呂穎 ，盧建華 ，呂卓 ，段媛媛 ，劉志權(quán) ，崔美蘭 ，閆會(huì)敏

（河北省石家莊市第五醫(yī)院 1.臨床醫(yī)學(xué)研究中心，2.檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050021；3.河北醫(yī)科大學(xué) 研究生學(xué)院，河北 石家莊 050017）

髓系抑制性細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中的作用*

呂穎1，盧建華2，呂卓3，段媛媛3，劉志權(quán)2，崔美蘭1，閆會(huì)敏1

（河北省石家莊市第五醫(yī)院 1.臨床醫(yī)學(xué)研究中心，2.檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050021；3.河北醫(yī)科大學(xué) 研究生學(xué)院，河北 石家莊 050017）

目的探討髓系抑制性細(xì)胞（MDSC）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用。方法使用5%右旋葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液復(fù)制小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，每日觀察小鼠體重和大便狀況。DSS處理3和7 d后處死小鼠，蘇木精-伊紅染色法觀察病理組織學(xué)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中MDSC和Treg細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果模型組小鼠于造模第4天體重開(kāi)始下降，有腹瀉和血便，HE染色結(jié)果顯示小鼠結(jié)腸出現(xiàn)黏膜損傷及炎癥表現(xiàn)。與對(duì)照組和造模3 d組比較，造模7 d組腸系膜淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞比例增加，而MDSC比例降低；進(jìn)一步觀察MDSC亞群變化發(fā)現(xiàn)，粒細(xì)胞型MDSC在造模7 d組中比例下降，而單核細(xì)胞型MDSC則無(wú)改變。無(wú)論Treg細(xì)胞還是MDSC，脾臟中的水平3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論急性潰瘍性結(jié)腸炎可導(dǎo)致MDSC降低和Treg細(xì)胞增高，可能與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

潰瘍性結(jié)腸炎；髓系抑制性細(xì)胞；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；免疫調(diào)控

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種臨床常見(jiàn)的難治性腸道疾病，因慢性遷延不愈，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量。雖然UC的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但普遍認(rèn)為免疫紊亂，特別是效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的過(guò)度激活是導(dǎo)致UC發(fā)病的重要原因之一[1]。正常狀態(tài)下，機(jī)體存在著許多具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞，該細(xì)胞可抑制免疫應(yīng)答，在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）和調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是目前已知的兩類重要免疫抑制細(xì)胞，MDSC由一群未成熟的高度異質(zhì)性細(xì)胞組成，具有廣泛且強(qiáng)大的抑制功能，可抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，下調(diào)炎癥因子產(chǎn)生[2-3]；而Treg細(xì)胞是一群成熟的T細(xì)胞亞群，是機(jī)體負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及維持免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，可通過(guò)細(xì)胞間相互作用及分泌IL-10等抗炎癥因子抑制多種細(xì)胞的活性[4]。

MDSC和Treg細(xì)胞作為機(jī)體免疫調(diào)控的重要細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)免疫抑制、參與介導(dǎo)免疫耐受，因此，推測(cè)UC的發(fā)生、發(fā)展可能與MDSC和Treg細(xì)胞的異常表達(dá)有關(guān)。本研究在建立小鼠急性UC模型的基礎(chǔ)上，檢測(cè)不同階段小鼠脾臟和淋巴結(jié)中MDSC和Treg細(xì)胞的比例，以探討MDSC和Treg細(xì)胞在UC發(fā)生發(fā)展中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

清潔級(jí)BALB/c小鼠[購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（冀）2013-1-003],右旋葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfact sodium，DSS）（購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司），小鼠 FITC-CD4、PE-CD25、PE/Cy7-CD127、FITC-CD11b、APC-Ly6G 和 PerCPCy5.5-Ly6C抗體（購(gòu)自美國(guó)BD公司），紅細(xì)胞裂解液（購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司），F(xiàn)ACS Canto II流式細(xì)胞儀（購(gòu)自美國(guó)BD公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 復(fù)制小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型 選取健康BALB/c小鼠20只，鼠齡6～8周，體重18～22 g。將小鼠隨機(jī)分為3組：①對(duì)照組（n=6）；②造模3 d組（n=7）；③造模7 d組（n=8）。其中，造模組小鼠分別自由飲用5%DSS溶液3和7 d，以誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎，對(duì)照組小鼠給予蒸餾水自由飲用。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前及開(kāi)始后每日稱重、觀察大便性狀和有無(wú)便血。造模結(jié)束后處死小鼠，測(cè)量大腸長(zhǎng)度，并取結(jié)腸進(jìn)行HE染色，分離脾臟及腸系膜淋巴結(jié)制備單細(xì)胞懸液。

1.2.2 疾病活動(dòng)指數(shù) 根據(jù)小鼠體重下降程度、大便性狀和便血情況，計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分。見(jiàn)表 1。

表1 小鼠結(jié)腸炎DAI評(píng)估表

1.2.3 病理組織學(xué)觀察 處死小鼠后，取結(jié)腸組織固定于10%中性甲醛緩沖液，常規(guī)石蠟包埋、切片后進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，光鏡下觀察病理改變。

1.2.4 脾臟和淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液的制備 取出脾臟和腸系膜淋巴結(jié)，去除周圍脂肪組織，用注射器活塞芯桿的平端在小培養(yǎng)皿中輕輕研磨，過(guò)200目細(xì)胞篩過(guò)濾，1 500 r/min離心后棄上清，紅細(xì)胞裂解液將脾臟中紅細(xì)胞破除。洗滌2次，重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/ml。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MDSC和Treg細(xì)胞 取100 μl待測(cè)細(xì)胞，加至相應(yīng)的流式管，再加入下述熒光素標(biāo)記的抗體：Treg細(xì)胞：小鼠FITC-CD4，PECD25，PE/Cy7-CD127 或 MDSC：FITC-CD11b，APCLy6G，PerCP-Cy5.5-Ly6C抗體。避光孵育20～30min后，離心洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MDSC和Treg細(xì)胞所占比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重變化和DAI評(píng)分

對(duì)照組和造模3 d組小鼠飲食量及活動(dòng)狀態(tài)無(wú)明顯改變，未見(jiàn)便血，造模7 d組小鼠在造模第4天開(kāi)始逐漸出現(xiàn)大便松軟或稀糊狀及不同程度的血便。體重相對(duì)變化（體重/原始體重×100%）結(jié)果顯示，對(duì)照組體重逐漸增加，造模3 d組未見(jiàn)改變，而造模7 d組自第4天開(kāi)始體重逐漸下降，實(shí)驗(yàn)第6天和第7天低于對(duì)照組和造模3 d組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)第7日，造模7 d組DAI評(píng)分高于造模3 d組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），大腸長(zhǎng)度短于造模3 d組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.016和0.016）。見(jiàn)圖1和表2。

圖1 各組小鼠體重變化比較

表2 各組小鼠終末結(jié)腸長(zhǎng)度和DAI評(píng)分比較 （±s）

表2 各組小鼠終末結(jié)腸長(zhǎng)度和DAI評(píng)分比較 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與造模 3 d 組比較，P ＜0.05

組別 結(jié)腸長(zhǎng)度/cm DAI評(píng)分對(duì)照組 7.65±0.62 0造模 3 d 組 7.61±0.86 2.86±1.071）造模 7 d 組 6.70±0.481）2） 10.25±1.671）2）F值 4.903 137.341 P值 0.020 0.000

2.2 結(jié)腸組織病理學(xué)變化

對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，腺體排列基本整齊，固有層和黏膜層內(nèi)只有少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；經(jīng)DSS誘導(dǎo)3 d后，結(jié)腸黏膜腺體排列稍顯紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多；至第7天，結(jié)腸固有腺體減少或缺失，可見(jiàn)潰瘍，杯狀細(xì)胞減少，黏膜組織出現(xiàn)彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖2。

2.3 各組小鼠脾臟和淋巴結(jié)中MDSC細(xì)胞的表達(dá)

與對(duì)照組比較，造模3 d組小鼠腸系膜淋巴結(jié)中MDSC百分?jǐn)?shù)有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.075），造模7 d組腸系膜淋巴結(jié)中MDSC百分?jǐn)?shù)較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015）；進(jìn)一步觀察單核細(xì)胞樣MDSC亞群（M-MDSC）和粒細(xì)胞樣MDSC亞群（G-MDSC）的比例發(fā)現(xiàn)，造模7 d組G-MDSC百分?jǐn)?shù)較對(duì)照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007）。脾臟MDSC及各亞群比例在3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化 （×200）

表3 各組小鼠脾臟和淋巴結(jié)中MDSC細(xì)胞的表達(dá) （%，±s）

表3 各組小鼠脾臟和淋巴結(jié)中MDSC細(xì)胞的表達(dá) （%，±s）

注：?與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別 脾臟淋巴結(jié)MDSC M-MDSC MDSC M-MDSC G-MDSC對(duì)照組 1.93±0.56 1.00±0.15 0.93±0.42 0.73±0.31 0.40±0.23 0.33±0.08造模 3 d 組 1.77±0.32 0.99±0.16 0.77±0.23 0.53±0.12 0.25±0.07 0.28±0.07造模7 d組 2.23±1.30 1.19±0.67 1.04±0.64 0.45±0.06? 0.22±0.03 0.22±0.04?F值 0.586 0.530 0.654 3.875 3.094 4.768 P值 0.567 0.597 0.531 0.042 0.073 0.024 G-MDSC

2.4 各組小鼠脾臟和淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞的表達(dá)

與對(duì)照組和造模3 d組比較，造模7 d組小鼠腸系膜淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞百分率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003和0.002）。脾臟Treg細(xì)胞百分率在3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.426）。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠脾臟和淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞的表達(dá)（%，±s）

表4 各組小鼠脾臟和淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞的表達(dá)（%，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與造模 3 d組比較，P ＜0.05

組別 脾臟 淋巴結(jié)對(duì)照組 7.98±1.77 8.28±0.38造模3 d組 8.60±0.57 8.12±1.19造模 7 d 組 7.72±1.35 10.55±1.931）2）F值 0.892 8.101 P值 0.426 0.003

3 討論

雖然UC的發(fā)病機(jī)制仍不明確，但免疫紊亂被認(rèn)為是疾病發(fā)生的重要原因之一，多種免疫學(xué)因素與UC發(fā)病密切相關(guān)，近年抑制性細(xì)胞在UC發(fā)病中的作用引起廣泛關(guān)注。MDSC作為獨(dú)特的抑制性細(xì)胞群體，可通過(guò)多種機(jī)制負(fù)性調(diào)控免疫應(yīng)答，在腫瘤、炎癥和感染等多種疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌、肝癌和乳腺癌等許多腫瘤組織中存在大量MDSC浸潤(rùn)，參與腫瘤的免疫逃逸、免疫耐受等；在肝臟疾病如急性肝損傷、病毒性肝炎和肝纖維化等發(fā)病過(guò)程中，MDSC數(shù)量增多且抑制功能增強(qiáng)[5-6]。本研究結(jié)果顯示，隨著炎癥進(jìn)展，小鼠淋巴結(jié)中MDSC表達(dá)逐漸減少，提示MDSC與UC發(fā)病呈負(fù)相關(guān)。MDSC具有免疫抑制功能，因此，筆者推測(cè)急性腸道炎癥發(fā)生可能導(dǎo)致MDSC細(xì)胞數(shù)量減少及功能異常，使效應(yīng)性T細(xì)胞的過(guò)度活化，黏膜炎癥加重。

小鼠MDSC主要表達(dá)CD11b和Gr-1，根據(jù)Gr-1表位不同，可進(jìn)一步將MDSC分為單核細(xì)胞樣MDSC亞群和粒細(xì)胞樣MDSC亞群，2種亞群在特征、抑制功能和機(jī)制等方面均存在很大差異，其中，M-MDSC表達(dá)CD11b+Ly6G+Ly6C+，在形態(tài)上類似于單核/巨噬細(xì)胞，主要通過(guò)上調(diào)誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶、精氨酸酶以及免疫抑制因子發(fā)揮抑制作用；G-MDSC表達(dá)CD11b+Ly6G+Ly6C-，形態(tài)上類似于粒系細(xì)胞，主要通過(guò)產(chǎn)生活性氧化物及與T細(xì)胞直接接觸發(fā)揮作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，不同疾病對(duì)MDSC亞群的影響不同，YOUN等[8]觀察MDSC亞群在多種荷瘤小鼠中的變化，結(jié)果顯示所有腫瘤小鼠中均存在G-MDSC高表達(dá)，而M-MDSC僅在少數(shù)模型小鼠中增高；HOCHST等[9]發(fā)現(xiàn)，在炎癥及纖維化發(fā)生過(guò)程中，肝臟內(nèi)發(fā)生大量M-MDSC聚集，而腎臟內(nèi)的優(yōu)勢(shì)亞型則是G-MDSC。筆者觀察2個(gè)亞群在UC小鼠的表達(dá)情況，結(jié)果顯示隨著炎癥的進(jìn)展，淋巴結(jié)中G-MDSC減少，而M-MDSC無(wú)變化，提示在UC發(fā)病過(guò)程中，G-MDSC可能發(fā)揮著更重要的作用。

Treg細(xì)胞是機(jī)體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的主要效應(yīng)細(xì)胞，可通過(guò)細(xì)胞間直接接觸及分泌抑制性細(xì)胞因子等調(diào)控免疫反應(yīng)，維持免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)。Treg細(xì)胞在控制腸道炎癥中發(fā)揮著重要作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均已證實(shí)Treg細(xì)胞數(shù)量或功能異常與UC發(fā)病密切相關(guān)，外源性輸注Treg細(xì)胞能通過(guò)抑制免疫應(yīng)答而控制UC病情進(jìn)展[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，UC小鼠淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞的比例增高，與以前文獻(xiàn)報(bào)道相一致[12]。目前Treg細(xì)胞增高的原因尚不清楚，可能與機(jī)體免疫平衡調(diào)節(jié)有關(guān)，當(dāng)UC發(fā)生時(shí)，活性CD4+T細(xì)胞亞群（如Th1、Th17等）細(xì)胞升高，為了維持機(jī)體免疫平衡，Treg細(xì)胞也反應(yīng)性升高，但這些細(xì)胞數(shù)量的增加不足以抑制Th1、Th17等細(xì)胞引起的促炎反應(yīng)；另外，增高的Treg細(xì)胞可能存在功能缺陷，因此在UC進(jìn)展過(guò)程中，雖然Treg細(xì)胞數(shù)量增多，但黏膜局部仍出現(xiàn)炎癥表現(xiàn)。作為機(jī)體內(nèi)2種重要的抑制性細(xì)胞，MDSC與Treg細(xì)胞間存在著密切聯(lián)系，MDSC可通過(guò)產(chǎn)生TGF-β、IL-10或精氨酸酶誘導(dǎo)Treg細(xì)胞，同時(shí)MDSC還具有將耐受原攝取并提呈給Treg細(xì)胞，促進(jìn)Treg擴(kuò)增的能力[13-14]；反之，Treg細(xì)胞能夠通過(guò)產(chǎn)生TGF-β調(diào)控MDSC的分化和功能[15]，提示MDSC和Treg細(xì)胞變化可能具有相關(guān)性。然而本研究結(jié)果顯示，在急性UC發(fā)生過(guò)程中MDSC比例逐漸降低，而Treg比例增高，兩者變化趨勢(shì)并不一致，由此可見(jiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎小鼠Treg細(xì)胞增加并非MDSC誘導(dǎo)所致，其具體機(jī)制有必要進(jìn)一步研究和證實(shí)。

綜上所述，在UC發(fā)病過(guò)程中，淋巴結(jié)MDSC比例下降，而Treg細(xì)胞比例升高，提示兩者均與UC發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如能調(diào)控MDSC和Treg細(xì)胞的分化和功能，則可能影響UC的疾病進(jìn)展。本結(jié)果為進(jìn)一步揭示UC的免疫發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床治療UC提供了新的靶點(diǎn)。

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（王榮兵 編輯）

Role of myeloid-derived suppressor cells and regulatory T cells in mouse models of ulcerative colitis*

Ying Lv1,Jian-hua Lu2,Zhuo Lv3,Yuan-yuan Duan3,Zhi-quan Liu2,Mei-lan Cui1,Hui-min Yan1
(1.Clinical Research Center,2.Department of Laboratory Medicine,Shijiazhuang Fifth Hospital,Shijiazhuang,Hebei 050021,China;3.Hebei Medical University Graduate School,Shijiazhuang,Hebei 050017,China)

ObjectiveTo investigate the role of myeloid-derived suppressor cells(MDSC)and regulatory T(Treg)cells in development of ulcerative colitis.MethodsMouse models of ulcerative colitis were established with administration of 5%dextran sodium sulfate(DSS).Body weight and hematochezia were obtained daily.Mice were sacrificed 3 or 7 days post insult.Histological assessment of ulcerative colitis was graded with hematoxylin-eosin staining.The percentages of MDSC and Treg cells in the spleen and mesenteric lymph nodes were measured by flow cytometry.ResultsIn animals treated with DSS,body weight loss,diarrhea and hematochezia were observed on the 4th day.Histological analysis revealed colonic mucosa damage and manifestation of inflammation.The amount of Treg cells was increased,whereas the amount of MDSC was decreased significantly in mesenteric lymph nodes in 7-day model group(P＜0.05).Further observation on the subsets of MDSC suggested that the percentage of granulocyte-like MDSC decreased in the 7-day model group (P＜0.05)while no significant change of monocyte-like MDSC was observed among all the groups.There was no significant difference in the amount of Treg cells or MDSC in spleen among three groups.ConclusionAcute ulcerative colitis experiences decreased MDSC and increased Treg cells,which could contribute to the development of ulcerative colitis.

ulcerative colitis;myeloid-derived suppressor cell;regulatory T cell

R392.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.27.004

1005-8982（2017）27-0017-05

2017-04-30

河北省自然科學(xué)基金（No：H2015106081）；河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題計(jì)劃項(xiàng)目（No：20150893）

閆會(huì)敏，E-mail：yanhm2538@163.com；Tel：0311-89109031