趙靜，孫洋，譚永安，肖留斌，姜義平，柏立新

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甜菜夜蛾卵黃原蛋白多克隆抗體制備及其在不同發(fā)育時期蛋白表達

趙靜，孫洋，譚永安，肖留斌，姜義平，柏立新

（江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所/江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，南京 210014）

制備甜菜夜蛾（）卵黃原蛋白（vitellogenin，Vg）多克隆抗體，并檢測甜菜夜蛾不同發(fā)育時期血淋巴中的Vg蛋白表達量變化，為進一步研究Vg轉運與利用機制以及生物學功能打下基礎。以羽化24 h的甜菜夜蛾雌成蟲cDNA為模板，通過PCR擴增得到甜菜夜蛾基因片段，其包含vitellogenin-N結構功能區(qū)。將目的片段連入pMD-19T載體后進行測序，利用DNAMAN軟件分析該基因序列的準確性及編碼蛋白的特性。將測序正確的基因片段通過I和I限制性內切酶連接到原核表達載體pCzn1。將重組表達載體pCzn1-轉入大腸桿菌ArcticExpress，離心收集誘導表達的菌液，超聲波破碎菌體沉淀，取上清液與沉淀進行SDS-PAGE檢測，分析Vg重組蛋白的可溶性。在不同溫度、不同濃度IPTG條件下誘導表達Vg重組蛋白，篩選最優(yōu)表達條件。經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖凝膠親和層析柱純化得到了Vg重組蛋白，將該蛋白免疫新西蘭白兔，制備兔抗Vg血清抗體。采用間接ELISA方法檢測血清抗體的效價，并通過Western blot法檢測甜菜夜蛾雌蟲不同發(fā)育階段血淋巴中Vg蛋白的表達差異。擴增所得基因片段為2 091 bp，編碼697個氨基酸, 預測蛋白分子量為80.88 kD。通過大腸桿菌表達出的Vg重組蛋白相對分子量為80 kD，其大小與預期的Vg重組蛋白帶大小相符合。其主要以包涵體形式表達，而在上清中表達量不明顯。不同溫度、不同濃度IPTG條件下誘導表達Vg重組蛋白的結果顯示溫度為25℃，IPTG濃度為0.6 mmol·L-1時，Vg重組蛋白表達量最高。繼續(xù)提高溫度和IPTG濃度，對提高Vg重組蛋白的表達量無明顯作用，且雜蛋白增多。新西蘭白兔經(jīng)4次免疫后，間接ELISA法檢測表明，制備的兔抗Vg抗體具有較好的靈敏度，效價達到 1﹕512 000。Western blot檢測Vg蛋白在甜菜夜蛾不同發(fā)育階段血淋巴中的表達，其雜交出的單一條帶在180 kD左右。Vg蛋白在甜菜夜蛾雌蛹末期開始微弱表達。雌成蟲羽化后血淋巴中Vg蛋白表達量先升高后降低，呈動態(tài)變化，到羽化48 h表達量最高，隨后降低。純化獲得了Vg重組蛋白，并明確了最優(yōu)表達條件（溫度為25℃，IPTG濃度為0.6 mmol·L-1）；制備了高效價的甜菜夜蛾Vg多克隆抗體，明確了甜菜夜蛾Vg蛋白的表達規(guī)律。

甜菜夜蛾；卵黃原蛋白基因；原核表達；抗體制備；表達模式

0 引言

【研究意義】甜菜夜蛾（）屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），是一種世界性分布的多食性重要害蟲，可嚴重危害多種重要經(jīng)濟作物[1-2]。近年來，由于蔬菜、Bt棉等適生性蟲源寄主種植面積的擴大等因素，中國暴發(fā)頻度呈上升趨勢。其暴發(fā)的主要原因是繁殖能力強及較高的抗藥性[3-4]。目前，國內關于甜菜夜蛾的生殖生理研究還很薄弱，僅在生殖系統(tǒng)結構與發(fā)育分級方面有部分報道[5-6]。卵黃原蛋白（vitellogenin，Vg）的合成與卵黃的沉積是卵形成的關鍵因素，其含量直接影響雌成蟲產(chǎn)卵潛力。通過開展甜菜夜蛾卵黃發(fā)生的研究，可充分揭示甜菜夜蛾成蟲大量產(chǎn)卵的內在規(guī)律，對該蟲害種群測報與防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】在大部分昆蟲中，Vg是卵黃蛋白的前體，它由雌性脂肪體在激素的調控下合成，分泌到血淋巴，被卵母細胞通過卵黃原蛋白受體（vitellogenin receptor，VgR）調節(jié)的內吞作用所攝取，經(jīng)修飾、切除、加工后以晶體形式沉積為卵黃磷蛋白（vtellin，Vt）。迄今，有關昆蟲的分子特性、功能、卵黃發(fā)生的時間動態(tài)以及卵黃發(fā)生的內分泌調控機理等已有許多研究，涉及的昆蟲包括11目80余種[7-15]。不同昆蟲類群或同一昆蟲類群不同種類的個體，Vg合成與攝取的時間并不相同，這一性質決定了昆蟲卵黃發(fā)生的時間差異。在鱗翅目中，對于成蟲不取食的蛾類，Vg合成啟動在末齡幼蟲、預蛹或蛹初期，如舞毒蛾（）始于末齡幼蟲[16]；天蠶（）始于結繭的預蛹期[17]；而對于成蟲取食的蛾類，Vg合成和啟動在蛹末期或成蟲期，如斜紋夜蛾（）[15]和美洲棉鈴蟲（）[17]。隨著RNA干擾技術的發(fā)展，已有研究表明Vg不僅為胚胎發(fā)生提供營養(yǎng)物質，它在生物體內還具有氣候適應、激活卵巢、生殖競爭、行為構建、延長壽命、轉化食物、抗氧化、傳播病毒等其他的功能[18-20]?！颈狙芯壳腥朦c】昆蟲Vg的功能為人們利用或抑制昆蟲提供了新思路，在前期研究中甜菜夜蛾序列已克隆得到，但甜菜夜蛾Vg蛋白的合成、轉運與吸收機制以及生物學功能尚不明確。目前，研究Vg含量的動態(tài)變化主要采用免疫印跡方法，因此制備Vg抗體是研究的關鍵?！緮M解決的關鍵問題】在前期獲得卵黃原蛋白全長序列的基礎上，通過分離純化特異性肽鏈，制備其多克隆抗體，并通過Western blot分析甜菜夜蛾不同發(fā)育時期Vg含量的動態(tài)變化，揭示其卵黃發(fā)生規(guī)律，為在蛋白水平上進一步研究甜菜夜蛾Vg轉運與吸收機制以及生物學功能打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2016年在江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所完成。

1.1 材料

供試甜菜夜蛾蟲源來自江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所作物蟲害研究室。甜菜夜蛾飼養(yǎng)條件為溫度（26.5±1）℃，相對濕度（65±5）%，光周期 L﹕D=14 h﹕10 h，成蟲期補充10%蜂蜜水。

1.2 方法

1.2.1 Vg表達引物設計與序列擴增 根據(jù)筆者實驗室前期已發(fā)表的甜菜夜蛾的全長序列[21]（GenBank登錄號：KT599434），設計含有I和I酶切位點的特異性引物。用于擴增的特異性片段，包含 Vitellogenin-N 結構區(qū)。引物由上海生工合成。正向引物序列為：5′-GGGTTTCATATGTG GCAAACTGGCAAACT-3′，反向引物序列：5′-CTCTA GAAATTCCACTCTTGATAGC-3′。采用Trizol reagent（Invitrogen）提取羽化24 h的甜菜夜蛾雌成蟲（從破蛹而出開始計算羽化時間）總RNA，用M-MLV酶（Promega）反轉錄獲得cDNA。以此cDNA為模板用特異性引物擴增特異性片段。PCR反應程序為94℃預變性 3 min，然后按照 94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 120 s，進行 30 次循環(huán)反應，最后于 72℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，并通過膠回收試劑盒（Axygen）純化回收目的DNA片段。目的片段與pMD-19T 載體（TaKaRa）連接，經(jīng)PCR篩選陽性克隆后，送上海生工測序。利用DNAMAN軟件分析該基因序列的準確性及預測編碼蛋白的大小。重組載體命名為 pMD19T-。

1.2.2 Vg原核表達載體的構建 用限制性內切酶I和I酶（TaKaRa）雙酶切回收的PCR產(chǎn)物和空pCzn1載體（江蘇省農業(yè)科學院昆蟲實驗室保存），回收目的片段及表達載體，經(jīng)T4 DNA連接酶（TaKaRa）連接，16℃過夜后轉化大腸桿菌ArcticExpress（北京華越洋），在含有氨芐青霉素（Amp）的平板上抗性篩選培養(yǎng)，通過酶切及PCR擴增篩選陽性克隆，并將確認為陽性克隆的質粒送上海生工測序，分析是否為目的片段序列，將鑒定正確的重組質粒命名為 pCzn1-。

1.2.3Vg重組蛋白的可溶性分析及表達條件的優(yōu)化 接種鑒定正確的重組子于含有50 μg·ml-1Amp的 3 ml LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，1﹕100轉接于30 ml LB（含Amp）液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至 OD600值為0.5時，加入IPTG分別調至終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1，于37℃、200 r/min進行誘導融合蛋白表達。誘導4 h后收集1 ml菌液，6 000 r/min離心10 min，棄上清，用PBS重懸菌體沉淀；超聲波破碎菌體沉淀并離心，取上清液與沉淀進行12% SDS-PAGE檢測分析Vg 重組蛋白的可溶性及最適的 IPTG 濃度。在最適的IPTG終濃度進行溫度優(yōu)化，將誘導溫度分別調整至 20、25、30和 35℃，根據(jù)Vg重組蛋白表達量檢測結果確定誘導最佳溫度。

1.2.4 Vg包涵體蛋白的制備和純化 在最適 IPTG 濃度和溫度條件下進行 Vg目的蛋白大規(guī)模的誘導表達。將誘導表達后的培養(yǎng)菌液在低溫4℃條件下，60 000 r/min離心10 min，菌體沉淀與20 ml裂解buffer（包含20 mmol·L-1Tris-HCl、1 mmol·L-1PMSF和細菌蛋白酶抑制劑cocktail混合液，pH 8.0）重懸，重懸液進行超聲破碎（功率 400 W，工作 4 s，間歇8 s，共20 min）；將超聲破碎的細胞裂解液4℃10 000×離心20 min，收集沉淀；使用包涵體洗滌液（20 mmol·L-1Tris，1 mmol·L-1EDTA，2 mol·L-1尿素，1 mol·L-1NaCl，1% Triton X-100，pH 8.0）洗滌包涵體3次；用溶解緩沖液（20 mmol·L-1Tris，5 mmol·L-1DTT，8 mol·L-1尿素pH 8.0），按一定比例溶解包涵體，4℃放置過夜。利用低壓層析系統(tǒng)，包涵體溶液以0.5 ml·min-1流速上樣至Ni-IDA親和層析柱（Novagen），用Ni-IDA緩沖液洗脫目的蛋白，收集洗脫液。將洗脫液裝入透析袋，于4℃經(jīng)0.01 mol·L-1PBST 溶液（pH 8.0）透析過夜后獲得 Vg純化蛋白。采用 12% SDS-PAGE檢測Vg重組蛋白的純度。

1.2.5 Vg多克隆抗體的制備 取純化的Vg重組蛋白進行BCA蛋白濃度測定，免疫2只新西蘭白兔（2—2.5 kg）（江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所提供），進行皮下注射，每次免疫量為 400 μg，2—3周免疫一次，共免疫 4 次。第4次免疫后在大白兔頸動脈采血，8 000 r/min 離心8 min所得上清制備抗血清并準備純化抗體。將Vg蛋白與瓊脂糖介質偶聯(lián)制備成抗原親和純化層析柱，將PBS與所得抗血清等量混合后緩慢上樣，待抗體抗原結合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫得到所需純化抗體，并在PBS緩沖液中進行4℃透析過夜，隔日進行效價測定。

1.2.6 效價測定 用間接ELISA法對抗體進行最終的效價測定。以純化的Vg蛋白（5 μg·mL-1）包被ELISA 板，混勻后加入板條中，每孔加入100 μL，4℃過夜。用PBST（0.2 g KCl，0.2 g KH2PO4，2.9 g Na HPO4·12H2O，8 g NaCl，0.05% Tween-20，pH 7.4）洗滌3次，每次5 min后，加入封閉液（含5%牛血清白蛋白的PBST）于37℃封閉2 h。取出酶標板，棄去內液，用PBST洗板3次，加入用PBST連續(xù)倍比稀釋（500×20—500×210）的Vg多克隆抗體和陰性血清（免疫前健康兔血清）每孔100 μl，37℃恒溫箱1 h。同上洗滌后，加入100 μl的用PBST以1﹕5 000稀釋的二抗HRP-IgG，37℃放置 1 h。用PBST洗板3次，每次5 min，最后加 100 μl TMB 底物液顯色，37℃顯色15 min，待終止反應后，酶標儀測定 A450值。

1.2.7 多克隆抗體檢測甜菜夜蛾不同發(fā)育階段血淋巴Vg含量 采用背血管取血淋巴法[15,22]，用定量玻璃毛細管直接插入甜菜夜蛾胸部背血管，收集甜菜夜蛾不同發(fā)育時期（化蛹1—7 d的雌蛹，羽化0、12、24、48、60、72 h的雌成蟲）血淋巴樣品。甜菜夜蛾不同發(fā)育時期的血淋巴樣品設置3個重復，每個重復取自5頭試蟲，每頭試蟲定量吸取1 μl血淋巴，共5 μl。每個樣品用PBS溶液稀釋100 倍，上樣 10 μl，進行SDS-PAGE電泳，電轉印至 PVDF 膜上。轉印 PVDF 膜后，取下膜先用 PBST 洗滌 4 次，每次5 min，然后將膜用含5%脫脂奶粉的PBST封閉液置于37℃封閉 1 h，加入用 PBST 以1﹕5 000稀釋比例的一抗（上述制備的Vg多克隆抗體），膜在一抗稀釋液中4℃過夜。次日將膜取出后，用PBST洗膜4次，每次5 min。用PBST以1﹕5 000的比例稀釋二抗HRP-IgG（上海生工），膜在二抗中37℃反應 1 h。反應完畢后，把膜取出置于干凈的盒子中用PBST洗膜 4次，ECL顯影，曝光。

2 結果

2.1 甜菜夜蛾Vg片段的擴增和克隆

以羽化24 h的甜菜夜蛾成蟲cDNA為模板，用加酶切位點的特異性引物進行擴增， PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，呈現(xiàn)一條大小與預期相吻合的目的DNA條帶，約為2 091 bp（圖 1）。將此特異性條帶切膠回收，連接到pMD-19T載體，并挑斑鑒定。同時，測序克隆載體也驗證了序列的正確性。序列長度 2 091 bp，編碼 697 個氨基酸，預測蛋白分子量為 80.88 kD。

1：PCR 產(chǎn)物PCR product；M：DL2000 DNA Marker

2.2 Vg原核表達載體的構建

經(jīng)I和I雙酶切的基因片段，亞克隆到pCzn1載體上，轉化至大腸桿菌ArcticExpress，挑選平板上單一的菌落抽提質粒并進行酶切鑒定。如圖2所示，正確的重組質粒酶切后呈現(xiàn)兩條清晰的條帶，一條帶為 2 091 bp的片段，另一條帶為約4 400 bp的pCzn1載體。此外采用DNAMAN軟件分析該重組質粒測序所得序列，結果顯示基因序列無突變缺失，表明pCzn1-載體構建成功。

2.3 重組蛋白表達的鑒定

經(jīng)IPTG誘導后，重組克隆菌的表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析表明在80 kD處出現(xiàn)了一條新蛋白帶，其大小與預期的Vg重組蛋白帶大小相符合，其在沉淀中表達量較高而在上清中表達量不明顯（圖3）。

2.4 表達條件的優(yōu)化

2.4.1 IPTG濃度 以未誘導的菌體作為對照，用0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol·L-1的IPTG濃度誘導，隨著 IPTG 加入量的增加，Vg蛋白表達量也明顯增加（圖4）。當IPTG 濃度為0.6 mmol·L-1時，Vg蛋白表達量呈現(xiàn)最大化，而繼續(xù)提高 IPTG 的濃度對提高蛋白的表達量無明顯作用。

M：DL5000 DNA Marker；1：pCzn1-Vg質粒雙酶切pCzn1-Vg ingested by Nde I/Xba I

M：蛋白marker Protein marker；1：未經(jīng)誘導 pCzn1-Vg表達產(chǎn)物The expression product of pCzn1-Vg without inducing；2：pCzn1-Vg 誘導后表達產(chǎn)物induced expression product of pCzn1-Vg；3：誘導表達產(chǎn)物上清液the precipitate induced by IPTG；4：誘導表達產(chǎn)物沉淀The supernatant induced by IPTG

2.4.2 誘導溫度 在0.6 mmol·L-1的最適IPTG 濃度下，隨著誘導溫度的升高，沉淀蛋白的表達量在25℃時有明顯提高（圖5）。25℃以后，隨著溫度升高，蛋白表達量無明顯變化，且雜蛋白量增多。

M：蛋白Marker Protein Marker；1—6：IPTG 濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mmol·L-1時，pCzn1-Vg 轉化菌誘導后破菌沉淀Precipitates of pCzn1-Vg induced by IPTG at the concentration of 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 and 1.0 mmol·L-1, respectively

M：蛋白Marker Protein Marker；1—4：加入 0.6 mmol·L-1 IPTG分別在20、25、30和35℃時誘導，pCzn1-Vg轉化菌誘導后破菌沉淀Precipitate of pCzn1-Vg by induction with 0.6 mmol·L-1 IPTG at 20, 25, 30, and 35℃

2.5 Vg重組蛋白的純化檢測

Vg包涵體蛋白經(jīng)過變復性的方式，重溶目標蛋白，通過Ni柱樹脂親和純化獲得目標蛋白，進行12% SDS-PAGE 分析，用Ni-IDA緩沖液洗脫，可獲得一條約為 80 kD 的清晰的特異性蛋白條帶（圖6）。

M：蛋白Marker Protein Marker；1：Vg包涵體蛋白Precipitate from pCzn1-Vg；2：純化后的 Vg 重組蛋白Purified Vg recombinant protein

2.6 Vg多克隆抗體效價的測定

新西蘭白兔經(jīng)4次免疫后，用間接ELISA法檢測Vg多克隆抗體的效價。Vg多克隆抗體和陰性血清（免疫前健康兔血清）按 500×20（500）至 500×210（512 000）連續(xù)倍比稀釋，結果表明，當Vg抗體稀釋512 000 倍時，OD陽性/OD陰性＞2.0，其終效價可達 1﹕512 000。

2.7 多克隆抗體檢測甜菜夜蛾不同發(fā)育階段血淋巴中Vg的含量

分別取化蛹 1—6 d的雌蛹以及剛羽化，羽化 12、24、48、60、72 h的甜菜夜蛾成蟲血淋巴樣品，用Western blot檢測Vg蛋白在甜菜夜蛾不同發(fā)育階段血淋巴中的表達差異（圖7）。其雜交出的單一條帶在180 kD左右。Western blot檢測結果顯示Vg僅在甜菜夜蛾雌蟲中表達，從蛹末期開始微弱表達。成蟲羽化后血淋巴中Vg表達量先升高后降低，呈動態(tài)變化，到羽化 48 h表達量最高，隨后降低。

3 討論

昆蟲Vg是由 6—7 kb的mRNA編碼，首先形成分子量約為200 kD的前體蛋白，然后卵裂位點將其分裂成 40—60和140—190 kD大小兩種亞基，亞基經(jīng)聚合、修飾后形成Vg[23]。在前期研究中，通過對甜菜夜蛾序列的分析，總長5 694 bp，編碼1 761個氨基酸，總分子量為200 kD左右，預測蛋白水解酶在卵裂位點RTLR將其分解成大小兩個亞基（141和58 kD）。本研究用于原核表達的肽鏈vitellogenin-N區(qū)是一個脂蛋白結構域，主要用于運輸脂質[24]，表達的Vg重組蛋白為80 kD左右，其包含卵裂位點RTLR。理論上用Vg重組蛋白免疫家兔制備的多克隆抗體對Vg大小亞基都有免疫反應，但Western blot結果顯示在雌蟲血淋巴中，只檢測出Vg的一個大亞基（180 kD左右）。有研究表明，在同屬夜蛾科的斜紋夜蛾中，通過分離卵提取物卵黃蛋白制備Vg多克隆抗體對卵與雌性血淋巴進行Western blot分析，也只能檢測出Vg的一個大亞基[14]。因此筆者推測，像一些高等膜翅目昆蟲如日本瘤姬蜂（）[25]一樣，甜菜夜蛾中只有編碼大亞基的部分才有轉錄活性，而編碼小亞基單位的部分缺失或不表達。

M：蛋白marker Protein Marker；1—6：化蛹1-6 d的雌蛹Female pupae from 1st to 6th day；7—12：剛羽化雌成蟲、羽化12、24、48、60、72 h雌成蟲0-, 12-, 24-, 48-, 60-, 72-h-old adults

昆蟲Vg在體內合成具有性別、發(fā)育時期和組織的特異性。在大多數(shù)昆蟲中，脂肪體是Vg合成的唯一場所，然后分泌到血淋巴，被卵母細胞通過卵黃原蛋白受體吸收[7]。在前期的研究中，筆者克隆得到甜菜夜蛾序列，同時明確了僅在雌蟲脂肪體表達，而在中腸、馬氏管、卵巢等組織中不表達。鱗翅目昆蟲Vg合成啟動時間根據(jù)成蟲是否取食的特性在不同類群中存在差異性。本研究測定的甜菜夜蛾Vg蛋白表達動態(tài)結果顯示 Vg在甜菜夜蛾雌蟲蛹末期開始微弱表達，成蟲羽化后Vg表達量先升高后降低，呈動態(tài)變化，到羽化48 h表達量最高，隨后降低。甜菜夜蛾Vg合成和啟動在蛹末期，這與大多數(shù)屬于成蟲補充營養(yǎng)型的蛾類Vg合成和啟動時間一致，如煙草天蛾（）[17]和斜紋夜蛾[15]。而對于成蟲不取食型的蛾類，如同屬于鱗翅目的舞毒蛾[16]，Vg在末齡幼蟲就開始表達。不同蛾類Vg合成啟動時間不同，這可能是由個體內在特有的內分泌系統(tǒng)調控決定的。

在害蟲預測預報中，通過剖解昆蟲的卵巢發(fā)育進度可以預測其田間產(chǎn)卵量。而昆蟲Vg蛋白表達量的變化與卵巢發(fā)育進度緊密相關，這在很多昆蟲如美洲蜚蠊（）[11]、猛蟻（）[26]、草地貪夜蛾（）[27]、斜紋夜蛾[14]中已得到證實。根據(jù)甜菜夜蛾雌蛾的卵巢形態(tài)和結構變化，將其卵巢發(fā)育進度分為5級，即乳白透明期、卵黃沉積期、成熟待產(chǎn)期、產(chǎn)卵盛期、產(chǎn)卵末期[6]。通過對室內甜菜夜蛾種群不同日齡的卵巢組織進行解剖，結果顯示在甜菜夜蛾蛹末期（羽化前2 d）是乳白透明期，卵巢處于萌芽階段，脂肪體量多而飽滿。這一階段本研究測定的Vg蛋白表達動態(tài)結果顯示Vg表達開始啟動，但表達量較弱，與觀察到的卵黃沉積較少，卵巢管基本處于透明狀的現(xiàn)象基本相符。從蛹體發(fā)黑即將要羽化至羽化48 h是卵黃沉積期，這一時期卵巢管伸長，管內卵量急速增加，未成熟的卵粒較多，卵巢發(fā)育所需求的營養(yǎng)物質急劇增加。因此，Vg表達量在蛋白水平上進入快速增長期。羽化48 h之后甜菜夜蛾卵巢進入成熟待產(chǎn)期，進入待產(chǎn)期后，脂肪體明顯變少，卵巢管內有大量成熟的卵存在，而此刻未成熟的卵粒較少，所需求的營養(yǎng)物質減少，Vg蛋白表達量也開始降低。本研究血淋巴中Vg蛋白表達量的趨勢變化與筆者前期對甜菜夜蛾脂肪體組織中表達量的測定結果[21]基本一致。因此，綜合Vg表達動態(tài)及卵巢發(fā)育進度的結果，筆者認為在甜菜夜蛾進入產(chǎn)卵盛期（羽化3—4 d）前，已基本完成了卵黃沉積的主要過程。

甜菜夜蛾寄主范圍廣，食性雜，并具有繁殖能力強、易產(chǎn)生抗藥性、遷飛擴散能力強等特點[28-30]，因而極易猖獗發(fā)生、暴發(fā)成災，現(xiàn)已列入世界性極難治理的重大害蟲范圍。Vg是胚胎發(fā)育營養(yǎng)的主要來源，在昆蟲生殖過程中起重要作用，也是害蟲種群增殖的關鍵因子。用于制備甜菜夜蛾Vg多克隆抗體的抗原有兩種，一種是表達蛋白，另一種為甜菜夜蛾卵提取物即卵黃蛋白。Moon等[14]曾利用甜菜夜蛾的卵提取物制備了Vg抗體，但其特異性效果不好，在目標蛋白附近220 kD的位置有交互免疫性，不利于對Vg的表達動態(tài)進行準確測定。本研究通過原核表達的vitellogenin-N結構區(qū)，制備了高效價，高純度，特異性強的多克隆抗體，并測定了血淋巴中Vg的動態(tài)變化。研究結果一方面可揭示甜菜夜蛾卵黃發(fā)生規(guī)律與卵巢發(fā)育進度及產(chǎn)卵動態(tài)的內在聯(lián)系，對于甜菜夜蛾的監(jiān)測防治具有重要意義；另一方面也可為進一步研究甜菜夜蛾Vg吸收與轉運機制以及生物學功能打下基礎。

4 結論

克隆了甜菜夜蛾的功能區(qū)片段，該基因片段序列長度 2 091 bp，編碼697個氨基酸。同時獲得了原核表達的Vg純化蛋白，明確了蛋白最優(yōu)表達條件（溫度為25℃，IPTG濃度為0.6 mmol·L-1）；制備了甜菜夜蛾Vg多克隆抗體，通過Western blot明確了甜菜夜蛾 Vg 蛋白的表達規(guī)律。

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（責任編輯 岳梅）

Polyclonal antibody preparation ofvitellogeninand its protein expression at different Developmental stages

ZHAO Jing, SUN Yang, TAN YongAn, XIAO LiuBin, JIANG YiPing, BAI LiXin

(Institute of Plant Protection/Key Lab of Food Quality and Safety of Jiangsu Province-State Key Laboratory Breeding Base, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014)

The objective of this study is to prepare the polyclonal antibody ofvitellogenin(Vg), investigate the expression pattern of Vgprotein in female hemolymph ofat different developmental stages, and to provide a basis for studying the function and mechanism of synthesis, transportation and utilization.The fragment ofwas amplified from the cDNA of 24-h-old female adults ofby PCR which included the vitellogenin-N region. The fragment ofwas then inserted into the pMD-19T for sequencing. The nucleic acid sequence and the amino acids encoded by this gene fragment were analyzed by DNAMAN software. The sequencedfragment was inserted into the expression vector pCzn1 byI andI digestion. The recombinant vector pCzn1-Vg was then inserted intoArcticExpress. TheArcticExpress expressing the Vg recombinant protein was collected and crushed by ultrasonic. The supernatant and the precipitate were collected, respectively, and SDS-PAGE was used to analyze the expression of the recombinant protein. The recombinant Vg protein was expressed at different temperatures and concentrations of IPTG and the optimized expression condition was achieved. The recombinant protein was purified by Ni-NTA agarose. The purified recombinant protein was used to produce polyclonal antibody via immunizing rabbit. The titer of rabbit anti-Vg antiserum was evaluated by indirect ELISA. The content of Vg in female hemolymph ofat different developmental stages was detected by Western blot.The length of the fragment ofis 2 091 bp, encoding 697 amino acids. The predicted molecular weight of Vg recombinant protein is 80.88 kD. The molecular weight of Vg recombinant protein expressed inis 80 kD, which is consistent with the predicted molecular weight. It was mainly expressed in inclusion body rather than the supernatant. The results of Vg recombinant protein content expressed at different temperatures and concentrations of IPTG showed that it was highly expressed at inducing temperature of 25℃ with 0.6 mmol·L-1IPTG. It had no obvious effect on boosting the Vg recombinant protein level and other protein content increased by raising temperature and the concentration of IPTG. After immunizing New Zealand white rabbits with four times, the ELISA assay showed that the rabbit anti-Vg antiserum had a good sensitivity with the titer 1﹕512 000.The Vg content in female hemolymph ofat different developmental stages was detected by Western blot. A single Vg band of approximately 180 kD was detected. Vg was first expressed at late stage of female pupa and showed a low expression level. After female adult eclosion, Vg expression was in a dynamic balance which peaked in 48-h-old female adults, then decreased.The Vg recombinant protein was successfully purified and the optimized expression condition (temperature of 25℃ with 0.6 mmol·L-1IPTG) is clearly defined. The polyclonal antibody of Vg protein with high titer was obtained and the expression pattern of Vg inis explicit.

; vitellogenin gene; prokaryotic expression; polyclonal antibody; expression pattern

2017-06-06；

國家重點研發(fā)計劃（6111661）、國家現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-18-16）、江蘇省農業(yè)科學院院基金計劃（6111612）、國家公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201303028）、江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地自主研究課題（3201632）

接受日期：2017-09-01

聯(lián)系方式：趙靜，E-mail：jingzhao0126@126.com。通信作者肖留斌，E-mail：xlbwll@sohu.com