了兩組間肌紅蛋白自動(dòng)氧化速率和氧化還原穩(wěn)定性的差異。肌紅蛋白發(fā)生磷酸化或者去磷酸化后，可能會(huì)對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的調(diào)控作用，進(jìn)而影響肌紅蛋白與氧氣的結(jié)合狀態(tài)，最終影響肌紅蛋白的自動(dòng)氧化速率和氧化還原穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

堿性磷酸酶可以在體外催化肌紅蛋白發(fā)生去磷酸化反應(yīng)，進(jìn)而降低肌紅蛋白的磷酸化水平。堿性磷酸酶處理組（去磷酸化處理）中肌紅蛋白的自動(dòng)氧化速率低，氧化還原穩(wěn)定性高。而外加堿性磷酸酶處理沒有改變孵育體系的pH，表明兩組間肌紅蛋白穩(wěn)定性的差異不是pH造成的。此外，與對(duì)照組相比，肌紅蛋白發(fā)生去磷酸化后，其二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強(qiáng)。因此推測(cè)，肌紅蛋白發(fā)生磷酸化修飾后，可能會(huì)降低其二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并可能使肌紅蛋白的自動(dòng)氧化速率升高，氧化還原穩(wěn)定性降低，不利于肉色的穩(wěn)定性，這可能是蛋白質(zhì)磷酸化負(fù)向調(diào)控肉色穩(wěn)定性的原因之一。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Effect of phosphorylation level on myoglobin stability

LI Meng, LI Zheng, LI Xin, DU ManTing, SONG Xuan, Zhang DeQuan

(Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Beijing 100193)

Myoglobin is the main pigment responsible for meat color, which is mainly in sarcoplasm. Meat color is determined by the absolute content and the dynamics of myoglobin redox form interconversions. Studies have shown that protein phosphorylation may play a negative role in meat color development by regulating glycolysis and the redox stability of myoglobin. The effects of phosphorylation on myoglobin stability was investigated in this study, which will provide theoretical basis for improving meat color stability through regulating protein phosphorylation level.The pure metmyoglobin from skeletal muscle was used. Metmyoglobin was reduced by sodium dithionite, which was then removed by ultrafiltration. After that, alkaline phosphatase (AP) was added to catalyze the dephosphorylation of myoglobin.The phosphorylation level of myoglobin was determined by using SDS-PAGE and then stained by Pro-Q & Rubyreagent. pH value was measured by a pH meter. The relative content of three myoglobin forms (oxygenated myoglobin, deoxy myoglobin and iron myoglobin) and the secondary structure of myoglobin during the incubation were measured by ultraviolet spectrophotometerand circular dichroism spectrum, respectively.According to the results, the phosphorylation level of myoglobin was significantly lower (＜0.05) in AP group than that in control group at 6 h, which indicating that alkaline phosphatase can catalyze the dephosphorylation of myoglobin, thus decrease the phosphorylation level of myoglobin. The relative content of oxymyoglobin in AP group was significantly higher than that in control group, and the relative content of metmyoglobin was significantly lower than that in control group after 2 h. In brief, the automatic oxidation rate of myoglobin was lower and the redox stability of myoglobin was higher in AP group than that in control group. However, no significant difference (>0.05) was observed betweenAP group and control group, which means that pH value of the incubation system was not changed by adding alkaline phosphatase. The results showed that the secondary structure of myoglobin was mostly α-helix. From 0 min to 6 h incubation, the contents of α-helix and β-sheet of myoglobin were almost unchanged in AP group, while the α-helix content of myoglobin increased and β-sheet content of myoglobin decreased in control group, indicating that the secondary structural stability of Mb was increased after dephosphorylation.It was speculated that the secondary structure of myoglobin might be changed after phosphorylation. The secondary structure stability was decreased and automatic oxidation rate of myoglobin was increased after phosphorylation. Thus, leading to the accumulation of metmyoglobin and colordeterioration, and this might be one of the reasons by which protein phosphorylation play a negative role in regulating meat color stability.

meat color; myoglobin; phosphorylation; redox stability; secondary structural

2017-05-25；

國(guó)家現(xiàn)代肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-39）、國(guó)家農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程、公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303083）

接受日期：2017-07-25

聯(lián)系方式：李蒙，Tel：010-62816474；E-mail：Limeng1214@126.com。通信作者張德權(quán)，Tel：010-62818740；E-mail：dequan_zhang0118@126.com