吳相佚，劉斯，宋馨然，李天歌，姜巖世，毛學(xué)英*

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083) 2(西藏高原之寶牦牛乳業(yè)股份有限公司，西藏 拉薩，850000)

牦牛乳酪蛋白酶解物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷HepG2細(xì)胞蛋白羰基含量及抗氧化酶活性的影響

吳相佚1，劉斯1，宋馨然1，李天歌1，姜巖世2，毛學(xué)英1*

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083) 2(西藏高原之寶牦牛乳業(yè)股份有限公司，西藏 拉薩，850000)

為探究牦牛乳酪蛋白酶解物緩解氧化應(yīng)激損傷的作用，利用過(guò)氧化氫(H2O2)建立氧化損傷細(xì)胞模型，以細(xì)胞蛋白質(zhì)羰基含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)的活性為指標(biāo)評(píng)價(jià)牦牛乳酪蛋白酶解物的活性。結(jié)果表明，利用酶解物處理H2O2損傷的HepG2細(xì)胞，能夠緩解H2O2誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)羰基含量升高，并增加細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px的活性，從而提高機(jī)體抗氧化能力，緩解H2O2引發(fā)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。研究證明，牦牛乳酪蛋白酶解物具有緩解氧化應(yīng)激損傷的作用，為牦牛乳資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用及乳源活性肽應(yīng)用于抗氧化功能食品提供了依據(jù)。

牦牛乳酪蛋白酶解物；氧化損傷；抗氧化酶

由于細(xì)胞呼吸和能量代謝，人體內(nèi)時(shí)刻發(fā)生著有氧氧化，在細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧分子(reactive oxygen species, ROS)，如超氧陰離子和羥自由基。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外環(huán)境的刺激后，ROS增多，從而破壞了機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激[1]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致機(jī)體衰老和與衰老相關(guān)疾病的根本原因，并能夠引發(fā)多種疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等[2]。因此，對(duì)氧化應(yīng)激的防治成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。

牦牛乳具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分以及無(wú)污染、純天然等優(yōu)點(diǎn)，具有巨大的生產(chǎn)潛力和廣闊的發(fā)展空間。然而，牦牛乳資源并未得到充分的開(kāi)發(fā)利用，其中60%的乳及乳制品用于當(dāng)?shù)啬撩裣M(fèi)，牧民將其加工成“酥油、糌粑、曲拉” 等特色乳制品，產(chǎn)品附加值低[3-4]。牦牛乳中約80%的蛋白質(zhì)是酪蛋白，利用商業(yè)化蛋白酶酶解牦牛乳酪蛋白，可以得到多種活性生物肽，如阿片肽、酪啡肽、免疫調(diào)節(jié)肽、抗氧化肽等[5-8]，從而增加牦牛乳酪蛋白的附加產(chǎn)值。

目前關(guān)于酪蛋白及其酶解物抗氧化活性的研究?jī)H限于其體外清除自由基能力的評(píng)價(jià)，利用細(xì)胞模型研究關(guān)于酪蛋白及其酶解物對(duì)氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以牦牛乳酪蛋白為研究對(duì)象，探討其酶解物對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，為研究乳源性生物活性肽在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)方面的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

HepG2(人肝癌細(xì)胞)，購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)院；牦牛乳酪蛋白(西藏高原之寶牦牛乳業(yè)股份有限公司)；MEM高糖培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(Bioin)；青鏈霉素雙抗溶液(100×)、非必須氨基酸(100×)、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)(Gbico)；木瓜蛋白酶(P3250-25G，Sigma)、MTT(0793-1G， Amrecso)、DEPC、DMSO(細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))、BCA蛋白測(cè)定試劑盒(天根生化科技)、SOD、GSH-Px、CAT試劑盒(南京建成生物工程研究所)；DCFH-DA、DNPH(Sigma)。

1.2儀器與設(shè)備

MCO-17AC二氧化碳培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司；SCIENTZ-ⅡD 細(xì)胞超聲破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；iMarkTMMicroplate Reader 酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-rad公司； UV-2600 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞貼壁面積達(dá)到80%～90%時(shí)開(kāi)始傳代，棄去培養(yǎng)基后用1 mL PBS沖洗殘留培養(yǎng)液，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化，結(jié)束后加入2 mL新鮮培養(yǎng)基不斷吹打平皿底壁使細(xì)胞均勻分散重懸，接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 蛋白質(zhì)羰基含量測(cè)定

參考貢慧等[9]的方法。蛋白溶液離心去除上清液，加入1.5 mL 2,4-二硝基苯肼的HCl溶液，25 ℃避光反應(yīng)1 h，每15 min振蕩1次，空白組中加入不含2,4-二硝基苯肼的HCl溶液。反應(yīng)后加入2 mL TCA溶液，于8 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用1 mLV(乙醇)∶V(乙酸乙酯)=1∶1的混合液清洗，8 000 r/min 離心15 min，重復(fù)3 次。清洗結(jié)束后，棄清洗液，加入250 μL 6 mol/L 鹽酸胍溶液振蕩，37 ℃水浴60 min，使蛋白質(zhì)重新溶解。于370 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

1.3.3 細(xì)胞過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后接種，培養(yǎng)24 h后分為：

空白組：正常細(xì)胞；

模型組：細(xì)胞+ H2O2(H2O2濃度為400 μmol/L)；

實(shí)驗(yàn)組：細(xì)胞+ H2O2+0.5 mg/mL樣品；細(xì)胞+ H2O2+1.0 mg/mL樣品；細(xì)胞 + H2O2+2.0 mg/mL樣品(H2O2濃度為400 μmol/L)。

細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，模型組提前加入不同濃度的樣品50 μL 預(yù)孵2 h，取出去除上清液后，再在培養(yǎng)基中加入50 μL H2O2和不同濃度樣品，同其他組繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，超聲破碎細(xì)胞1 min，測(cè)定CAT、SOD和GSH-Px指標(biāo)，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計(jì)分析均采取版本為17.0的SPSS軟件(SPSS Inc., Chicago, 1L)進(jìn)行。當(dāng)多組數(shù)據(jù)間進(jìn)行顯著性分析時(shí)，使用單因素方差分析(one way ANOVA)伴隨Duncan多重比較，當(dāng)plt;0.05認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷所需H2O2濃度的確定

為確定氧化應(yīng)激損傷條件，HepG2細(xì)胞分別用不同濃度的H2O2(50、100、200 、400 、800 μmol/L)處理0、3、6、12 h。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著H2O2濃度增加，HepG2細(xì)胞存活率逐漸降低(如圖1)，呈濃度依賴效應(yīng)。與處理0小時(shí)相比，當(dāng)H2O2濃度為400 μmol/L，HepG2細(xì)胞處理6 h時(shí)，細(xì)胞存活率為(53.91±4.63)%(plt;0.05)；當(dāng)H2O2濃度為800 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率僅為(29.57±1.45)%。說(shuō)明800 μmol/L的H2O2對(duì)細(xì)胞有明顯的毒性作用。出于時(shí)間和效率的考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以400 μmol/L H2O2處理6 h為建模條件，進(jìn)一步探討牦牛乳酪蛋白酶解物對(duì)HepG2的保護(hù)作用。

圖1 H2O2對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of H2O2 on the viability of HepG2 cells

2.2牦牛乳酪蛋白酶解物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞蛋白羰基含量的影響

細(xì)胞氧化損傷可由蛋白質(zhì)羰基含量表征。如圖2所示，與正常對(duì)照組相比，H2O2可顯著誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞蛋白質(zhì)氧化損傷(plt;0.05)，H2O2損傷組細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)羰基含量從(33.54±1.28) nM/mg pro上升到(65.33±2.08) nM/mg pro。而牦牛乳酪蛋白酶解物在H2O2前干預(yù)細(xì)胞顯著抑制了H2O2誘導(dǎo)的蛋白羰基增多；與H2O2損傷組相比，隨著牦牛乳酪蛋白酶解物干預(yù)濃度升高，H2O2損傷的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)羰基含量顯著降低(plt;0.05)，并且呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。結(jié)果表明LAH可以緩解H2O2誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化損傷。

圖2 牦牛乳酪蛋白酶解物對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞蛋白質(zhì)羰基含量的影響Fig.2 Effect of yak milk casein hydrolysates on the protein carbonyl content of H2O2-induced HepG2 cells

2.3牦牛乳酪蛋白酶解物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞CAT活力的影響

過(guò)氧化氫酶(CAT)可催化體內(nèi)氧自由基O2-·歧化反應(yīng)生成的H2O2分解為H2O和O2，從而清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的H2O2，對(duì)機(jī)體有重要的保護(hù)作用[10]。牦牛乳酪蛋白酶解物對(duì)細(xì)胞CAT活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。由表3可以看出，與空白組對(duì)比，模型組CAT活性明顯降低(plt;0.05)；與模型組對(duì)比，牦牛乳酪蛋白酶解物處理的細(xì)胞CAT活性顯著升高(plt;0.05)并呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。

圖3 牦牛乳酪蛋白酶解物對(duì)CAT活性的影響Fig.3 Effect of yak milk casein hydrolysates on the activity of CAT

2.4牦牛乳酪蛋白酶解物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞SOD活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是重要的機(jī)體內(nèi)抗氧化酶之一，SOD通過(guò)清除體內(nèi)過(guò)多的氧自由基延緩機(jī)體衰老、提高機(jī)體免疫力并增強(qiáng)對(duì)疾病的抵抗力[11]。由圖4可知，模型組的SOD活性明顯低于空白組(plt;0.05)；經(jīng)牦牛乳酪蛋白酶解物處理后，細(xì)胞內(nèi)SOD活性明顯高于模型組(plt;0.05)并呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。

圖4 牦牛乳酪蛋白酶解物對(duì)SOD活力的影響Fig.4 Effect of yak milk casein hydrolysates on the activity of SOD

2.5牦牛乳酪蛋白酶解物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞GSH-Px活性的影響

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GSH-Px)是廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，可以清除細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)多的羥自由基和過(guò)氧化物，減輕細(xì)胞膜的過(guò)氧化作用[12]。由圖5可知，與空白組相比，模型組GSH-Px活性明顯降低(plt;0.05)；經(jīng)牦牛乳酪蛋白酶解物處理后細(xì)胞內(nèi)GSH-Px明顯升高(plt;0.05)，且呈濃度依賴效應(yīng)。

圖5 牦牛乳酪蛋白酶解物對(duì)GSH-Px活力的影響Fig.5 Effect of yak milk casein hydrolysates on the activity of GSH-Px

3 討論

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞暴露于高濃度氧分子或氧的化學(xué)衍生物而引起的細(xì)胞損傷，在代謝綜合癥中起著重要作用，它是肥胖、糖尿病、脂質(zhì)沉積、慢性炎癥等發(fā)生、發(fā)展的重要介導(dǎo)因素[13-14]。H2O2是一種重要的活性氧，其本身并不具有自由基的性質(zhì)，但它極易透過(guò)細(xì)胞膜，引發(fā)脂質(zhì)氧化、導(dǎo)致生物大分子損傷，是建立細(xì)胞氧化損傷的常用物質(zhì)之一，廣泛用于成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等細(xì)胞模型中[15]。由于HepG2細(xì)胞具有與人正常肝細(xì)胞相同的功能，并完全表達(dá)肝細(xì)胞中的抗氧化酶及解毒酶，因此在探究外源化學(xué)物及天然抗氧化物質(zhì)的細(xì)胞保護(hù)作用中常作為一種良好的細(xì)胞模型[16]。

越來(lái)越多證據(jù)表明，當(dāng)活性氧的產(chǎn)生過(guò)量時(shí)，其會(huì)超過(guò)SOD、GSH-Px、CAT等保護(hù)性酶的保護(hù)作用，細(xì)胞膜磷脂、細(xì)胞蛋白、DNA和酶的氧化導(dǎo)致細(xì)胞呼吸的中止而引起細(xì)胞的凋亡[17]。乳蛋白是一種常見(jiàn)的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，國(guó)內(nèi)外研究者們已利用酶解、發(fā)酵等方式從酪蛋白和乳清蛋白中提取得到具有抗氧化活性的生物肽。天然乳源性抗氧化肽具有天然、安全、易吸收、副作用小等特點(diǎn)[18]。許多研究已表明體內(nèi)體外條件下不同蛋白酶解物及肽類對(duì)肝臟氧化損傷具有保護(hù)作用，可以提高肝組織及肝細(xì)胞中的抗氧化酶活力，清除過(guò)量ROS的生成，降低脂質(zhì)過(guò)氧化損傷水平[19]。酪蛋白酶解物具有較強(qiáng)的Fe2+螯合能力、羥自由基和ABTS自由基清除能力[17，20-21]，適量的酪蛋白酶解物能夠提高小鼠血漿和肝臟GSH-Px活性及肝臟SOD活性[22]。酪蛋白木瓜蛋白酶酶解物通過(guò)類蛋白反應(yīng)改善后，其產(chǎn)物具有更高的DPPH、羥自由基清除能力和還原力，且酶解物能夠?qū)2O2或半乳糖胺所致大鼠肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有顯著改善作用，降低脂質(zhì)過(guò)氧化損傷水平[23]。牛乳酪蛋白堿性蛋白酶酶解物經(jīng)過(guò)濾分級(jí)后得到的低分子量組分能夠通過(guò)增加肝細(xì)胞抗氧化酶活力及改善細(xì)胞凋亡來(lái)緩解H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[24]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥誘導(dǎo)小鼠補(bǔ)充乳源性小肽后，小鼠體內(nèi)肝臟抗氧化酶的酶活顯著提高[25]。此外，乳源活性肽由于氨基酸組成種類不同和順序不同，具有不同的生理活性，如Leu-Leu-Met肽具有免疫調(diào)節(jié)作用，含巰基的肽類還具有抗氧化、捕獲自由基的作用。LI 等[26]從山羊奶酪蛋白酶解物中分離鑒定出5種新型抗氧化肽，其肽段組成分別為Val-Tyr-Pro-Phe，Phe-Gly-Gly-Met-Ala-His，Phe-Pro-Tyr-Cys-Ala-Pro，Tyr-Val-Pro-Glu-Pro-Phe，Tyr-Pro-Pro-Tyr-Glu-Thr-Tyr，具有良好的自由基清除能力、Fe2+結(jié)合能力及降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平的能力。由此可知，酪蛋白源活性肽具有平衡細(xì)胞內(nèi)自由基生成及緩解氧化損傷的能力[27-28]?；诖私Y(jié)論，我們進(jìn)一步采用細(xì)胞模型的生物評(píng)價(jià)方法，利用H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷來(lái)評(píng)價(jià)牦牛乳酪蛋白酶解物緩解肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的活性。

本研究結(jié)果顯示，牦牛乳酪蛋白酶解物可以緩解H2O2所致的細(xì)胞存活率下降和細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的降低，這可能是由于酪蛋白糖巨肽經(jīng)酶解后，產(chǎn)生許多短肽，這些短肽的抗氧化作用大量淬滅了H2O2在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)代謝產(chǎn)生的氧自由基，阻止了自由基對(duì)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，保護(hù)了細(xì)胞膜的同時(shí)，胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)可能也因此受到保護(hù)。

綜上所述，本部分研究表明，牦牛乳酪蛋白酶解物可通過(guò)增加細(xì)胞存活率、緩解蛋白質(zhì)氧化損傷，顯著抑制H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞的損害，緩解H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞活性的降低，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究證明牦牛乳酪蛋白酶解物具有良好的抗氧化活性。利用0.5～2.0 mg/mL 牦牛乳酪蛋白酶解物孵育細(xì)胞能夠顯著減輕蛋白質(zhì)氧化損傷水平和抗氧化酶降低程度，從而發(fā)揮對(duì)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，為研究乳源性生物活性肽對(duì)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)方面的應(yīng)用提供參考。

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EffectofyakmilkcaseinhydrolysatesonproteincarbonylcontentandactivityofantioxidantenzymesofoxidativedamagedHepG2cellsinducedbyH2O2

WU Xiang-yi1, LIU Si1, SONG Xin-ran1, LI Tian-ge1, JIANG Yan-shi2, MAO Xue-ying1*

1(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China) 2(Treasure of Plateau Yak Dairy Co.,Ltd, Lhasa 850000, China )

To evaluate the antioxidative activity of yak milk casein hydrolysatesinvitro, HepG2 cells were treated with H2O2to establish the oxidative model. The protein carbonyl content and the activity of SOD, GSH-Px and CAT of HepG2 cells pretreated with yak milk casein hydrolysates were measured to analyze the antioxidative activity of yak milk casein hydrolysates. The results showed that pretreatment with yak milk casein hydrolysates significantly alleviated the increase of protein carbonyl content induced by H2O2and increased the activity of SOD, CAT and GSH-Px, suggesting the antioxidative capacity of yak milk casein hydrolysates in vitro. The results suggested that yak milk casein hydrolysates possessed protective effects against H2O2-induced oxidative damage in HepG2 cells, which provided a basis for the further utilization of yak milk resources and for the application of the bioactive peptides as antioxidant functional foods.

yak milk casein hydrolysates; oxidative damage; antioxidant enzyme

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015087

本科(毛學(xué)英教授為通訊作者,E-mail：maoxueying@cau.edu.cn)。

國(guó)家大學(xué)生科研創(chuàng)新項(xiàng)目計(jì)劃；北京市奶牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(BAIC06-2017)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31371753)

2017-07-03，改回日期：2017-08-03